2010年版药典二部附录Ⅶ

目录

1 拼音

2010 nián bǎn yào diǎn èr bù fù lù Ⅶ

《中华人民共和国药典》(2010年版)二部附录Ⅶ

2 附录Ⅶ A 电位滴定法与永停滴定法

电位滴定法与永停滴定法是容量分析中用以确定终点或选择核对指示剂变色域的方法。选用适当的电极系统可以作氧化还原法、中和法(水溶液或非水溶液)、沉淀法、重氮化法或水分测定法第一法等的终点指示。

电位滴定法选用两支不同的电极。一支为指示电极,其电极电位随溶液中被分析成分的离子浓度的变化而变化;另一支为参比电极,其电极电位固定不变。在到达滴定终点时,因被分析成分的离子浓度急剧变化而引起指示电极的电位突减或突增,此转折点称为突跃点。

永停滴定法采用两支相同的铂电极,当在电极间加一低电压(例如50mV)时,若电极在溶液中极化,则在未到滴定终点时,仅有很小或无电流通过;但当到达终点时,滴定液略有过剩,使电极去极化,溶液中即有电流通过,电流计指针突然偏转,不再回复。反之,若电极由去极化变为极化,则电流计指针从有偏转回到零点,也不再变动。

2.1 仪器装置

电位滴定可用电位滴定仪、酸度计或电位差计,永停滴定可用永停滴定仪或按图示装置。

图 永停滴定装置

电流计的灵敏度除另有规定外,测定水分时用10-6A/格,重氮化法用10-9A/格。所用电极可按下表选择。

2.2 滴定法

2.2.1 (1)电位滴定法

将盛有供试品溶液的烧杯置电磁搅拌器上,浸入电极,搅拌,并自滴定管中分次滴加滴定液;开始时可每次加入较多的量,搅拌,记录电位;至将近终点前,则应每次加入少量,搅拌,记录电位;至突跃点已过,仍应继续滴加几次滴定液,并记录电位。

方法

电极系统

说明

水溶液氧化还原法

铂-饱和甘汞

铂电极用加有少量三氯化铁的硝酸或用铬酸清洁液浸洗

水溶液中和法

玻璃-饱和甘汞

非水溶液中和法

玻璃-饱和甘汞

饱和甘汞电极套管内装氯化钾的饱和无水甲醇溶液。玻璃电极用过后应立即清洗并浸在水中保存

水溶液银量法

银-玻璃

银电极可用稀硝酸迅速浸洗

银-硝酸钾盐桥-饱和甘汞

-C≡CH中氢置换法

玻璃-硝酸钾盐桥-饱和甘汞

硝酸汞电位滴定法

铂-汞-硫酸亚汞

铂电极可用10%(g/ml)硫代硫酸钠溶液浸泡后用水清洗。

汞-硫酸亚汞电极可用稀硝酸浸

泡后用水清洗

永停滴定法

铂-铂

铂电极用加有少量三氯化铁的硝酸或用铬酸清洁液浸洗

滴定终点的确定 终点的确定分为作图法和计算法两种。作图法是以指示电极的电位(E)为纵坐标,以滴定液体积(V)为横坐标,绘制滴定曲线,以滴定曲线的陡然上升或下降部分的中点或曲线的拐点为滴定终点。根据实验得到的E值与相应的V值,依次计算一级微商△E/△V(相邻两次的电位差与相应滴定液体积差之比)和二级微商△2E/△V2(相邻△E/△V值间的差与相应滴定液体积差之比)值,将测定值(E,V)和计算值列表。再将计算值△E/△V或△2E/△V2作为纵坐标,以相应的滴定液体积(V)为横坐标作图,一级微商△E/△V的极值和二级微商△2E/△V2等于零(曲线过零)时对应的体积即为滴定终点。前者称为一阶导数法,终点时的滴定液体积也可由计算求得,即△E/△V达极值时前、后两个滴定液体积读数的平均值;后者称为二阶导数法,终点时的滴定液体积也可采用曲线过零前、后两点坐标的线性内插法计算,即:

式中V0为终点时的滴定液体积;

a为曲线过零前的二级微商绝对值;

b为曲线过零后的二级微商绝对值;

V为a点对应的滴定液体积;

△V为由a点至b点所滴加的滴定液体积。

由于二阶导数计算法最准确,所以最为常用。

采用自动电位滴定仪可方便地获得滴定数据或滴定曲线。

如系供终点时指示剂色调的选择或核对,可在滴定前加入指示剂,观察终点前至终点后的颜色变化,以确定该品种在滴定终点时的指示剂颜色。

2.2.2 (2)永停滴定法

用作重氮化法的终点指示时,调节R1使加于电极上的电压约为50mV。取供试品适量,精密称定,置烧杯中,除另有规定外,可加水40ml与盐酸溶液(1→2)15ml,而后置电磁搅拌器上,搅拌使溶解,再加溴化钾2g,插入铂-铂电极后,将滴定管的尖端插入液面下约2/3处,用亚硝酸钠滴定液(0.1mol/L或0.05mol/L)迅速滴定,随滴随搅拌,至近终点时,将滴定管的尖端提出液面,用少量水淋洗尖端,洗液并入溶液中,继续缓缓滴定,至电流计指针突然偏转,并不再回复,即为滴定终点。

用作水分测定法第一法的终点指示时,可调节R1使电流计的初始电流为5~10μA,待滴定到电流突增至50~150μA,并持续数分钟不退回,即为滴定终点。

3 附录Ⅶ B 非水溶液滴定法

非水溶液滴定法是在非水溶剂中进行滴定的方法。主要用来测定有机碱及其氢卤酸盐、磷酸盐、硫酸盐或有机酸盐,以及有机酸的碱金属盐类药物的含量,也用于测定某些有机弱酸的含量。

3.1 非水溶剂的种类

(1)酸性溶剂 有机弱碱在酸性溶剂中可显著地增强其相对碱度,最常用的酸性溶剂为冰醋酸。

(2)碱性溶剂 有机弱酸在碱性溶剂中可显著地增强其相对酸度,最常用的碱性溶剂为二甲基甲酰胺。

(3)两性溶剂 兼有酸、碱两种性能,最常用的为甲醇。

(4)惰性溶剂 这一类溶剂没有酸、碱性,如苯、三氯甲烷等。

3.2 第一法

除另有规定外,精密称取供试品适量[约消耗高氯酸滴定液(0.1mol/L) 8ml],加冰醋酸10~30ml使溶解,加各品种项下规定的指示液1~2滴,用高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定。终点颜色应以电位滴定时的突跃点为准,并将滴定的结果用空白试验校正。

若滴定供试品与标定高氯酸滴定液时的温度差别超过10℃,则应重新标定;若未超过10℃,则可根据下式将高氯酸滴定液的浓度加以校正:

式中0.0011为冰醋酸的膨胀系数;

t0为标定高氯酸滴定液时的温度;

t1为滴定供试品时的温度;

N0为t0时高氯酸滴定液的浓度;

N1为t1时高氯酸滴定液的浓度。

供试品如为氢卤酸盐,应在加入醋酸汞试液3~5ml后,再进行滴定;供试品如为磷酸盐,可以直接滴定;硫酸盐也可直接滴定,但滴定至其成为硫酸氢盐为止;供试品如为硝酸盐时,因硝酸可使指示剂褪色,终点极难观察,遇此情况应以电位滴定法指示终点为宜。

电位滴定时用玻璃电极为指示电极,饱和甘汞电极(玻璃套管内装氯化钾的饱和无水甲醇溶液)为参比电极。

3.3 第二法

除另有规定外,精密称取供试品适量(约消耗碱滴定液(0.1mol/L) 8ml],加各品种项下规定的溶剂使溶解,再加规定的指示液1~2滴,用规定的碱滴定液(0.1mol/L)滴定。终点颜色应以电位滴定时的突跃点为准,并将滴定的结果用空白试验校正。

