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荧光抗体技术

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1 拼音

yíng guāng kàng tǐ jì shù

2 英文参考

fluorescentantibodytechnique

3 概述

Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术(fluorescentantibodytechnique)。荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一种。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合,利用抗原抗体反应进行组织细胞内抗原物质的定位。

由于一般荧光测定中的本底较高等问题,荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。近年来发展了几种特殊的荧光免疫测定,与酶免疫测定和放射免疫分析一样,在临床检验中应用。

4 荧光现象

4.1 荧光的产生

一此化学物质能从外界吸收并储存能量(如光能、化学能等)而进入激发态,当其从激发态再回复到基态时,过剩的能量可以电磁辐射的形式放射(即发光)。

荧光发射的特点是:可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光;而一旦停止供能,发光(荧光)现象也随之在瞬间内消失。

可以引起发荧光的能量种类很多,由光激发所引起的荧光称为致荧光。由化学应所引起的称为化学荧光,由X线阴极射线引起的分别称为X线荧光或阴极射线荧光。荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。

4.2 荧光效率

荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光,总或多或少地以其他形式释放。荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率,与发射荧光光量子数值成正比。

荧光效率=发射荧光的光量分子数(荧光强度)/吸收光的光量子数(激发光强度

发射荧光的光量子数亦即荧光强度,除受激发光强度影响外,也与激发光的波长有关。各个荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱(荧光光谱),即在某一特定波长处有最大吸收峰和最大发射峰。选择激发光波长量接近于荧光分子的最大吸收峰波长,且测定光波量接近于最大发射光波峰时,得到的荧光强度也最大。

4.3 荧光的猝灭

荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭,这是由于激发态分子的电子不能回复到基态,所吸收的能量无法以荧光的形式发射。一些化合物有天然的荧光猝灭作用而被用作猝灭剂,以消除不需用的荧光。因此荧光物质的保存注意避免光(特别是紫外光)的直接照射和与其他化合物的接触。在荧光抗体技术中常用一些非荧的色素物质如亚甲蓝、碱性复红。伊文思蓝或低浓度的过锰酸钾、碘溶液等对标本进行得当复染,以减弱非特异性荧光本质,使特异荧光更突出显示。

5 荧光物质

5.1 荧光色素

许多物质都可产生荧光现象,但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有:

1.异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)为黄色或橙黄色结晶粉末,易溶于水或酒精溶剂。分子量为389.4,最大吸收光波长为490495nm,最大发射光波长520530nm,呈现明亮的黄绿色荧光,结构式如下:

有两种同分异结构,其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好,在冷暗干燥处可保存多年,是应用最广泛的荧光素。其主要优点是:①人眼对黄绿色较为敏感,②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。

2.四乙基罗丹明(rhodamine,RIB200)为橘红色粉末,不溶于水,易溶于酒精和丙酮。性质稳定,可长期保存。结构式如下:

最大吸收光波长为570nm,最大发射光波长为595~600nm,呈橘红色荧光。

3.四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC)结构式如下:

最大吸引光波长为550nm,最大发射光波长为620nm,呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明,可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合,但荧光效率较低。

5.2 其他荧光物质

1.酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应,一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮,后者可发出荧光,激发光波长为360nm,发射光波长为450nm。其他如碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基乙酸等。

2.镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕(Eu3+)、铽(Tb3+)、铈(Ce3+)等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光,其中以Eu3+应用最广。Eu3+螯合物的激发光波长范围宽,发射光波长范围窄,荧光衰变时间长,最适合用于分辨荧光免疫测定。

6 荧光抗体的制备

6.1 抗体的荧光素标记

用于标记的抗体,要求是高特异性和高亲和力的。所用抗血清中不应含有针对标本中正常组织的抗体。一般需经纯化提取IgG后再作标记。作为标记的荧光素应符合以下要求:①应具有能与蛋白质分子形成共价健的化学基团,与蛋白质结合后不易解离,而未结合的色素及其降解产物易于清除。②荧光效率高,与蛋白质结合后,仍能保持较高的荧光效率。③荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。④与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化免疫性质。⑤标记方法简单、安全无毒。⑥与蛋白质的结合物稳定,易于保存。

