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肿瘤相关抗原

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1 拼音

zhǒng liú xiāng guān kàng yuán

2 英文参考

MG-AgSS

TAA

tumor associated antigen

tumor association antigen

tumor-associated antigen

3 检查名称

肿瘤相关抗原

4 分类

血清学检查/肿瘤免疫检测

5 肿瘤相关抗原的别名

MG-AgSS

6 概述

应用杂交瘤研制出了12种鼠抗人胃癌单克隆抗体免疫组化证实本组单克隆抗体相应抗原存在于胃癌、结肠癌食管癌组织中,而不存在于正常组织和其他癌组织中。抗原分析表明本组单克隆抗体的相应抗原是一种新的肿瘤相关抗原。

7 原理

本法是标记抗原(Ag·)和非标记抗原(Ag)对特异性抗体(Ab)的竞争抑制反应,其反应为Ag·+Ag+Ab(Ag·Ab)+(AgAb)。当Ag·和Ab的量保持恒定,Ag与Ag·之和大于Ab上的有效结合点的数目,在该条件下,Ag与Ag·间存在着函数关系,亦即随着Ag浓度增加,Ag-Ab生成量多,而Ag·-Ab的数量则减少,游离的Ag·就增多。因为Ag·对Ab的结合,可因Ag竞争结合而遭抑制。反之,当Ag量少时,Ag-Ab生成量就少,Ag·-Ab量增多,而游离的Ag·减少(图1)。将结合的抗原抗体复合物(B)与游离抗原(F)分离,分别测定B和F的放射活性,计算出B/F或B/B+F值,可制出B/F或B/B+p对Ag量的关系曲线图。测定时,需用一系列已知浓度的Ag和一定量Ag·及相应抗体Ab混合,然后测出各标准浓度Ag参加下的Ag·-Ab放射结合率(B/B+F)或(B/F),绘出竞争抑制标准曲线(图2)。试验时,在同样条件下,根据被测Ag的放射性结合率,从标准曲线上查知相应Ag含量。

8 试剂

(1)抗原的纯化:试验需用高纯度的抗原。通常,蛋白质抗原的纯度应达到电泳分析纯,电泳后仅显示单一区带,并具有足够或完整的免疫原性。一般先经聚丙烯酰胺电泳鉴定,再用等电聚焦SDS聚丙烯酰胺双相电泳鉴定为单一区带,然后用于免疫动物核素标记。

纯抗原因其溶液中缺乏其他蛋白质作稳定剂,或因贮存在纯离子浓度的缓冲液中,故易形成聚合物,因此在纯化抗原时需加注意。若采用聚合物抗原的标记,用于RIA中将会显著增加非特异性结合,降低测定的灵敏度

(2)抗原的标记方法:标记用的核素有γ射线和β射线两大类。前者常用131I、125I、51Cr,后者多用3H、32P和14C。选择放射性核素首先要考虑比放射性,比放射性愈高,参与反应的抗原化学量就愈小,测定方法的灵敏度相对就愈高。核放射性和半衰期要适宜,便于使用和防护。标记后的抗原要保持其免疫原性。标记技术要简便、经济。

标记方法有直接标记和间接标记两大类,以最常用的125I为例分述如下。

①直接标记:将125I直接结合于蛋白质侧链残基的酪氨酸上,步骤单一,操作简便,标记物的比放射性较高,但此法仅能用于标记含酪氨酸的化合物,如所含的酪氨酸残基为蛋白质的特异性和生物活性所必需,则该活性易因标记而失活。

最常用的直接标记法为氯胺T标记法(简称h-T):氯胺T是对甲基苯磺基酰胺的N氯衍生物的钠盐,在水溶液中分解形成次氯酸成为一种氧化剂。在偏碱溶液中(pH值7.5)能使带负电荷的125I离子(Na-125I)氧化成带正电荷的125I离子,借以取代蛋白质酪氨酸苯环的氢,形成二碘酪氨酸。

125I标记率的高低与抗原(蛋白质或多肽分子中酪氨酸的含量及其在分子中的暴露程度有关。

标记方法的原则是将纯化抗原和125I加入小试管底部,继将配制的氯胺T快速冲入,混匀振荡1~2min后加入偏重亚硫酸钠终止反应。再加碘化钾溶液稀释,然后在葡聚糖G50柱上分离,分别用井型闪烁计数器测定放射性强度(脉冲数/min、cpm),前部为标记抗原峰,后部为游离125I峰。在标记抗原峰试管中加等量1%白蛋白作为稳定剂即为标记抗原液。

②间接标记:是先将125I标记在载体上,纯化后再与蛋白质或肽抗原结合,用N琥珀酰亚胺-3-[4-羟5-(125I)碘苯]丙酸盐(NSHPP)作为间接标记试剂,该试剂的N琥珀酰亚胺基与多肽游离氨基缩合为结合物,使125I标记的苯基与蛋白质的氨基结合。

本法先以氯胺T使125I接上NSHPP,由于在水溶液中它迅速水解为3-(4-羟苯基)丙酸,故在碘化反应中要尽快减少这种水解作用。这种碘标记物必须从水箱抽提到有机溶液中去,再除去有机溶剂后,使125I-NSHPP与蛋白质结合,制成125I-NSHPP-蛋白质标记物。

