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细胞毒试验

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1 拼音

xì bāo dú shì yàn

2 英文参考

cytotoxicity test

3 操作名称

细胞毒试验

4 用品及准备

4.1 材料

①50μl加样器;②250μl加样器;③微量反应板;④倒置显微镜;⑤医用液体石蜡油;⑥尼龙纤维棉和聚乙稀塑料管(管径6mm,长160mm)。

4.2 试剂

抗血清

②兔补体,无天然细胞毒性效价合格的混合兔血清。

③5%伊红-Y溶液

④12%福马林(pH7.0~7.4)。

⑤对照组:阳性对照,用兔抗人淋巴细胞血清抗B淋巴细胞血清;阴性对照,灭活正常人AB型混合血清。

⑥淋巴细胞分离液(比重1.077±0.02)。

⑦Hanks液(pH6.8~7.4)。

⑧20%小牛血清-RPM1640培养液。

⑨淋巴细胞洗涤液和淋巴细胞保存液。

5 方法及内容

(1)向Terasaki反应板的每孔加10μl液体石蜡油。

(2)每反应板最后两孔分别加阳性和阴性对照血清,其余每孔加已知或待检血清1μl。

(3)每孔加的淋巴细胞悬液或B淋巴细胞悬液1μl,并轻轻摇动,使其与抗血清完全混匀。

(4)室温(20℃±2℃)培养30min,B细胞置于37℃温育箱1h。

(5)每孔加兔补体5μl,充分混匀,室温培养1h,B细胞2h。

(6)每孔加入5%伊红Y3μl,作用1~3min。

(7)每孔加入12%福马林8μl,室温静置1~2h或4℃冰箱过夜,置显微镜下观察结果。

6 注意事项

淋巴细胞毒试验方法有影响的因素很多,所以一般需做多个复本。

(1)淋巴细胞:①纯度:沾染的颗粒细胞吸收抗体红细胞血小板可使计数时间减慢,而引起计数误差。②浓度:细胞浓度过低,无法计数,其准确性大大下降,细胞浓度大,造成淋巴细胞集聚成团,影响结果。③pH值:中性为宜,过酸影响细胞致敏,过碱易造成假阳性

(2)抗血清:细胞溶解和抗血清效价低也是引起计数误差的常见原因。

(3)加入补体要充足,以克服抗补体因子。

(4)染料离心除去沉淀物与杂质。

(5)控制培养温度与时间。

7 结果判读

(1)使用倒置相差显微镜观察,计数每孔死细胞百分数。死细胞因透进了伊红Y染料色暗晦,无折光性,大而无立体感;活细胞有折光性,小而光亮。

(2)结果判读标准:1=细胞死亡0~10%;2=细胞死亡11%~20%;4=细胞死亡21%~40%;6=细胞死亡41%~80%;8=细胞死亡81%~100%。其中,1和2为阴性反应;4为可疑或弱阳性反应;6和8为阳性反应。

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  • 评论总管
    2019/9/21 13:26:27 | #0
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本页最后修订于 2009年12月28日 星期一 7:56:21 (GMT+08:00)
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