1 拼音
bǎi rì ké jūn miáo yuán yè
2 注解
[1]本品系用百日咳第Ⅰ相菌种经培育后取菌体制成悬液，加适当杀菌剂，以磷酸盐缓冲生理盐水稀释制成，每ml含菌45亿～90亿。用于制备百日咳菌苗、白喉、破伤风类毒素混合制剂。
3 百日咳菌苗原液制造及检定要求
3.1 菌种
1.1 制造百日咳菌苗之菌种、检定用的Ⅰ相诊断血清、百日咳分型血清及百日咳参考菌苗，由中国药品生物制品检定所分发或经同意。
1.2 菌种检定
1.2.1 培养特性
于包-姜（Bordet-Gengou）氏或其他适宜的培养基上培育，各菌株应具有典型的形态及生化特性。
1.2.2 血清学特性
将35～37℃培育40～48小时的菌苔，混悬于生理盐水或磷酸盐缓冲生理盐水内，使每ml含菌20亿个，与Ⅰ相血清做定量凝集反应，凝集效价应达到血清原效价之半。同时与单价分型血清做定量凝集反应，其型别应与该菌种标定型别相同。
1.2.3皮肤坏死试验
用健康家兔或豚鼠至少2只，用培育40～48小时的菌苔混悬于磷酸盐缓冲生理盐水内，然后稀释为几个不同浓度的菌液，分别用每一稀释度的菌液注射于家兔或豚鼠的皮内0.1ml，经72小时观察反应。如2只家兔或豚鼠中有1只注射0.4亿个菌以下的菌液部位出现出血性坏死者为阳性反应，判为合格。
1.2.4 毒力试验
用体重16～18g之小白鼠至少3组，每组至少10只，在麻醉状态下从鼻腔滴入经培育40～48小时，以磷酸盐缓冲生理盐水稀释的菌液0.05ml观察14天，记录小白鼠生死情况，按Reed Muench法计算LD50，LD50菌数不超过1.2亿判为合格。
1.2.5 免疫力试验
1.2.5.1 方法
按附录2《百日咳菌苗原液免疫力试验方法》进行。
1.2.5.2判定
试验菌液每个接种剂量的免疫效价应不少于4.0IU。若试验菌液的效价低于此要求时，可复试，其结果的几何平均值（如用概率分析法时，应用加权几何平均值）≥4.0IU，仍判为合格。
1.3 菌种保存
1.3.1 菌种应用冻干法保存。
1.3.2 冻干菌种应保存在2～8℃。冻干后抽样按1.2项进行检查，合格的菌种可使用2年，以后每年检查1次，如仍合格可继续使用1年。
3.2 制造
2.1 制造百日咳菌苗原液至少应选用2个菌株，制成的菌苗应含1、2、3型因子。
2.2 制造百日咳菌苗原液用活性炭半综合培养基或其他适宜的培养基。如用液体培养基，不得含有已知引起人体毒性或变态反应的成分。
2.3 原液制造
2.3.1 菌种
冻干菌种启开后接种于改良包-姜氏或活性炭半综合培养基或其他适宜的培养基上。于35～37℃培育不超过72小时，以后各代不超过48小时，传代菌种保存不得超过14天，冻干菌种启开后用于生产时不应超过10代。
2.3.2 培育
可用固体法或液体法培育。培育时间不得超过48小时，经检查为纯菌后，用适当方法收集菌体，混悬于pH值为7.0～7.4的磷酸盐缓冲生理盐水中。
2.3.3 杀菌
原液可用不超过0.1%（ml /ml）甲醛溶液杀菌，放37℃2～3天。亦可用其他适宜的杀菌剂和杀菌方法杀菌。
2.3.4纯菌试验
原液应逐瓶（罐）抽样接种普通琼脂斜面及普通血液琼脂斜面（或活性炭半综合培养基）各1管，放35～37℃培育2天，然后放24～26℃1天。有杂菌生长者应废弃。
2.3.5 原液合并
固体法工艺生产经纯菌试验合格的原液应进行合并。不同菌株不同日期制造2的原液应分别合并。合并后，可加适量防腐剂，并保存于2～8℃。
2.4 原液检定
2.4.1 浓度测定
每瓶原液应按中国细菌浊度标准与质量检定部门会同测定浓度。稀释菌苗时即按此浓度计算。
2.4.2 镜检
每瓶原液取样稀释至成品浓度，涂片染色镜检，应为革兰氏阴性球杆菌。至少观察10个视野，应无杂菌。
2.4.3 凝集反应
每瓶原液按1.2.2项与Ⅰ相血清做定量凝集试验，其凝集效价应达血清原效价之半，如仅达到或低于血清原效价1/4时，应作免疫力试验，合格后方可使用；同时应用单价分型血清做定性凝集试验，其所含型别应与制造原液的菌种型别相同。
2.4.4 无菌试验
每瓶原液除按《生物制品无菌试验规程》进行无菌试验外，并做特异无菌试验。如特异无菌试验有百日咳菌生长，可复试一次，若仍有百日咳菌生长，原液应判为不合格。
2.4.5 毒性试验
2.4.5.1方法
按附录3《百日咳菌苗原液毒性试验方法》进行。
2.4.5.2 判定