在滴定过程中,应注意防止溶剂和碱滴定液吸收大气中的二氧化碳和水蒸气,以及滴定液中溶剂的挥发。

电位滴定时所用的电极同第一法。

4 附录Ⅶ C 氧瓶燃烧法

本法系将分子中含有卤素或硫等元素的有机药物在充满氧气的燃烧瓶中进行燃烧,俟燃烧产物被吸入吸收液后,再采用适宜的分析方法来检查或测定卤素或硫等元素的含量。

4.1 仪器装置

燃烧瓶为500ml、1000ml或2000ml磨口、硬质玻璃锥形瓶,瓶塞应严密、空心,底部熔封铂丝一根(直径为1mm),铂丝下端做成网状或螺旋状,长度约为瓶身长度的2/3,如图1。

图1燃烧瓶

4.2 操作法

按各品种项下的规定,精密称取供试品(如为固体,应研细)适量,除另有规定外,置于无灰滤纸(图2a)中心,按虚线折叠(图2b)后,固定于铂丝下端的网内或螺旋处,使尾部露出。如为液体供试品,可在透明胶纸和滤纸做成的纸袋中称样,方法为将透明胶纸剪成规定的大小和形状(图2c),中部贴一约16mm×6mm的无灰滤纸条,并于其突出部分贴一6mm×35mm的无灰滤纸条(图2d),将胶纸对折,紧粘住底部及另一边,并使上口敞开(图2e);精密称定重量,用滴管将供试品从上口滴在无灰滤纸条上,立即捏紧粘住上口,精密称定重量,两次重量之差即为供试品重,将含有供试品的纸袋固定于铂丝下端的网内或螺旋处,使尾部露出。另在燃烧瓶内按各品种项下的规定加入吸收液,并将瓶口用水湿润,小心急速通入氧气约1分钟(通气管应接近液面,使瓶内空气排尽),立即用表面皿覆盖瓶口,移置他处;点燃包有供试品的滤纸尾部,迅速放入燃烧瓶中,按紧瓶塞,用水少量封闭瓶口,俟燃烧完毕(应无黑色碎片),充分振摇,使生成的烟雾完全吸入吸收液中,放置15分钟,用水少量冲洗瓶塞及铂丝,合并洗液及吸收液。同法另做空白试验。然后按各品种项下规定的方法进行检查或测定。

图2 滤纸折叠方法

【附注】操作中在燃烧时要有防爆措施。

5 附录Ⅶ D 氮测定法

5.1 第一法(常量法)

取供试品适量(约相当于含氮量25~30mg),精密称定,供试品如为固体或半固体,可用滤纸称取,并连同滤纸置干燥的500ml凯氏烧瓶中;然后依次加入硫酸钾(或无水硫酸钠)10g和硫酸铜粉末0.5g,再沿瓶壁缓缓加硫酸20ml;在凯氏烧瓶口放一小漏斗并使凯氏烧瓶成45°斜置,用直火缓缓加热,使溶液的温度保持在沸点以下,等泡沸停止,强热至沸腾,俟溶液成澄明的绿色后,除另有规定外,继续加热30分钟,放冷。沿瓶壁缓缓加水250ml,振摇使混合,放冷后,加40%氢氧化钠溶液75ml,注意使沿瓶壁流至瓶底,自成一液层,加锌粒数粒,用氮气球将凯氏烧瓶与冷凝管连接;另取2%硼酸溶液50ml,置500ml锥形瓶中,加甲基红-溴甲酚绿混合指示液10滴;将冷凝管的下端插入硼酸溶液的液面下,轻轻摆动凯氏烧瓶,使溶液混合均匀,加热蒸馏,至接收液的总体积约为250ml时,将冷凝管尖端提出液面,使蒸气冲洗约1分钟,用水淋洗尖端后停止蒸馏;馏出液用硫酸滴定液(0.05mol/L)滴定至溶液由蓝绿色变为灰紫色,并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml硫酸滴定液(0.05mol/L)相当于1.401mg的N。

5.2 第二法(半微量法)

蒸馏装置如图。图中A为1000ml圆底烧瓶,B为安全瓶,C为连有氮气球的蒸馏器,D为漏斗,E为直形冷凝管,F为100ml锥形瓶,G、H为橡皮管夹。

图 蒸馏装置

连接蒸馏装置,A瓶中加水适量与甲基红指示液数滴,加稀硫酸使成酸性,加玻璃珠或沸石数粒,从D漏斗加水约50ml,关闭G夹,开放冷凝水,煮沸A瓶中的水,当蒸汽从冷凝管尖端冷凝而出时,移去火源,关H夹,使C瓶中的水反抽到B瓶,开G夹,放出B瓶中的水,关B瓶及G夹,将冷凝管尖端插入约50ml水中,使水自冷凝管尖端反抽至C瓶,再抽至B瓶,如上法放去。如此将仪器内部洗涤2~3次。

取供试品适量(约相当于含氮量1.0~2.0mg),精密称定,置干燥的30~50ml凯氏烧瓶中,加硫酸钾(或无水硫酸钠)0.3g与30%硫酸铜溶液5滴,再沿瓶壁滴加硫酸2.0ml;在凯氏烧瓶口放一小漏斗,并使凯氏烧瓶成45°斜置,用小火缓缓加热使溶液保持在沸点以下,等泡沸停止,逐步加大火力,沸腾至溶液成澄明的绿色后,除另有规定外,继续加热10分钟,放冷,加水2ml。

取2%硼酸溶液10ml,置100ml锥形瓶中,加甲基红-溴甲酚绿混合指示液5滴,将冷凝管尖端插入液面下。然后,将凯氏烧瓶中内容物经由D漏斗转入C蒸馏瓶中,用水少量淋洗凯氏烧瓶及漏斗数次,再加入40%氢氧化钠溶液10ml,用少量水再洗漏斗数次,关G夹,加热A瓶进行蒸气蒸馏,至硼酸液开始由酒红色变为蓝绿色时起,继续蒸馏约10分钟后,将冷凝管尖端提出液面,使蒸气继续冲洗约1分钟,用水淋洗尖端后停止蒸馏。

馏出液用硫酸滴定液(0.005mol/L)滴定至溶液由蓝绿色变为灰紫色,并将滴定的结果用空白试验(空白和供试品所得馏出液的容积应基本相同,约70~75ml)校正。每1ml硫酸滴定液(0.005mol/L)相当于0.1401mg的N。

取用的供试品如在0.1g以上时,应适当增加硫酸的用量,使消解作用完全,并相应地增加40%氢氧化钠溶液的用量。

6 附录Ⅶ E 乙醇量测定法

本法系采用气相色谱法(2010年版药典二部附录Ⅴ E)测定制剂中在20℃时乙醇(C2H5OH)的含量(%,ml/ml)。除另有规定外,按下列方法测定。

6.1 第一法(毛细管柱法)

6.1.1 色谱条件与系统适用性试验

用键合交联聚乙二醇为固定液的毛细管柱;起始温度为50℃,维持7分钟,再以每分钟10℃的速率升温至110℃;进样口温度190℃;检测器温度220℃。理论板数按正丙醇峰计算应不低于8000,乙醇峰与正丙醇峰的分离度应大于2.0。

6.1.2 校正因子测定

精密量取恒温至20℃的无水乙醇4ml、5ml、6ml,分别置100ml量瓶中,分别精密加入恒温至20℃的正丙醇(内标物质)5ml,用水稀释至刻度,摇匀,精密量取上述各溶液1ml,分别置100ml量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀(必要时可进一步稀释),作为对照品溶液。取上述三种溶液各适量,注入气相色谱仪,分别连续进样3次,测定峰面积,计算校正因子,所得校正因子的相对标准偏差不得大于2.0%。

