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血清蛋白电泳

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1 拼音

xuè qīng dàn bái diàn yǒng

2 英文参考

serum protein electrophoresis

SPE

SPEP

3 概述

蛋白质等生物分子缓冲液中带负电荷或正电荷,在电场中向阳极或阴极运动,称为电泳(electmphomsis)。由于其等电点不同,分子大小形状和荷质比的不同,使不同蛋白质分子具有不同的电泳迁移率,在一定的支持介质中可借以分离各种蛋白质。常用的电泳技术有:醋酸纤维素薄膜电泳、琼脂凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳免疫电泳等。血清蛋白电泳以醋酸纤维素薄膜应用最为普遍。

4 血清蛋白电泳的别名

SPE

5 血清蛋白电泳的医学检查

5.1 检查名称

血清蛋白电泳

5.2 分类

血液生化检查 > 蛋白质测定

5.3 取材

血液

5.4 血清蛋白电泳的测定原理

血清中各种蛋白质都有其特有的等电点,各种蛋白质在各自的等电点时呈电中性状态,它的分子所带正电荷与所带负电荷量相等。将蛋白质置于pH比值等电点较高的缓冲液中,它们将形成带负电荷的质点,在电场中均向正极泳动。由于血清蛋白质的等电点不同,带电荷的量多少差异,蛋白质分子量大小也不同,所以在同一电场中泳动速度也不同。蛋白质分子越小带电越多,移动速度越快;分子越大而带电越少,移动速度越慢。按其泳动速度可以分出以下的主要区带,从正极端起,依次为白蛋白、α1球蛋白和α2球蛋白,β球蛋白和γ球蛋白5条区带。

5.5 试剂

(1)巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6±0.1、μ=0.06):以巴比妥2.21g、巴比妥钠12.36g于500ml蒸馏水中,加热溶解,待冷却至室温后加蒸馏水至1000ml。

(2)染色液:

①丽春红S染色液:丽春红9.04g、三氯醋酸6g,用蒸馏水溶解,并稀释至100ml。

氨基黑10B染色液:氨基黑10B 0.1g,溶于无水乙醇20ml中,加冰醋酸5ml甘油0.5ml使溶解。然后将磺柳酸2.5 g,溶于少量蒸馏水中,加入前液,再以蒸馏水补足至100ml。

(3)漂洗液:

①30ml/L醋酸溶液:用于丽春红染色的漂洗。

甲醇45ml,冰醋酸5ml和蒸馏水50ml混匀。用于氨基黑10B染色的漂洗。

(4)透明液:柠檬酸(C6H5Na3O7·2H2O)21g和N-甲基-吡咯烷酮150g,用蒸馏水溶解,并稀释到500ml。亦可选用氢萘或液体石蜡透明。

(5)0.4mol/L氢氧化钠溶液或0.1mol/L氢氧化钠溶液。

5.6 操作方法

(1)将缓冲液加入电泳槽内,调节两侧槽内的缓冲液,使其处于同一平面。

(2)醋酸纤维素薄膜的准备:取醋酸纤维素薄膜(2cm×8cm)在毛面的一端(负极侧)1.5cm处用铅笔轻划一横线,做点样标记。编号,并标明正、负极后,将薄膜置于巴比妥-巴比妥钠缓冲液中浸泡,待充分浸透后(一般为20min)取出,夹于洁净滤纸中间吸去多余的缓冲液。

(3)将醋酸纤维素薄膜毛面向上贴于电泳槽支架上拉直。用微量吸管吸取无溶血血清3~5μl于横线处沿横线加样,样品应与薄膜的边缘保持一定的距离,以免电泳图谱中的蛋白区带变形,待血清渗入薄膜后,反转薄膜,使光面朝上,平直地贴于电泳槽支架上,用双层滤纸或四层纱布将薄膜的两端与缓冲液连通,稍待片刻。

(4)接通电源,注意醋酸纤维素薄膜上的正、负极,切勿接错。电压90~150v,电流0.4~0.6mA/cm(不同的电泳仪所需电压,电流可能不同,应灵活掌握),夏季通电45min,冬季通电时间稍长,约为60min,电泳区带展开约25~35mm即可。

(5)染色:通电完毕,取下薄膜直接浸于丽春红S染液或氨基黑10B染色液中,染色5~10min(以白蛋白区带染透为止),然后在漂洗液中漂去剩余染料,直至背景无色为止。

(6)定量:

比色法:将漂洗的薄膜吸干,剪下各染色的蛋白区带入相应的试管中,在白蛋白管中加0.4mol/L氢氧化钠6ml(计算时吸光度乘以2),其余各管加3ml,振摇数次,置37℃水箱20min使其色泽浸出。氨基黑10B染色用分光光度计在620nm处读取各管吸光度,然后计算出各管的含量(同时做空白管对照)。