本法可标记缺乏酪氨酸残基的多肽,其最大优点是不损伤蛋白质的活性,能保存标记物高度的酶活性免疫活性,适合于对不稳定的蛋白质标记,缺点是操作复杂,标记率低。

(3)标记抗原的鉴定:为保证放射免疫测定的质量,制备的标记物必需作如下鉴定:

游离放射性碘的含量  用三氯乙酸将所有蛋白质沉淀,分别测定沉淀物和上清液的cpm值。一般要求游离碘占总放射性碘的5%以下。标记抗原贮存过久时,可出现标记物的解离,一旦超过5%则应废弃。

免疫活性  用小量标记抗原加过量抗体,反应后分离B和F,分别测定其放射性,算出百分结合率,此值应在80%以上,值越大,表示损伤抗原越少。

放射强度  它是指单位重量抗原的放射强度,比放射性越高,测定越敏感。标记抗原的比放射性以125I的标记率或利用率表示。

(4)抗体的制备和鉴定  RIA中所用的抗体应具有高亲和力和高特异性,制备高价单相抗血清,最好以标记用的纯化抗原免疫动物,制备半抗原的抗血清,需先将半抗原与载体结合,使成免疫原,常用的载体为牛血清白蛋白。

抗血清同样也要加以严格鉴定,包括其灵敏度、亲和力和特异性。在固定量标记抗原与不同浓度的抗血清作用的条件下,测定B/F值,制得一条B/F值对不同稀释度抗血清的曲线图(图3),该曲线的直线部分上段的斜率是抗体最大亲和力的定性标志,也是灵敏度的标志。斜率越大,RIA灵敏度越高,在许多RIA反应系统中,呈最大灵敏度的抗体浓度为B/F=1。

当采用固定量的抗体(Q0)与不同浓度的抗原作用时,以B/F对B作图,所得曲线的斜率就是亲和常数(Ka)的负数(图4)。

在RIA反应系统中,测定结构相似的不同物质时,可以鉴定抗体的特异性。

9 操作方法

本法分三个步骤,即抗原与抗体反应、B和F分离和放射性测定。

(1)抗原与抗体反应:将标本(非标记抗原)、标记抗原和抗血清顺序定量加入小试管内,置室温(15~30℃)作用24h,使其充分竞争结合。

(2)B、F分离:分离技术多种多样,常用沉淀法。①第二抗体沉淀法:又称双抗体法,在受检抗原与第一抗体特异性反应后加入相应的第二抗体,使形成的抗原-第一抗体-第二抗体的复合物共沉,一经离心即可使结合标记抗原B与游离抗原F分离。本法是特异性沉淀,分离完全,非特异性结合力低。但第二抗体用量较大,成本较高。此外血清浓度、抗凝剂的有无因素可在一定程度上影响结果。②聚乙二醇PEG)沉淀法:使蛋白质处于等电点状态,水化层破坏而导致蛋白质沉淀。本法优点是PEG制备方便、价廉、分离快速,缺点是非特异沉淀物较多,分离不完全。③第二抗体-聚乙二醇沉淀法:本法既有PEG法的快速沉淀优点,且保持第二抗体特异性沉淀的作用,又减少第二抗体用量,并降低PEG浓度,使非特异沉淀物减少。④活性炭吸附法:利用活性炭表面活性将小分子的游离部分吸附。如在活性炭表面涂上一层葡聚糖,使它表面具有一定孔径的网眼,从而允许小分子游离抗原或半抗原逸入而被吸附,而大分子复合物则被排斥在外。在抗原与抗体反应后,加入葡聚糖-活性炭,放置5~10min,使游离抗原吸附在活性炭颗粒上,离心使颗粒沉淀,上清液中含有结合的标记抗原。

(3)放射性强度测定:B和F分离后,即可测定其放射性强度。测量仪器有两类:液体闪烁计数仪(测β射线)和晶体闪烁计数仪(测γ射线)。计数单位是探测器输出的电脉冲数,单位为cpm(脉冲数/min)。

每次测定均需作一标准曲线图,以标准抗原的不同浓度为横坐标,以测到的相应放射性强度为纵坐标作图。放射性强度可任选B或F,亦可采用计算值B/B+F、B/F或B/B0。标本应作双份测定,取其平均值,在标准曲线上查出相应的受检抗原浓度。

10 正常值

肿瘤疾病胸腹水:<27kU/L。

11 化验结果临床意义

应用单克隆抗体MG7,MG9,MGb1,MGc1和MGd1混合物免疫放射分析法,测定了胸腹水中肿瘤相关抗原MG-Ags,发现胃癌和肺癌患者胸腹水中MG-Ags平均含量及阳性率明显高于结核性胸膜炎、门脉性肝硬化卵巢癌腹水中MG-Ags未见升高。6例肺癌胸水第一次细胞病理学检查未找到癌细胞,而免疫放射分析发现其中4例MG-Ags升高。揭示采用IRMA法测定胸腹水MG-Ags有助于瘤性浆膜炎的诊断,并在一定程度上判别瘤细胞的原发脏器。

12 附注

肿瘤相关抗原对肺癌的检出率仅占28.6%,但对肺鳞癌的检出率可占44.4%,与CYFRA-21-1联合检测可提高阳性率。

13 相关疾病

胃癌

结肠癌

食管癌

腹水

肺癌

结核性胸膜炎

肝硬化

相关文献

开放分类:化验及医学检查血清学检查肿瘤免疫检测
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  • 评论总管
    2019/9/16 8:49:54 | #0
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本页最后修订于 2013年2月21日 星期四 10:42:24 (GMT+08:00)
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