6.1.3 测定法

精密量取恒温至20℃的供试品适量(相当于乙醇约5ml),置100ml量瓶中,精密加入恒温至20℃的正丙醇5ml,用水稀释至刻度,摇匀,精密量取该溶液1ml,置100ml量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀(必要时可进一步稀释),作为供试品溶液。取1μl注入气相色谱仪,测定,即得。

6.2 第二法(填充柱法)

6.2.1 色谱条件与系统适用性试验

用直径为0.18~0.25mm的二乙烯苯-乙基乙烯苯型高分子多孔小球作为载体;柱温为120~150℃。理论板数按正丙醇峰计算应不低于700,乙醇峰与正丙醇峰的分离度应大于2.0。

6.2.2 校正因子测定

精密量取恒温至20℃的无水乙醇4ml、5ml、6ml,分别置100ml量瓶中,分别精密加入恒温至20℃的正丙醇(内标物质)5ml,用水稀释至刻度,摇匀(必要时可进一步稀释)。取上述三种溶液适量,注入气相色谱仪,分别连续进样3次,测定峰面积,计算校正因子,所得校正因子的相对标准偏差不得大于2.0%。

6.2.3 测定法

精密量取恒温至20℃的供试品溶液适量(相当于乙醇约5ml),置100ml量瓶中,精密加入恒温至20℃的正丙醇5ml,用水稀释至刻度,摇匀(必要时可进一步稀释),取适量注入气相色谱仪,测定,即得。

7 附录Ⅶ F 甲氧基、乙氧基与羟丙氧基测定法

本法系采用气相色谱法(2010年版药典二部附录Ⅴ E)或容量法测定甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙纤维素或羟丙甲纤维素等药用辅料中所含的甲氧基、乙氧基和羟丙氧基。

可选择第一法或第二法测定,当第二法测定结果不符合规定时,应以第一法测定结果为判定依据。

7.1 第一法(气相色谱法)

7.1.1 色谱条件与系统适用性试验

用25%苯基-75%甲基聚硅氧烷为固定液,涂布浓度为20%的填充柱,或用6%氰丙基苯基-94%二甲基硅氧烷(或极性相近的固定液)为固定液的毛细管色谱柱;起始温度为100℃,维持8分钟,再以每分钟50℃的速率升温至230℃,维持2分钟;进样口温度为200℃;检测器(氢火焰离子化检测器(FID)或热导检测器(TCD)]温度为250℃。理论板数按正辛烷峰计算不低于1500(填充柱)或10000(毛细管柱),对照品峰与内标物质峰的分离度应符合要求。取对照品溶液1μl注入气相色谱仪,连续迸样5次,计算校正因子,相对标准偏差应不大于3.0%。

7.1.2 测定法

取供试品约65mg,精密称定,置已称重的反应瓶中(可取10ml的顶空进样瓶),加己二酸80mg,精密加入内标溶液(取正辛烷0.5g,置100ml量瓶中,加邻二甲苯溶解并稀释至刻度,摇匀,即得)与57%氢碘酸溶液各2ml,密封,精密称定,于130~150℃振荡60分钟,或在130~150℃加热30分钟后,剧烈振摇5分钟,继续在130~150℃加热30分钟,冷却,精密称定,若减失重量小于反应瓶中内容物的0.50%,且无渗漏,可直接取混合液的上层液体作为供试品溶液;若减失重量大于反应瓶中内容物的0.50%,则应按上法重新制备供试品溶液。另取己二酸80mg,置已称重的反应瓶中,精密加入内标溶液与57%氢碘酸溶液各2ml,密封,精密称定,根据供试品中所含甲氧基、乙氧基和羟丙氧基的量,用注射器穿刺加入相应的碘甲烷、碘乙烷和2-碘丙烷对照品,精密称定,两次称重结果相减即为对照品的加入量。振摇约30秒钟,静置,取上层液体作为对照品溶液。取供试品溶液与对照品溶液各1μl,分别注入气相色谱仪,记录色谱图,按内标法以峰面积计算,并将结果乘以系数[碘甲烷(分子量141.94)转换为甲氧基(分子量31.03)系数为0.2186;碘乙烷(分子量155.97)转换为乙氧基(分子量45.06)系数为0.2889;2-碘丙烷(分子量169.99)转换为羟丙氧基(分子量75.09)系数为0.4417],即得。

7.2 第二法(容量法)

7.2.1 1.羟丙氧基测定

7.2.1.1 仪器装置

如图1。图中D为25ml双颈蒸馏瓶,侧颈与外裹铝箔的长度为95mm的分馏柱E相连接;C为接流管,末端内径为0.25~1.25mm,插入蒸馏瓶内;B为蒸汽发生管(25mm×150mm),亦具末端内径为0.25~1.25mm的气体导人管,并与C相通;F为冷凝管,外管长100mm,与E连接;G为125ml具刻度的带玻塞锥形瓶,供收集馏液用。D与B均浸入可控温的电热油浴A中,维持温度为155℃。

图1 羟丙氧基测定仪器装置

7.2.1.2 测定法

取各品种项下规定量的供试品,精密称定,置蒸馏瓶D中,加30% (g/g)三氧化铬溶液10ml。于蒸汽发生管B中装入水至近接头处,连接蒸馏装置。将B与D均浸入油浴中(可为甘油),使油浴液面与D瓶中三氧化铬溶液的液面相一致。开启冷却水,必要时通入氮气流并控制其流速为每秒钟约1个气泡。于30分钟内将油浴升温至155℃,并维持此温度至收集馏液约50ml,将冷凝管自分馏柱上取下,用水冲洗,洗液并入收集液中加酚酞指示液2滴,用氢氧化钠滴定液(0.02mol/L)滴定至pH值为6.9~7.1(用酸度计测定),记下消耗的容积V1(ml),而后加碳酸氢钠0.5g与稀硫酸10ml,静置至不再产生二氧化碳为止,加碘化钾1.0g,密塞,摇匀,置暗处放置5分钟,加淀粉指示液1ml,用硫代硫酸钠滴定液(0.02mol/L)滴定至终点,记下消耗的容积V2(ml)。另做空白试验,分别记下消耗的氢氧化钠滴定液(0.02mol/L)与硫代硫酸钠滴定液(0.02mol/L)的容积Va与Vb(ml),按下式计算,即得。

式中 K为空白校正系数(M1Va)/(M2Vb);

V1为供试品消耗氢氧化钠滴定液(0.02mol/L)的容积,ml;

V2为供试品消耗硫代硫酸钠滴定液(0.02mol/L)的容积,ml;

Va为空白试验消耗氢氧化钠滴定液(0.02mol/L)的容积,ml;

Vb为空白试验消耗硫代硫酸钠滴定液(0.02mol/L)的容积,ml;

W为供试品的重量,g;

M1为氢氧化钠滴定液的浓度,mol/L;

M2为硫代硫酸钠滴定液的浓度,mol/L;

0.0751为羟丙氧基(OCH2CHOHCH3)的毫摩尔质量。

7.2.2 2.甲氧基测定

7.2.2.1 仪器装置

如图2。A为50ml圆底烧瓶,侧部具一内径为1mm的支管供导入二氧化碳或氮气流用;瓶颈垂直装有长约25cm、内径为9mm的直形空气冷凝管E,其上端弯曲成出

图2 甲氧基测定仪器装置

口向下、并缩为内径2mm的玻璃毛细管,浸入内盛水约2ml的洗气瓶B中;洗气瓶具出口为一内径约7mm的玻璃管,其末端为内径4mm可拆卸的玻璃管,可浸入两个相连接的接收容器C、D中的第一个容器C内液面之下。