丽春红S染色时浸出液用0.1mol/L氢氧化钠,加入量同上法。10min后,白蛋白管内加400ml/L醋酸0.6ml(计算吸光度时乘以2),其余各管加0.3ml,以中和部分氢氧化钠,使色泽加深,必要时离心,取上清液用分光光度计在520nm处读取各管的吸光度(同时作空白对照),然后计算各自的含量。

光密度计扫描法:A.透明:吸去薄膜上的漂洗液(为防止透明液被稀释影响透明结果),将薄膜浸入透明液中2~3min,然后取出,以滚动的方式平贴于洁净无划痕的载物玻璃片上(切勿产生气泡),将此玻片竖立片刻,除去多余透明液后,置于恒温90℃至100℃的烘箱内,烘烤10~15min,取出冷却至室温,用此法透明的各蛋白区带鲜明,薄膜平整,可供直接扫描和永久保存(用氢萘或液体石蜡透明,应将漂洗过的薄膜烘干后进行透明,此法透明的薄膜不能存久,且易发生皱折)。B.扫描定量:将已透明的薄膜放入全自动光密度计或其他光密度计暗箱内,进行扫描分析

5.7 正常值

醋酸纤维素膜电泳法:白蛋白0.61~0.71(61%~71%)、α1球蛋白0.03~0.04(3%~4%),α2球蛋白0.06~0.10(6%~10%),β球蛋白0.07~0.11(7%~11%),γ球蛋白0.09~0.18(9%~18%)。

5.8 化验结果临床意义

(1)白蛋白减少:见于慢性肝炎肝硬化肝癌等。

(2)α1球蛋白(糖蛋白)增高:见于原发性肝癌。在重型肝炎、肝硬化、肝昏迷时则减少,与白蛋白呈正相关肝病时测定α1球蛋白对判断肝炎的严重程度和预后有参考价值。一般情况下,α1球蛋白增加示病情较轻,α1球蛋白减少则提示病情较重,在严重肝功能衰竭时,其血清含量可显著降低。

(3)α2球蛋白:病毒性肝炎初期无明显变化,一周后逐渐增加,亚急性肝炎和急性肝坏死、失代偿期肝硬化则减少。

(4)β球蛋白增高:见于脂肪肝高脂血症肾病综合征糖尿病合并高胆固醇血症、梗阻性黄疸恶性肿瘤。在胆汁淤积性肝病时其含量升高,与α2球蛋白升高相平行。降低于见于急、慢性肝炎,肝硬化,尤以失代偿期肝硬化和坏死肝硬化下降最为显著。

(5)γ球蛋白增高:见于慢性肝炎、肝硬化、肝胆疾患。典型肝硬化尚可见β和γ带相融合,形成β-γ桥。肝病患者γ球蛋白的变化可反映病情的严重程度。随病情好转,其含量可逐渐降至正常,如一直在高水平持续不降,提示病情严重,预后不良,并有向慢性肝炎及肝硬化发展的趋势。此外,感染血吸虫病多发性骨髓瘤结缔组织病等也可升高。降低见于丙种球蛋白缺乏症、部分化疗患者等。

另外,多发性骨髓瘤在β球蛋白区带与γ球蛋白区带之间常出现M球蛋白带;双白蛋白血症可见双条白蛋白区带。

5.9 附注

(1)每次电泳时应交换电极,可使两侧电泳槽内缓冲液的正、负离子互交换,从而使缓冲液保持在一定的pH水平,然而,每次电泳时薄膜数量不同,故缓冲液在使用10次后,最好弃去,重新配制,否则影响电泳效果。

(2)电泳槽内缓冲液高度保持一定,过低会出γ球蛋白的电渗现象(向阴极移动)。同时,电泳槽两侧液面应保持水平一致,否则通过薄膜时有虹吸现象,将会影响蛋白质分子的泳动速度。

(3)电泳失败的原因:

①电泳图谱不整齐:常见于点样不均匀,位置不佳,薄膜尚未干燥水分蒸发,缓冲液变质,电泳时薄膜位置放置不正确,使电流方向不平行等。

②蛋白组分分离不佳:如点样过多,电流过低,薄膜结构过分细致,透水性差,导电差等。

③白蛋白结果偏低:见于染色时间不足,染色液陈旧,不透明直接扫描等。

④薄膜透明不完全:见于温度未达到90℃以上将标本放入烘箱,透明液时间过长或薄膜的浸泡时间不足等。

⑤透明膜上有气泡:见于玻璃片不干净(油脂、污垢等)使薄膜部分与其脱开,贴膜时操作不慎将气泡裹入等。

(4)点加样本时,一定要注意薄膜的毛面和光面,将样本点在毛面上。

(5)放置薄膜时,要注意其正、负极,切勿接错。

5.10 相关疾病

肝硬化、原发性肝癌、昏迷、脂肪肝、高脂血症、肾病综合征、糖尿病、黄疸、多发性骨髓瘤

相关文献

开放分类:血液生化检查化验及医学检查蛋白质测定
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  • 评论总管
    2020/11/27 19:59:58 | #0
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本页最后修订于 2013年2月24日 星期日 11:15:31 (GMT+08:00)
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