常用的标记蛋白质的方法有搅拌法和透析法两种。以FITC标记为例,搅拌标记法为:先将待标记的蛋白质溶液用0.5ml/LpH9.0的碳酸盐缓冲液平衡,随后在磁力搅拌下逐滴加入FITC溶液,在室温持续搅拌4~6h后,离心,上清即为标记物。此法适用于标记体积较大,蛋白含量较高的抗体溶液。优点是标记时间短,荧光素用量少。但本法的影响因素多,若操作不当会引起较台强的非特异性荧光染色。

透析法适用于标记样品量少,蛋白含量低的抗体溶液。此法标记比较均匀,非特异染色也较低。方法为:先将待标记的蛋白质溶液装入透析袋中,置于含FITC的0.01mol/LpH9.4碳酸盐缓冲液中反应过夜,以后再对PBS透析法去除游离色素。低速离心,取上清。

标记完成后,还应对标记抗体进一步纯化以去除未结合的游离荧光素和过多结合荧光素的抗体。纯化方法可采用透析法或层析分离法。

6.2 荧光抗体的鉴定

荧光抗体在使用前应加以鉴定。鉴定指标记包括效价及荧光素与蛋白质的结合比率。抗体效价可以用琼脂扩散法进行滴定,效价大于1:16者较为理想。荧光素与蛋白质结合比率(F/P)的测定和计算的基本方法是:将制备的荧光抗体稀释至A2801≈1.0,分别测读A280(蛋白质特异吸收峰)和标记荧光素的特异吸收峰,按公式计算。

F/P值越高,说明抗体分子上结合的荧光素越多,反之则越少。一般用于固定标本的荧光抗体以F/P=1.5为宜,用于活细胞染色的以F/P=2.4为宜。

抗体工作浓度的确定方法类似ELISA接法中酶标抗体的滴定。将荧光抗体自1:4~1:256倍比稀释,对切片标本作荧光抗体染色。以能清晰显示特异荧光、且非特异染色弱的最高稀释度为荧光抗体工作浓度。

荧光抗体的保存应注意防止抗体失活和防止荧光猝灭。最好小量分装,-20℃冻存,这样就可放置3~4年。在4℃中一般也可存放1~2年。

7 免疫荧光显微技术

免疫荧显微技术的基本原理是:使荧光抗体与标本切片中组织或细胞表面的抗原进行反应,洗涤除去游离的荧光抗体后,于荧光显微镜下观察,在黑暗背景上可见明亮的特异荧光。

7.1 标本的制作

荧光显微技术主要靠观察切片标本上荧光抗体的染色结果作为抗原的鉴定和定位。因此标本制作的好坏直接影响到检测的结果。在制作标本过程中应力求保持抗原的完整性,并在染色、洗涤和封埋过程中不发生溶解变性,也不扩散至临近细胞或组织间隙中去。标本切片要求尽量薄些,以利抗原抗体接触和镜检。标本中干扰抗原抗体反应的物质要充分洗去,有传染性的标本要注意安全。

常见的临床标本主要有组织、细胞和细菌三大类。按不同标本可制作涂片、印片或切片。组织材料可制备成石蜡切片或冷冻切片。石蜡切片因操作烦琐,结果不稳定,非特异反应强等已少应用。组织标本也可制成印片,方法是用洗净的玻片轻压组织切面,使玻片粘上1~2层组织细胞。细胞或细菌可制成涂片,涂片应薄而均匀。涂片或印片制成后应迅速吹干、封装。置-10℃保存或立即使用。

7.2 荧光抗体染色

于已固定的标本上滴加经适当稀释的荧光抗体。置湿盒内,在一定温度下温育一定时间,一般可用25~37℃30min,不耐热抗原的检测则以4℃过夜为宜。用PBS充分洗涤,干燥。

7.3 荧光显微镜检查

经荧光抗体染色的标本,需要在荧光显微镜下观察。最好在染色当天即作镜检,以防荧光消退,影响结果。

荧光显微镜检查应在通风良好的暗室内进行。首先要选择好光源或滤光片。滤光片的正确选择是获得良好荧光观察效果的重要条件。在光源前面的一组激发滤光片,其作用是提供合适的激发光。激发滤光片有两种。MG为紫外光滤片,只允许波长275~400nm的紫外光通过,最大透光度在365nm;BG为蓝紫外光滤片,只允许波长325~500nm的蓝外光通过,最大透光度为410nm。靠近目镜的一组阻挡滤光片(又称吸收滤光片或抑制滤光片)的作用是滤除激发光,只允许荧光通过。透光范围为410~650nm,代号有OG(橙黄色)和GG(淡绿黄色)两种。观察FITC标记物可选用激发滤光片BG12,配以吸收滤光片OG4或GG9。观察RB200标记物时,可选用BG12与OG5配合。