7.2.2.2 测定法

取干燥的供试品(相当于甲氧基10mg),精密称定,置烧瓶中,加熔融的苯酚2.5ml与氢碘酸5ml,连接上述装置;另在两个接收容器内,分别加入10%醋酸钾的冰醋酸溶液6ml与4ml,再各加溴0.2ml;通过支管将CO2或N2气流缓慢而均衡地(每秒钟1~2个气泡为宜)通入烧瓶,缓缓加热使温度控制在恰使沸腾液体的蒸气上升至冷凝管的半高度(约至30分钟使油液温度上升至135~140℃),在此温度下通常在45分钟可完成反应(根据供试品的性质而定,如果供试品中含有多于两个甲氧基时,加热时间应延长到1~3小时)。而后拆除装置,将两只接收容器的内容物倾入250ml碘瓶(内盛25%醋酸钠溶液5ml)中,并用水淋洗使总体积约为125ml,加入甲酸0.3ml,转动碘瓶至溴的颜色消失,再加入甲酸0.6ml,密塞振摇,使过量的溴完全消失,放置1~2分钟,加入碘化钾1.0g与稀硫酸5ml,用硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)滴定,并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)相当于0.5172mg的甲氧基。

7.3 【注意事项】

(1)碘甲烷、碘乙烷和2-碘丙烷均为极易挥发性物质,应在进样前,打开反应瓶密封盖后,立即将上层液体移入进样瓶;进样瓶的密封性应良好。

(2)碘甲烷、碘乙烷和2-碘丙烷均应避光保存,放置过程中释放出碘,使溶液颜色逐渐加深,每次测定前应进行标化(见附注),含量计算时应进行折算。

(3)57%氢碘酸可直接从市场购买,也可取市售的氢碘酸试剂置于全玻璃仪器中,加适量次亚磷酸,使氢碘酸的颜色由棕色变为无色,加热,同时缓缓通入氮气,收集126~127℃的馏分,纯化后的氢碘酸贮藏于有良好密封性的棕色玻璃瓶中,充氮保存。

7.4 【附注】碘甲烷、碘乙烷和2-碘丙烷的标化

1.纯度测定(气相色谱法) 避光操作。用6%氰丙基苯基-94%二甲基硅氧烷(或极性相近的固定液)为固定液的毛细管柱;起始温度为60℃,维持8分钟,再以每分钟10℃的速率升温至150℃,维持10分钟;进样口温度为200℃;检测器[氢火焰离子化检测(FID)或热导检测(TCD)]温度为250℃。取本品1μl,注入气相色谱仪,记录色谱图,按不加校正因子的峰面积归一化法计算主峰相对百分含量,不得低于99.5%。

2.含量测定(容量法) 避光操作。取乙醇10ml,置100ml量瓶中,精密称定,加碘甲烷(或碘乙烷,或2-碘丙烷)1.0ml,精密称定,用乙醇稀释至刻度,摇匀;精密量取20ml,置100ml量瓶中,精密加硝酸银滴定液(0.1mol/L) 50ml与硝酸2ml,时时振摇2小时,避光,放置过夜,继续时时振摇2小时,用水稀释至刻度,摇匀,滤过,弃去初滤液20ml,精密量取续滤液50ml,加硫酸铁铵指示液2ml,用硫氰酸铵滴定液(0.1mol/L)滴定,并将滴定结果用空白试验校正。每1ml硝酸银滴定液(0.1mol/L)相当于14.19mg的碘甲烷(CH3I)[15.60mg的碘乙烷(C2H5I)或17.00mg的2-碘丙烷(C3H7I)],含碘甲烷(或碘乙烷,或2-碘丙烷)不得低于98.0%。

8 附录Ⅶ H 脂肪与脂肪油测定法

液体供试品如因析出硬脂发生浑浊时,应先置50℃的水浴上加热,使完全熔化成澄清液体;加热后如仍显浑浊,可离心沉降或用干燥的保温滤器滤过使澄清;将得到的澄清液体搅匀,趁其尚未凝固,用附有滴管的称量瓶或附有玻勺的称量杯,分别称取下述各项检验所需的供试品。固体供试品应先在不高于其熔点10℃的温度下熔化,离心沉降或滤过,再依法称取。相对密度的测定 照相对密度测定法(2010年版药典二部附录Ⅵ A)测定。折光率的测定 照折光率测定法(2010年版药典二部附录Ⅵ F)测定。

8.1 熔点的测定

照熔点测定法(2010年版药典二部附录Ⅵ C第二法)测定。

8.2 脂肪酸凝点的测定

(1)脂肪酸的提取 取20% (g/g)氢氧化钾的甘油溶液75g,置800ml烧杯中,加供试品50g,于150℃在不断搅拌下皂化15分钟,放冷至约100℃,加入新沸的水500ml,搅匀,缓缓加入硫酸溶液(1→4)50ml,加热至脂肪酸明显分离为一个透明层;趁热将脂肪酸移入另一烧杯中,用新煮沸的水反复洗涤,至洗液加入甲基橙指示液显黄色,趁热将澄清的脂肪酸放入干燥的小烧杯中,加无水乙醇5ml,搅匀,用小火加热至无小气泡逸出,即得。

(2)凝点的测定 取按上法制成的干燥脂肪酸,照凝点测定法(2010年版药典二部附录Ⅵ D)测定。

8.3 酸值的测定

酸值系指中和脂肪、脂肪油或其他类似物质1g中含有的游离脂肪酸所需氢氧化钾的重量(mg),但在测定时可采用氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)进行滴定。

酸值

称重/g

酸值

称重/g

0.5

10

100

1

1

5

200

0.5

10

4

300

0.4

50

2

除另有规定外,按表中规定的重量,精密称取供试品,置250ml锥形瓶中,加乙醇-乙醚(1:1)混合液[临用前加酚酞指示液1.0ml,用氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)调至微显粉红色]50ml,振摇使完全溶解(如不易溶解,可缓慢加热回流使溶解),用氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)滴定,至粉红色持续30秒钟不褪。以消耗氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)的容积(ml)为A,供试品的重量(g)为W,照下式计算酸值:

滴定酸值在10以下的油脂时,可用10ml的半微量滴定管。

8.4 皂化值的测定

皂化值系指中和并皂化脂肪、脂肪油或其他类似物质1g中含有的游离酸类和酯类所需氢氧化钾的重量(mg)。

取供试品适量[其重量(g)约相当于250/供试品的最大皂化值],精密称定,置250ml锥形瓶中,精密加入0.5mol/L氢氧化钾乙醇溶液25ml,加热回流30分钟,然后用乙醇10ml冲洗冷凝器的内壁和塞的下部,加酚酞指示液1.0ml,用盐酸滴定液(0.5mol/L)滴定剩余的氢氧化钾,至溶液的粉红色刚好褪去,加热至沸,如溶液又出现粉红色,再滴定至粉红色刚好褪去;同时做空白试验。以供试品消耗的盐酸滴定液(0.5mol/L)的容积(ml)为A,空白试验消耗的容积(ml)为B,供试品的重量(g)为W,照下式计算皂化值:

8.5 羟值的测定

羟值系指供试品1g中含有的羟基,经用下法酰化后,所需氢氧化钾的重量(mg)。

羟值

称重/g

羟值

称重/g

10~100

2.0

200~250

0.75

100~150

1.5

250~300

0.60

150~200

1.0

除另有规定外,按表中规定的重量,精密称取供试品,置干燥的250ml具塞锥形瓶中,精密加入酰化剂(取对甲苯磺酸14.4g,置500ml锥形瓶中,加乙酸乙酯360ml,振摇溶解后,缓缓加入醋酐120ml,摇匀,放置3日后备用)5ml,用吡啶少许湿润瓶塞,稍拧紧,轻轻摇动使完全溶解,置50℃±1℃水浴中25分钟(每10分钟轻轻摇动)后,放冷,加吡啶-水(3:5)20ml,5分钟后加甲酚红-麝香草酚蓝混合指示液8~10滴,用氢氧化钾(或氢氧化钠)滴定液(1mol/L)滴定至溶液显灰蓝色或蓝色;同时做空白试验。以供试品消耗的氢氧化钾(或氢氧化钠)滴定液(1mol/L)的容积(ml)为A,空白试验消耗的容积(ml)为B,供试品的重量(g)为W,供试品的酸值为D,照下式计算羟值:

8.6 碘值的测定

碘值系指脂肪、脂肪油或其他类似物质100g,当充分卤化时所需的碘量(g)。

取供试品适量[其重量(g)约相当于25/供试品的最大碘值],精密称定,置250ml的干燥碘瓶中,加三氯甲烷10ml,溶解后,精密加入溴化碘溶液25ml,密塞,摇匀,在暗处放置30分钟。加入新制的碘化钾试液10ml与水100ml,摇匀,用硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)滴定剩余的碘,滴定时注意充分振摇,待混合液的棕色变为淡黄色,加淀粉指示液1ml,继续滴定至蓝色消失;同时做空白试验。以供试品消耗硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)的容积(ml)为A,空白试验消耗的容积(ml)为B,供试品的重量(g)为W,照下式计算碘值:

8.7 过氧化值的测定

过氧化值系指每1000g供试品中含有的其氧化能力与一定量的氧相当的过氧化物量。

除另有规定外,取供试品5g,精密称定,置250ml碘瓶中,加三氯甲烷-冰醋酸(2:3)混合液30ml,振摇溶解后,加入碘化钾试液0.5ml,准确振摇萃取1分钟,然后加水30ml,用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定,滴定时,注意缓慢加入滴定液,并充分振摇直至黄色几乎消失,加淀粉指示液5ml,继续滴定并充分振摇至蓝色消失,同时做空白试验。空白试验中硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)的消耗量不得过0.1ml。供试品消耗硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)的容积(ml)为A,空白试验消耗硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)的容积(ml)为B,供试品的重量(g)为W,照下式计算过氧化值:

加热试验 取供试品约50ml,置烧杯中,在砂浴上加热至280℃,升温速率为每分钟上升10℃,观察油的颜色和其他性状的变化。

8.8 杂质

取供试品约20g,精密称定,置锥形瓶中,加石油醚(沸程60~90℃)20ml使溶解,用干燥至恒重的垂熔玻璃坩埚滤过(如溶液不易滤过,可添加石油醚适量),用石油醚洗净残渣和滤器,在105℃干燥至恒重;精密称定,增加的重量即为供试品中杂质的重量。

8.9 水分与挥发物

取供试品约5g,置干燥至恒重的扁形称量瓶中,精密称定,在105℃干燥40分钟取出,置干燥器内放冷,精密称定重量;再在105℃干燥20分钟,放冷,精密称定重量,至连续两次干燥后称重的差异不超过0.001g,如遇重量增加的情况,则以增重前的一次重量为恒重。减失的重量,即为供试品中含有水分与挥发物的重量。

8.10 【附注】

溴化碘溶液 取研细的碘13.0g,置干燥的具塞玻瓶中,加冰醋酸1000ml,微温使碘完全溶解;另用吸管插入法量取溴2.5ml(或在通风橱中用架盘天平称取7.8g),加入上述碘溶液中,摇匀,即得。为了确定加溴量是否合适,可在加溴前精密取出20ml,用硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)滴定,记下消耗的容积(ml);加溴后,摇匀,再精密取出20ml,加新制的碘化钾试液10ml,再用硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)滴定,消耗的容积(ml)应略小于加溴前的2倍。

本液应置具塞玻瓶内,密塞,在暗处保存。

9 附录Ⅶ J 维生素A测定法

本法是用紫外-可见分光光度法(2010年版药典二部附录Ⅳ A)或高效液相色谱法(2010年版药典二部附录Ⅴ D)测定维生素A及其制剂中维生素A的含量,以单位表示,每单位相当于全反式维生素A醋酸酯0.344μg或全反式维生素A醇0.300μg。

测定应在半暗室中尽快进行。

9.1 第一法(紫外-可见分光光度法)

由于维生素A制剂中含有稀释用油和维生素A原料药中混有其他杂质,采用紫外-可见分光光度法测得的吸光度不

是维生素A独有的吸收。在以下规定的条件下,非维生素A物质的无关吸收所引入的误差可以用校正公式校正,以便得到正确结果。

校正公式采用三点法,除其中一点是在吸收峰波长处测得外,其他两点分别在吸收峰两侧的波长处测定,因此仪器波长应准确,故在测定前,应对仪器波长进行校正。

测定法 取供试品适量,精密称定,加环己烷溶解并定量稀释制成每1ml中含9~15单位的溶液,照紫外-可见分光光度法(2010年版药典二部附录Ⅳ A),测定其吸收峰的波长,并在下表所列各波长处测定吸光度,计算各吸光度与波长328nm处吸光度的比值和波长328nm处的值。

波长/nm

吸光度比值

波长/nm

吸光度比值

300

0.555

340

0.811

316

0.907

360

0.299

328

1.000

如果吸收峰波长在326~329nm之间,且所测得各波长吸光度比值不超过表中规定的±0.02,可用下式计算含量:

每1g供试品中含有的维生素A的单位=(328nm)×1900如果吸收峰波长在326~329nm之间,但所测得的各波长吸光度比值超过表中规定值的±0.02,应按下式求出校正后的吸光度,然后再计算含量:

A328(校正)=3.52(2A328-A316-A340

如果在328nm处的校正吸光度与未校正吸光度相差不超过±3.0%,则不用校正吸光度,仍以未经校正的吸光度计算含量。

如果校正吸光度与未校正吸光度相差在-15%至-3%之间,则以校正吸光度计算含量。

如果校正吸光度超出未校正吸光度的-15%至-3%的范围,或者吸收峰波长不在326~329nm之间,则供试品须按下述方法测定。

另精密称取供试品适量(约相当于维生素A总量500单位以上,重量不多于2g),置皂化瓶中,加乙醇30ml与50%氢氧化钾溶液3ml,置水浴中煮沸回流30分钟,冷却后,自冷凝管顶端加水10ml冲洗冷凝管内部管壁,将皂化液移至分液漏斗中(分液漏斗活塞涂以甘油淀粉润滑剂),皂化瓶用水60~100ml分数次洗涤,洗液并人分液漏斗中,用不含过氧化物的乙醚振摇提取4次,每次振摇约5分钟,第一次60ml,以后各次40ml,合并乙醚液,用水洗涤数次,每次约100ml,洗涤应缓缓旋动,避免乳化,直至水层遇酚酞指示液不再显红色,乙醚液用铺有脱脂棉与无水硫酸钠的滤器滤过,滤器用乙醚洗涤,洗液与乙醚液合并,置250ml量瓶中,用乙醚稀释至刻度,摇匀;精密量取适量,置蒸发皿内,微温挥去乙醚,迅速加异丙醇溶解并定量稀释制成每1ml中含维生素A 9~15单位,照紫外-可见分光光度法(2010年版药典二部附录Ⅳ A),在300nm、310nm、325nm与334nm四个波长处测定吸光度,并测定吸收峰的波长。吸收峰的波长应在323~327nm之间,且300nm波长处的吸光度与325nm波长处的吸光度的比值应不超过0.73,按下式计算校正吸光度:

A325(校正)=6.815A325-2.555A310-4.260A334

每1g供试品中含有的维生素A的单位=(325 nm,校正)×1830

如果校正吸光度在未校正吸光度的97%~103%之间,则仍以未经校正的吸光度计算含量。

如果吸收峰的波长不在323~327nm之间,或300nm波长处的吸光度与325nm波长处的吸光度的比值超过0.73,则应自上述皂化后的乙醚提取液250ml中,另精密量取适量(相当于维生素A 300~400单位),微温挥去乙醚至约剩5ml,再在氮气流下吹干,立即精密加入甲醇3ml,溶解后,精密量取500μl,注入维生素D测定法(2010年版药典二部附录Ⅶ K)第二法项下的净化用色谱柱系统,准确收集含有维生素A的流出液,在氮气流下吹干,而后照上述方法自“迅速加异丙醇溶解”起,依法操作并计算含量。

9.2 第二法(高效液相色谱法)

本法适用于维生素A醋酸酯原料及其制剂中维生素A的含量测定。

色谱条件与系统适用性试验 用硅胶为填充剂,以正己烷-异丙醇(997:3)为流动相,检测波长为325nm。取系统适用性试验溶液10μl,注入液相色谱仪,维生索A醋酸酯主峰与其顺式异构体峰的分离度应大于3.0。精密量取对照品溶液10μl,注入液相色谱仪,连续进样5次,主成分峰面积的相对标准偏差不得过3.0%。

系统适用性试验溶液的制备 取维生素A对照品适量(约相当于维生素A醋酸酯300mg),置烧杯中,加入碘试液0.2ml,混匀,放置约10分钟,定量转移至200ml量瓶中,用正己烷稀释至刻度,摇匀,精密量取1ml,置100ml量瓶中,用正己烷稀释至刻度,摇匀。

测定法 精密称取供试品适量(约相当于15mg维生素A醋酸酯),置100ml量瓶中,用正己烷稀释至刻度,摇匀,精密量取5ml,置50ml量瓶中,用正己烷稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液。另精密称取维生索A对照品适量(约相当于15mg维生素A醋酸酯),同法制成对照品溶液。精密量取供试品溶液与对照品溶液各10μl,分别注入液相色谱仪,记录色谱图,按外标法以峰面积计算,含量应符合规定。

9.3 【附注】

(1)甘油淀粉润滑剂 取甘油22g,加入可溶性淀粉9g,加热至140℃,保持30分钟并不断搅拌,放冷,即得。

(2)不含过氧化物的乙醚 照麻醉乙醚项下的过氧化物检查,如不符合规定,可用5%硫代硫酸钠溶液振摇,静置,分取乙醚层,再用水振摇洗涤1次,重蒸,弃去首尾5%部分,馏出的乙醚再检查过氧化物,应符合规定。

(3)若维生素A对照品中含有维生素A醋酸酯顺式异构体,则可直接用作系统适用性分离度考察,不必再做破坏性实验。

10 附录Ⅶ K 维生素D测定法

本法系用高效液相色谱法(2010年版药典二部附录Ⅴ D)测定维生素D(包括维生素D2和维生素D3,下同)及其制剂、维生素AD制剂或鱼肝油中所含维生素D及前维生素D经折算成维生素D的总量,以单位表示,每单位相当于维生素D 0.025μg。

测定应在半暗室中及避免氧化的情况下进行。

无维生素A醇及其他杂质干扰的供试品可用第一法测定,否则应按第二法处理后测定;如果按第二法处理后,前维生素D峰仍受杂质干扰,仅有维生素D峰可以分离时,则应按第三法测定。

10.1 第一法

对照品贮备溶液的制备 根据各制剂中所含维生素D的成分,精密称取相应的维生素D2或D3对照品25mg,置100ml棕色量瓶中,加异辛烷80ml,避免加热,超声处理1分钟使完全溶解,用异辛烷稀释至刻度,摇匀,作为贮备溶液(1);精密量取5ml,置50ml棕色量瓶中,用异辛烷稀释至刻度,摇匀,充氮密塞,避光,0℃以下保存,作为贮备溶液(2)。测定维生素D2时,应另取维生素D3对照品25mg,同法制成维生素D3对照品贮备溶液,供系统适用性试验用。

色谱条件与系统适用性试验 用硅胶为填充剂;以正己烷-正戊醇(997:3)为流动相;检测波长为254nm。量取维生素D3对照品贮备溶液(1) 5ml,置具塞玻璃容器中,通氮后密塞,置90℃水浴中加热1小时,取出,迅速冷却,加正己烷5ml,摇匀,置1cm具塞石英吸收池中,在2支8W主波长分别为254nm和365nm的紫外光灯下,将石英吸收池斜放成45°,并距灯管5~6cm,照射5分钟,使溶液中含有前维生素D3、反式维生素D3、维生素D3和速甾醇D3;量取该溶液注入液相色谱仪,进样5次,记录峰面积,维生素D3峰的相对标准偏差应不大于2.0%;前维生素D3峰(与维生素D3相对保留时间约为0.5)与反式维生素D3峰(与维生素D3相对保留时间约为0.6)以及维生素D3峰与速甾醇D3峰(与维生素D3相对保留时间约为1.1)的分离度均应大于1.0。

响应因子测定 精密量取对照品贮备溶液(2) 5ml,置50ml量瓶中,用正己烷稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液;取10μl注入液相色谱仪,记录色谱图,计算维生素D的响应因子f1

f1=c1/A1

式中C1为维生素D对照品溶液的浓度,μg/ml;

A1为对照品溶液色谱图中维生素D峰的峰面积。

另精密量取对照品贮备溶液(2)[1]5ml,置50ml量瓶中,加2,6-二叔丁基对甲酚结晶1粒,通氮排除空气后,密塞,置90℃水浴中加热1.5小时,取出,迅速冷却,用正己烷稀释至刻度,摇匀,作为混合对照品溶液;取10μl注入液相色谱仪,记录色谱图,计算前维生素D的响应因子f2。f2=(C1-f1A1)/A2

式中 C1为f1测定项下维生素D对照品溶液的浓度,

μg/ml;

f1为维生素D的响应因子;

A1为混合对照品溶液色谱图中维生素D峰的峰面积;

A2为混合对照品溶液色谱图中前维生素D峰的峰面积。

测定法 取该制剂项下制备的供试品溶液进行测定,按下列公式计算维生素D及前维生素D折算成维生素D的总量(ci)。

ci=f1Ai1+f2Ai2

式中Ai1为维生素D峰的峰面积;Ai2为前维生素D峰的峰面积。

10.2 第二法

供试品溶液A的制备 精密称取供试品适量(相当于维生素D总量600单位以上,重量不超过2.0g),置皂化瓶中,加乙醇30ml、维生素C 0.2g与50%氢氧化钾溶液3ml[若供试量为3g,则加50%氢氧化钾溶液4ml],置水浴上加热回流30分钟,冷却后,自冷凝管顶端加水10ml冲洗冷凝管内壁,将皂化液移至分液漏斗中,皂化瓶用水60~100ml分数次洗涤,洗液并入分液漏斗中,用不含过氧化物的乙醚振摇提取3次,第一次60ml,以后每次40ml,合并乙醚液,用水洗涤数次,每次约100ml,洗涤时应缓缓旋动,避免乳化,直至水层遇酚酞指示液不再显红色,静置,分取乙醚提取液,加入干燥滤纸条少许振摇除去乙醚提取液中残留的水分,分液漏斗及滤纸条再用少量乙醚洗涤,洗液与提取液合并,置具塞圆底烧瓶中,在水浴上低温蒸发至约5ml,再用氮气流吹干,迅速精密加入甲醇3ml,密塞,超声处理助溶后,移入离心管中,离心,取上清液作为供试品溶液A。

