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血红蛋白电泳

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1 拼音

xuè hóng dàn bái diàn yǒng

2 英文参考

HE

hemoglobin electrophoresis

3 概述

各种血红蛋白具有不同的等电点,在一定pH值缓冲液中可带不同电荷。在碱性缓冲液中带负电荷,反之带正电。在一定的电场中带有不同电荷的Hb分子可分别向正极或负极移动,其移动速度随Hb分子所带电荷的强弱而不同,结果形成各种区带——电泳图谱。从电泳图谱中可初步鉴别出各种异常血红蛋白,经光电比色或扫描的方法求其含量。

4 血红蛋白电泳的医学检查

4.1 检查名称

血红蛋白电泳

4.2 分类

临床血液检查 > 红细胞

4.3 取材

血液

4.4 血红蛋白电泳的测定原理

(1)微量血红蛋白电电泳:血红蛋白中的各组分由于其分子表面所带电荷性质与数量不同而等电点各异。在不同pH的电场中,因其所带电荷差异而泳动速度不同。由此可将血红蛋白的各组份分开。异常血红蛋白分子如果有电荷的改变,则会在正常电泳图形的其他部位出现异常区带,以达到分离鉴定的目的。

电泳法中,因所用支持物不同,有纸上电泳、琼脂电泳、淀粉胶电泳、淀粉板电泳、醋酸纤维素膜电泳等。所用的电泳缓冲液有pH8.6或8.9的巴比妥缓冲液,pH9.1、9.0、8.9及8.5的TEB缓冲液。pH16.8和7.0的磷酸缓冲液等。

目前临床实验室首选的是醋酸纤维素膜碱性电泳。该方法操作简易、电泳时间短,分辨率高,常用于异常血红蛋白的筛选。必要时再用pH6.5或pH6~6.2缓冲液的酸性电泳进一步进行异常血红蛋白的鉴别。

(2)异常肽链鉴定(尿素解离法):将巯基乙醇与尿素加入血红蛋白溶液后,可使血红蛋白分子中二硫键还原,空间结构被破坏,珠蛋白被裂解为肽链亚单位。不同肽链的等电点不同,迁移率各异,可用电泳将肽链分开。异常血红蛋白的异常肽链也可用此法分开,并根据其位置判断属何种异常。

4.5 试剂

4.5.1 (1)微量血红蛋白电电泳:

①TEB缓冲液(pH8.5,浸膜用):

三羟甲基氨基甲烷 (Tris) 10.2g EDTA 0.6g

硼酸(boric acid) 3.2g 蒸馏水 加至1000ml

BB缓冲液(电泳槽用):

硼砂 6.87g 硼酸 5.56g

蒸馏水 加至1000ml

③血红蛋白溶液:按前法制备的血红蛋白溶液稀释成30~50g/L。

④丽春红染液:

丽春红S染料 1.8g 三氯醋酸 26.8g

柳酸 26.8g 蒸馏水 加至1000ml

此为贮存液。最好用安瓿分装,每支2ml。用前按每毫升贮存液加蒸馏水19ml稀释。

脱色液3%醋酸溶液。

⑥透明液:

无水乙醇 70ml 冰醋酸 30ml

4.5.2 (2)醋酸纤维膜电泳染色比色法

①TEB缓冲液及BB缓冲液同微量血红蛋白电电泳。

②染色液:

氨基黑10B 0.5g 甲醇 50ml

冰醋酸 10ml 蒸馏水 40ml

溶解后贮存于棕色瓶内。

漂洗液:

乙醇(或甲醇) 45ml 冰醋酸 5ml

蒸馏水 50ml

④浸出液 NaOH 0.4mol/L。

(3)异常肽链鉴定(尿素解离法):

①解离液:

尿素5.4g β-巯基乙醇 2.0ml

TEB缓冲液(血红蛋白电电泳用,pH8.5)加至10ml

置于冰箱备用。

②浸膜液:

尿素 48g Tris 1.14g

EDTA-Na2 0.12g 硼酸 0.32g

蒸馏水 加至100ml

③电泳缓冲液(同血红蛋白电电泳BB缓冲液)。

④丽春红染液(同血红蛋白电电泳)。

⑤冼脱液(同血红蛋白电电泳)。

4.6 操作方法

4.6.1 (1)微量血红蛋白电电泳:

①浸膜:将醋酸纤维素膜漂浮于TEB缓冲液表面,待其均匀浸透沉下后,至少20min才可使用。这样可防止产生气泡。

②点样:取出醋酸纤维薄膜用滤纸吸去多余的水份。用微量吸管吸取血红蛋白溶液置于多标本加样器的凹型槽内,以多标本加样器蘸取血红蛋白液,点样于醋酸纤维素膜无光泽面。距阴极端1.5~2cm处,点样量约3~5μl同时平行地点上正常血红蛋白溶液作对照。

③电泳:在微型电泳槽两侧缓冲液槽内分别加入等量的BB缓冲液,以二层滤纸做盐桥搭在醋酸纤维薄膜支架上。将膜无光泽面向下,点样端接负极,平衡5min。接通电源。电压180V,电流量约为0.2mA/cm膜宽,电泳时间20~30min。槽中缓冲液可在倒换电极后再用1次。

④染色:电泳后的薄膜放在丽春红染色液中染色10min左右取出,用3%醋酸漂洗数次,至背景呈白色,阴干

⑤透明:将醋酸纤维素膜置透明液中浸湿,贴于洁净玻璃板上,用玻棒赶去二者之间的气泡。于一层析缸内倒少量冰醋酸,将玻璃板反盖在层析缸上(有薄膜面向内)。以挥发的冰醋酸熏10~20min,待膜透明即可取下。

4.6.2 (2)醋酸纤维素膜电泳染色比色法:

①将TEB缓冲液浸泡过的4cm×6cm的醋酸纤维素膜取出,用滤纸吸干多余水分。于无光泽面距阴极端1.5cm处,用血红蛋白吸管直线状均匀整齐地滴加50g/L Hb溶液约5μl,待血红蛋白液渗入膜内后,将膜翻转置电泳槽支持板的滤纸桥上。

②电泳:电压180V,时间30~40min,以Hb各区带完全分离为准。电泳后交换电极,电泳缓冲液可多次使用。

③染色:将膜浸入染色液中,冬天需染2h,夏天或将染缸置25~30℃.可只染30min左右。注意如染色不透(如时间太短或血红蛋白溶液过浓),或电压过高使HbA带过于集中,易致色带剥脱,均影响定量的准确性。染毕用漂洗液洗数次,至背景漂净为止。

④定量:将漂净的膜取出,分别剪下各区带,及相当于HbA2大小的对照区带,各自放在相应的试管中。于HbA管中加浸出液10ml,其余各管加浸出液2ml,浸泡20min,时时振摇。使色带完全洗脱(注意在气温较高时,洗脱时间不可过长,否则洗脱液蓝色减退,并逐步变为紫红色)。将洗脱液混匀,用721分光光度计,波长620nm,以空白调零,测各管吸光度。

⑤计算:同直接比色法。

4.6.3 蜡酸纤维薄膜电泳直接比色法

试剂:同醋酸纤维素膜微量血红蛋白电电泳。

操作:

(1)将醋酸纤维素膜作1/3切开(4cm×8cm)漫于TEB缓冲液中,10min以上。

(2)取出醋酸纤维素膜用滤纸吸去多余的水份。以Hb吸管吸取100g/L溶血液10μl均匀涂于玻璃推片下缘,在距薄膜阴极端1.5~2.0cm处于无光泽面点样。每个标本同时做两份。

(3)电泳:缓冲液同微量血红蛋白电电泳。电压180V,时间40min~1h。(以各区带明显分开为宣)电泳后交换电极,缓冲液可反复使用。

(4)洗脱与定量 分别剪下HbA,HbA2和相当于HbA2大小的对照区带。如有异常Hb区带(HbX)也同时剪下,各自放在相应的试管中。于HbA管中加TEB缓冲液10ml,其余各管加TEB缓冲液2ml,浸泡30min,时时振摇。待完全洗脱后。将

洗脱液混匀,用721分光光度计,波长413nm。以空白调零,测各管吸光度。

(5)计算:

如有异常HbX,则计算HbA2%时,分母中还要加:HbX吸光度。

HbX%=

4.7 正常值

电泳法:

HbA 95%

HbA2 1.1%~3.2%

HbA3 2%~3%

Singer法:HbF<4%

4.8 化验结果临床意义

(1)增高:重型地中海贫血(HbA2、HbF增高)、轻型β-地中海贫血(HbA2 4%~10%)

(2)降低(HbA2):缺铁性贫血铁粒幼细胞性贫血

4.9 相关疾病

缺铁性贫血

相关文献

开放分类:化验及医学检查临床血液检查红细胞
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  • 评论总管
    2019/4/21 14:49:08 | #0
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本页最后修订于 2013年2月24日 星期日 15:37:53 (GMT+08:00)
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