7.4 实验的类型

1.直接法用特异荧光抗体直接滴加于标本上,使之与抗原发生特异性结合(图17-1)。本法操作简便,特异性高,非特异荧光染色因素少;缺点是敏感度偏低,每检查一种抗原需制备相应的特异荧光抗体。

图17-1 直接免疫荧光法原理示意图

2.间接法可用于检测抗原和抗体,原理见图17-2。本法有两种抗体相继作用,第一抗体为针对抗原的特异抗体,第二抗体(荧光抗体)为针对第一抗体的抗抗体。本法灵敏度高,而且在不同抗原的检测中只需应用一种荧光抗体。

图17-2 间接免疫荧光法原理示意图

图17-3 补体结合免疫荧光法原理示意图

3.补体结合法本法是间接法的第一步抗原抗体反应时加入补体(多用豚鼠补体),再用荧光标记的抗补体抗体进行示踪(图17-3)。本法敏感度高,且只需一种抗体。但易出现非特异性染色,加之补体不稳定,每次需采新鲜豚鼠血清,操作复杂。因此较少应用。

4.标记法本法用FITC及罗丹明分别标记不同的抗体,而对同一标本作荧光染色。在有两种相应抗原存在时,可同时见到橙红和黄绿两种荧光色泽。

8 荧光抗体技术在医学检验中的应用

荧光抗体技术在临床检验上已用作细菌、病毒寄生虫的检验及自身免疫病的诊断等。在细菌学检验中主要用于菌种的鉴定。标本材料可以是培养物、感染组织、病人分泌排泄物等。本法较其他鉴定细菌的血清学方法速度快、操作简单、敏感性高,但在细菌实验诊断中,一般只能作为一种补充手段使用,而不能代替常规诊断。荧光抗体染色法对脑膜炎奈氏菌、痢疾志贺菌、霍乱弧菌、布氏杆菌炭疽杆菌等的实验诊断有较好效果。荧光间接染色法测定血清中的抗体,可用于流行病学调查和临床回顾诊断。免疫荧光用于梅毒螺旋体抗体的检测是梅毒特异性诊断常用方法之一。免疫荧光技术在病毒学检验中有重要意义,因为普通光学显微镜看不到病毒,用荧光抗体染色法可检出病毒及其繁殖情况。

寄生虫感染诊断中,间接荧光抗体染色法有非常广泛的应用。间接免疫荧光试验(IFAT)是当前公认的最有效的检测疟疾抗体的方法。常用抗原为疟疾患者血液中红内期裂殖体抗原。IFAT对肠外阿米巴、尤其是阿米巴肝脓肿也有很高的诊断价值,所用抗原是阿米巴培养物悬液或提取的可溶性抗原。

免疫荧光法还是检测自身抗体的好工具,在自身免疫病的实验诊断中应用广泛。其突出优点是能以简单方法同时检测抗体和与抗体起特异反应的组织成分,并能在同一组织中同时检查抗不同组织成分的抗体。主要有抗核抗体抗平滑肌抗体抗线粒体抗体等。抗核抗体的检测最常采用鼠肝作核抗原,可做成冰冻切片、印片或匀浆。用组织培养细胞如Hep-2细胞或Hela细胞涂片还可检出抗着丝点抗体、抗中性粒细胞浆抗体等。应用免疫荧光技术可以检出的其他自身抗体有抗(胃)壁细胞抗体、抗双链DNA抗体、抗甲状腺球蛋白抗体抗甲状腺微粒体抗体、抗骨髓肌抗体及抗肾上腺抗体等。

荧光抗体技术的一种特殊应用是流式细胞分析(flowcytometry)。在这种分析方法中检测仪器不是荧光显微镜,检测对象不是固定了的标本,而是将游离细胞作荧光抗体特异染色后,在特殊设计的仪器中通过喷嘴逐个流出,经单色激光照射发出的荧光信号由荧光检测计检测,并自动处理各处数据。这种方法可用于检测细胞大小、折散率、粘滞度等,更常用于T细胞亚群等的检测。

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开放分类:手术
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  • 评论总管
    2019/8/21 15:56:55 | #0
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本页最后修订于 2012年3月12日 星期一 11:01:17 (GMT+08:00)
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