净化用色谱柱系统分离收集维生素D 精密量取上述供试品溶液A 500μl,注入以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱,以甲醇-乙腈-水(50:50:2)为流动相进行分离,检测波长为254nm,记录色谱图,维生素D与前维生素D应为重叠峰,并能与维生索A及其他杂质分开。准确收集含有维生素D及前维生素D混合物的全部流出液,置具塞圆底烧瓶中,用氮气流迅速吹干,精密加入正己烷溶液适量,使每1ml中含维生素D 50~140单位,密塞,超声处理使溶解,即得供试品溶液B。

测定法 取供试品溶液B,照第一法进行含量测定,进样量为100~200μl。

10.3 第三法

供试品溶液的制备 取该制剂项下制备的供试品溶液A,按上述第二法净化用色谱柱系统分离维生素D项下的方法处理,至“用氮气流迅速吹干”后,加入异辛烷2ml溶解,通氮排除空气后,密塞,置90℃水浴中,加热1.5小时后,立即通氮在2分钟内吹干,迅速精密加入正己烷2ml,溶解后,即得供试品溶液C。

对照品溶液的制备 精密量取对照品贮备溶液(1)适量,加异辛烷定量稀释制成每1ml中约含维生素D 50单位,精密量取2ml,置具塞圆底烧瓶中,照供试品溶液制备项下的方法,自“通氮排除空气后”起,依法操作,得对照品溶液。

测定法 照第一法项下的色谱条件,精密量取对照品溶液与供试品溶液C各200μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,按外标法以峰面积计算维生素D的含量。

11 附录Ⅶ L 2-乙基己酸测定法

本法系采用气相色谱法(2010年版药典二部附录Ⅴ E)测定β-内酰胺类药物中的2-乙基己酸的量。

11.1 色谱条件与系统适用性试验

用聚乙二醇(PEG-20M)或极性相似的毛细管柱;柱温为150℃;进样口温度为200℃;检测器温度为300℃。2-乙基己酸峰的理论板数应不低于5000,各色谱峰之间的分离度应大于2.0。取对照品溶液连续进样5次,2-乙基己酸峰与内标峰面积之比的相对标准偏差应不大于5%。

11.2 内标溶液的制备

称取3-环己丙酸约100mg,置100ml量瓶中,用环己烷溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。

11.3 供试品溶液的制备

精密称取供试品约0.3g,加33%盐酸溶液4.0ml使溶解,精密加入内标溶液1ml,剧烈振摇1分钟,静置使分层(如有必要,可离心),取上层溶液作为供试品溶液。必要时可进行二次提取:分取出下层溶液,精密加入内标溶液1ml,剧烈振摇1分钟,静置使分层(如有必要,可离心),弃去下层溶液,合并上清液,作为供试品溶液。

11.4 对照品溶液的制备

精密称取2-乙基己酸对照品75mg,置50ml量瓶中,用内标溶液溶解并稀释至刻度,摇匀。精密量取1ml,加33%盐酸溶液4.0ml,剧烈振摇1分钟,静置使分层(如有必要,可离心),取上层溶液作为对照品溶液。如供试品进行二次提取,对照品也相应进行二次提取:分取出下层溶液,加入内标溶液1ml,再剧烈振摇1分钟,静置分层(如有必要,可离心),弃去下层溶液,合并上清液,作为对照品溶液。

11.5 测定法

取对照品溶液与供试品溶液各1μl,分别注入气相色谱仪,记录色谱图,按照以下公式计算2-乙基己酸的百分含量(%):

式中AT为供试品溶液色谱图中2-乙基己酸的峰面积;

AR为对照品溶液色谱图中2-乙基己酸的峰面积;

IT为供试品溶液色谱图中内标的峰面积;

IR为对照品溶液色谱图中内标的峰面积;

MT为供试品的重量,g;

MR为2-乙基己酸对照品的重量,g。

12 附录Ⅶ M 蛋白质含量测定法

组成蛋白质的基本单位是氨基酸,氨基酸通过脱水缩合形成肽链,蛋白质是一条或多条多肽链组成的生物大分子。不同品种应针对自身蛋白质特性选择适宜的测定方法并做相应方法学验证,同时应尽可能选用与待测品种蛋白质结构相同或相近的蛋白质作对照品。

12.1 第一法 凯氏定氮法

本法系依据蛋白质为含氮的有机化合物,当与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化时使蛋白质分解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸液吸收后以硫酸滴定液滴定,根据酸的消耗量算出含氮量,再将含氮量乘以换算系数,即为蛋白质的含量。[1]

本法灵敏度较低,适用于0.2~2.0mg氮的测定。氮转化成蛋白质的换算系数因蛋白质中所含氨基酸的结构差异会稍有区别。

供试品溶液的制备 照各品种项下规定的方法制备。测定法 除另有规定外,按测定法(1)操作。

(1)本测定法适用于不含无机含氮物质及有机非蛋白质含氮物质的供试品。精密量取各品种项下规定的供试品溶液适量,置凯氏定氮瓶中,照氮测定法(2010年版药典二部附录Ⅶ D 第二法)测定供试品溶液的含氮量,除另有规定外,氮转换为蛋白质的换算系数为6.25。

(2)本测定法适用于含有无机含氮物质及有机非蛋白质含氮物质的供试品。精密量取各品种项下规定的总氮量及非蛋白氮供试品溶液适量,分别置凯氏定氮瓶中,照氮测定法(2010年版药典二部附录Ⅶ D 第二法)测定,以总氮量减去非蛋白氮量即为供试品溶液的含氮量,除另有规定外,氮转换为蛋白质的换算系数为6.25。

【附注】非蛋白氮供试品溶液制备的常用方法

钨酸沉淀法 精密量取供试品适量(蛋白质含量不高于0.2g),置20ml量瓶中,加水10ml,加10%钨酸钠溶液2ml,0.33moI/L硫酸溶液2ml,加水至刻度,摇匀,静置30分钟,滤过,取续滤液,即得(可依据蛋白质浓度适当调整10%钨酸钠溶液及0.33mol/L硫酸溶液用量,使钨酸终浓度保持1%)。三氯醋酸沉淀法 精密量取供试品适量(蛋白质含量约6~12mg),加等体积的10%三氯醋酸溶液,混匀,静置30分钟,滤过,取续滤液,即得(可依据蛋白质浓度适当调整10%三氯醋酸溶液用量,使三氯醋酸终浓度保持5%)。

12.2 第二法 福林酚法(Lowry法)

本法系依据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与Cu2+螯合形成蛋白质-铜复合物,此复合物使酚试剂的磷钼酸还原,产生蓝色化合物,同时在碱性条件下酚试剂易被蛋白质中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸还原呈蓝色反应。在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比,以蛋白质对照品溶液作标准曲线,采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。

本法灵敏度高,测定范围通常可达20~250μg。本法干扰物质较多,对双缩脲反应产生干扰的离子,同样容易干扰福林一酚反应,且影响还要大。还原物质、酚类、枸橼酸、硫酸铵、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸、甘露醇、糖类、甘油等均有干扰作用。

试剂 碱性铜试液 取氢氧化钠10g,碳酸钠50g,加水400ml使溶解,作为甲液;取酒石酸钾0.5g,加水50ml使溶解,另取硫酸铜0.25g,加水30ml使溶解,将两液混合作为乙液。临用前,合并甲、乙液,并加水至500ml。