试验组小白鼠注射后72小时的总体重不少于注射前总体重，第7天小白鼠增加的体重不少于对照组增加体重的60%，并不得有死亡，该批原液毒性试验判为合格。
试验结果达不到上述要求，可复试一次。仍达到不过要求，可将原液放置1.2.5项方法及要求进行。
2.5 原液保存
应保存于2～8℃。原液自采集之日起至成品发出不得少于4个月。原液自采集之日起效期为3年。
4 百日咳菌苗原液免疫力试验方法
4.1 免疫
1.1 动物
选用体重10～12g同性或雌雄性各半的健康NIH小白鼠。
将动物随机分为三组，每组16只或20只（同性或雌雄性各半，为保证攻击后有16只或20只小白鼠，可适当多免疫几只小白鼠），同时饲养健康小白鼠55只，备做对照用。
1.2 免疫原稀释
将百日咳原液用生理盐水或pH7.3±0.1磷酸盐缓冲生理盐水稀释至成品菌苗浓度的1/2，然后再稀释7.5×、37.5×、187.5×，百日咳参考菌苗稀释至每ml含8IU，然后再稀释成每ml含1.0IU（0.125ml）、0.2IU（0.025ml）及0.04IU（0.005ml）。
1.3 免疫方法
将不同稀释度的免疫原分别免疫小白鼠，每只小白鼠各腹腔注射0.5ml。
4.2 攻击菌及攻击菌液的制备
2.1 菌种
小白鼠脑内攻击用58030（18323）菌株。
2.2 培养基
可用包-姜氏培养基（含羊血20%～30%）或其他适宜的培养基。
2.3 培养温度及时间
放35～37℃培育，第一代不超过72小时，攻击时菌种的培育时间为20～24小时。原代菌种放2～8℃可保存2周。
2.4攻击菌液的制备
将培育20～24小时的菌苔经肉眼检查为纯菌后，刮入生理盐水或pH7.3±0.1缓冲生理盐水，用灭菌脱脂棉过滤，测定浓度，然后用pH7.0～7.2水解酷素、蛋白胨水或肉汤稀释成每0.03ml含菌8万，作为试验组的攻击菌液，然后再连续稀释，使每0.03ml分别含8000、800、80及8个菌，以上5个不同稀释度的菌液，作为对照组的攻击菌液。
2.5 工作起止时间
自攻击菌液制备（开始刮菌）至注射完最后1只小白鼠不得超过2.5小时。
2.6活菌计数
在攻击前后，可将0.03ml含8个菌的攻击菌液，接种于包一姜氏培养基或其他适宜的培养基平皿中，每个平皿0.2ml，每次不得少于2个平皿，其菌落形成单位约为浊度测定的1/4。
4.3 攻击
动物免疫后14天，每只小白鼠脑内攻击0.03ml菌液（含8万个菌），用0.25ml注射器，4号针头。在试验组攻击后再进行对照组毒力测定，对照组每稀释度攻击10只小白鼠。
4.4 记录结果
动物攻击后观察14天。攻击后第2天，将试验组动物处理成每组16只或20只。以后逐日观察动物并记录死亡数，最初3天死亡的动物不作统计，至第14天有麻痹、头部肿胀、弓背及明显耸毛的动物按死亡计算。
4.5 结果计算
5.1 按Wilson-Worcester氏法计算参考菌苗及待检菌苗的ED50±SD%，每个ED50标准差的范围一般应为64%～156%。
5.2 按Reed-Muench氏法计算对照组LD50，1个LD50的菌数应不高于800个菌。
5.3 计算均质性因子“α”。
5.4IU计算
待检原液每ml应含IU=参考菌苗ED50/待检原液ED50×参考菌苗每ml的IU数
4.6 效力评价
百日咳原液按成品菌苗尝试稀释后，每个接种剂量的免疫效价应不少于4.0IU。
5 百日咳菌苗原液毒性试验方法
1 选用体重14～16g健康小白鼠，每批原液不少于10只（同性或雌雄性各半）。
2 以灭菌生理盐水或pH7.3±0.1磷酸盐缓冲生理盐水（含成品菌苗相同量的防腐剂），将百日咳原液稀释至成品菌苗浓度的1/2。
3 每只小白鼠腹腔注射稀释的原液0.5ml。另取同数量同体重的小白鼠（同性或雌雄性各半），腹腔注射稀释用生理盐水或pH7.3±0.1磷酸盐缓冲生理盐水0.5ml作为对照。
4 注射后的小白鼠应逐日观察，并于喂食后2小时进行称重。
5 于注射前、注射后72小时及7天，分别称试验组及时对照组小白鼠的体重。
6 试验组小白鼠注射后72小时的总体重不少于注射前的总体重；7天小白鼠平均增加的体重不少于对照组平均增加体重的60%，并不得有死亡，该批原液毒性试验判为合格。
7 试验结果若达不到上述要求，可进行复试，仍达不到上述要求，原液可放置2～8℃保存3～4个月再进行复试，如仍达不到上述要求，该批原液的毒性判为不合格。
6 参考资料
- ^ [1] ．"中国生物制品规程"．