对照品溶液的制备 除另有规定外,取牛血清白蛋白对照品,加水溶解并制成每1ml中含0.2mg的溶液。

供试品溶液的制备 照各品种项下规定的方法制备(蛋白质浓度应与对照品溶液基本一致)。

测定法 精密量取对照品溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml,分别置具塞试管中,各加水至1.0ml,再分别加入碱性铜试液1.0ml,摇匀,各加入福林酚试液[取福林试液中的贮备液(2mol/L酸浓度)1→16]4.0ml,立即混匀,置55℃水浴中准确反应5分钟,置冷水浴10分钟,照紫外-可见分光光度法(2010年版药典二部附录Ⅳ A),在650nm的波长处测定吸光度;同时以0号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方程。另精密量取供试品溶液适量,同法测定。从线性回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度,并乘以稀释倍数,即得。

12.3 第三法 双缩脲法

本法系依据蛋白质分子中含有的两个以上肽键在碱性溶液中与Cu2+形成紫红色络合物,在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比,以蛋白质对照品溶液作标准曲线,采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。

本法快速、灵敏度低,测定范围通常可达1~10mg。本法干扰测定的物质主要有硫酸铵、三羟甲基氨基甲烷缓冲液和某些氨基酸等。

试剂 双缩脲试液 取硫酸铜1.5g和酒石酸钾钠6.0g,加水500ml使溶解,边搅拌边加入10%氢氧化钠溶液300ml,用水稀释至1000ml,混匀,即得。本试剂如有黑色沉淀出现,应重新配制。

对照品溶液的制备 除另有规定外,取牛血清白蛋白对照品,加水溶解并制成每1ml中含10mg的溶液。

供试品溶液的制备 照各品种项下规定的方法制备(蛋白质浓度应与对照品溶液基本一致)。

测定法 精密量取对照品溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml,分别置具塞试管中,各加水至1.0ml,再分别加入双缩脲试液4.0ml,立即混匀,室温放置30分钟,照紫外一可见分光光度法(2010年版药典二部附录Ⅳ A),在540nm的波长处测定吸光度;同时以0号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方程。另精密量取供试品溶液适量,同法操作。从线性回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度,并乘以稀释倍数,即得。

12.4 第四法 2,2'-联喹啉-4.4'-二羧酸法(BCA法)

本法系依据蛋白质分子在碱性溶液中将Cu2+还原为Cu+,2,2'-联喹啉-4,4'-二羧酸(BCA)与Cu+结合形成紫色复合物,在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比,以蛋白质对照品溶液作标准曲线,采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。

本法灵敏度较高,测定范围通常可达80~400μg。本法测定的样品中不能有还原剂和铜螯合物,否则影响测定。

试剂 铜-BCA试液取 2,2'-联喹啉-4,4'-二羧酸钠1g,无水碳酸钠2g,酒石酸钠0.16g,氢氧化钠0.4g与碳酸氢钠0.95g,加水使溶解成100ml,调节pH值至11.25,作为甲液;另取4%硫酸铜溶液作为乙液。临用前取甲液100ml,加入乙液2ml,混匀,即得。

对照品溶液的制备 除另有规定外,取牛血清白蛋白对照品,加水溶解并制成每1ml中含0.8mg的溶液。

供试品溶液的制备 照各品种项下规定的方法制备(蛋白质浓度应与对照品溶液基本一致)。

测定法 精密量取对照品溶液0.0ml、0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml,分别置具塞试管中,各加水至0.5ml,再分别加入铜-BCA试液10.0ml,立即混匀,置37℃水浴中保温30分钟,放冷,照紫外-可见分光光度法(2010年版药典二部附录Ⅳ A),立即在562nm的波长处测定吸光度;同时以0号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方程。另精密量取供试品溶液适量,同法测定。从线性回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度,并乘以稀释倍数,即得。

12.5 第五法 考马斯亮蓝法(Bradford法)

本法系依据在酸性溶液中考马斯亮蓝G250与蛋白质分子中的碱性氨基酸(精氨酸)和芳香族氨基酸结合形成蓝色复合物,在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比,以蛋白质对照品溶液作标准曲线,采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。

本法灵敏度高,通常可测定1~200μg的蛋白量。本法主要的干扰物质有去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)等,样品缓冲液呈强碱性时也会影响显色。

试剂 酸性染色液 取考马斯亮蓝G250 0.1g,加乙醇50ml溶解后,加磷酸100ml,加水稀释至1000ml,混匀。滤过,取滤液,即得。本试剂应置棕色瓶内,如有沉淀产生,使用前再滤过。

对照品溶液的制备 除另有规定外,取牛血清白蛋白对照品,加水溶解并制成每1ml中含1mg的溶液。

供试品溶液的制备 照各品种项下规定的方法制备(蛋白质浓度应与对照品溶液基本一致)。

测定法 精密量取对照品溶液0.0ml、0.01ml、0.02ml、0.04ml、0.06ml、0.08ml、0.1ml分别置具塞试管中,各加水至0.1ml,再分别加入酸性染色液5.0ml,立即混匀,照紫外-可见分光光度法(2010年版药典二部附录Ⅳ A),立即在595nm的波长处测定吸光度;同时以0号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方程。另精密量取供试品溶液适量,同法测定,从线性回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度,

并乘以稀释倍数,即得。

【注意事项】本法测定时不可使用可与染色物结合的比色皿(如石英比色皿),建议使用玻璃比色皿或其他适宜材料的比色皿。

12.6 第六法 紫外-可见分光光度法

本法系依据蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸,其在280nm的波长处具最大吸光度,在一定范围内其吸光度大小与蛋白质浓度呈正比。

本法操作简便快速,适用于纯化蛋白质的微量检测,一般样品浓度为0.2~2mg/ml。本法准确度较差,干扰物质多。测定法(2)适用于供试品溶液中存在核酸时的蛋白质测定。对照品溶液与供试品溶液的制备 照各品种项下规定的方法制备。

测定法

(1)取供试品溶液,照紫外-可见分光光度法(2010年版药典二部附录Ⅳ A),在280nm的波长处测定吸光度,以吸收系数法或对照品比较法计算供试品中蛋白质的含量。

(2)取供试品溶液,照紫外-可见分光光度法(2010年版药典二部附录Ⅳ A),在280nm与260nm的波长处测定吸光度,按下式计算供试品中蛋白质的含量。

蛋白质浓度(mg/ml)=1.45×A280-0.74×A260

13 附录Ⅶ N 合成多肽中的醋酸测定法

本法系用高效液相色谱法[1]测定合成多肽中醋酸或醋酸盐的含量。除另有规定外,按下列方法测定。

13.1 对照品溶液的制备

取冰醋酸适量,精密称定,用流动相A-流动相B(95:5)的混合溶液定量稀释制成每1ml中约含0.1mg的溶液(对照品溶液的浓度可随供试品中醋酸的含量作适当调整)。

13.2 供试品溶液的制备

照各品种项下规定的方法制备(取样量应根据其醋酸含量而定)。

13.3 色谱条件及系统适用性试验

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(250mm×4.6mm,5μm);以磷酸溶液(在1000ml水中加磷酸0.7ml,用0.42%氢氧化钠溶液调节pH值至3.0)为流动相A;甲醇为流动相B;流速为每分钟1.2ml;检测波长为210nm。[1]按下表进行梯度洗脱。理论板数按醋酸峰计算应不低于2000。醋酸峰的保留时间约在3~4分钟。梯度洗脱开始后,多肽被洗脱,基线急剧升高。

时间/分

流动相A/%

流动相B/%

0~5

5~10

10~20

20~22

22~30

95

50

50

95

95

5

50

50

5

5

13.4 测定法

精密量取对照品溶液和供试品溶液各10μl,分别注入液相色谱仪,记录色谱图,按外标法以峰面积计算多肽中醋酸的含量。

14 参考资料

  1. ^ [1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版:第一增补本[M].北京:中国医药科技出版社,2010.

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