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物理图

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1 拼音

wù lǐ tú

2 注解

物理图是指标明一些界标(例如限制酶的切点、基因等)在DNA上的位置,图距以物理长度为单位,例如染色体的带区、核苷酸对数目等。人类基因组计划的研究目标是,构建人的每条染色体的STS图,标记之间相距约10Okb。获得一组组DNA片段的克隆,组内两两片段之间有共同的重叠序列;或是获得标记按正确次序排列、相互毗邻的片段,其连续长度超过2000kb,以便把染色体分段进行研究。

最通常的物理图的构建方法是把限制酶切的DNA片段,按其次序排列连接起来。作图的技术路线基本上分两类:一类是由长到短作图,另一类则是由短到长作图。前者是将基因组DNA用切点很少的限制酶如NotI等完全酶切,得到长约100~l000kb的DNA长(大)片段,每条染色体平均切成130个片段,按照片段上的标记把片段按次序排列,然后再把每一长片段酶切成短片段,再把短片段排列成序。这是由长到短的作图,图比较完整但分辨率低。后一类方法则是先将基因组DNA用限制酶作部分酶切,得到的短片段分别用酵母人工染色体(YAC)或粘粒等作载体加以克隆,然后根据克隆片段两端共有的序列即重叠序列,两两连接,逐渐延伸成长片段。这样作图分辨率较高,但图不完整往往留有空缺。这是因为有些酶切产生的DNA片段太短,不易被克隆,以致在通过重叠序列把片段连接时出现中断。一组相互邻接的DNA片段的克隆称为邻接DNA片段组(contig)。目前一个contig通常只有2~6个粘粒克隆,即所含的DNA片段相加只有100~300kb,如除去两两片段的重叠序列,则一个contig作图覆盖的DNA长度是有限的。现在要求在5年内做到一个contig能覆盖2000kb DNA,并带有几个标记。

在制作物理图时,重点发展的几种实验技术是:

(1)脉冲电场凝胶电泳,这是分离高分子量DNA的一种电泳技术,使DNA分子处在两个相互垂直、交替更换的电场中移动,把分子量不同的DNA片段分开,可分辨50kb至200kb的DNA分子。

(2)YAC克隆:YAC是由质粒pBR322、酵母的着丝粒、四膜虫rDNA的端粒、酵母的自主复制序列(ARS)以及一些选择标记基因构成。呈环状结构时,可以质粒方式在原核细胞中增殖复制。切成线状结构后,可连同插入的外源DNA,如染色体一样地在酵母细胞中复制、分配给子细胞。YAC作为载体,克隆的外源DNA平均300kb,最长的可达100Okb,稳定传递给子细胞。设计构建YAC时,在原核生物的复制起点〔Ori)上游安排一个限制酶切位点(如XhoI),当YAC载 有外源DNA后,只需用Xhol酶切,则靠近克隆位点的外源DNA上的XhoI切点,可与YAC的XhoI切点互补结合呈环状,按质粒进行复制和被回收。这种技术称为质粒获救。用这种方法可把外源DNA的末端分离出来,作为钓取与其邻接的、具有共同末端序列亦即重叠序列的另一DNA片段的探针。实际上这也就是染色体步移的操作。

(3)PCR(多聚酶链反应):体外扩增DNA的技术,在生物学医学等基础研究和临床诊断上有极其广泛的用途。在构建基因组物理图时,主要用于验证STS。

(4)荧光原位杂交:传统的以同位素标记探针作原位杂交,曝光后的颗粒较粗,定位不易精确。正在研究以荧光染料代替同位素,提高定位的精确度。

(5)辐射杂种细胞分析,这是利用体细胞遗传学的方法构建高分辨的染色体图的技术。人-鼠杂种细胞接受射线辐照后,染色体断裂,筛选出保留缺失程度不同的人染色体的杂种细胞,可用于构建大尺度染色体物理图。

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  • 评论总管
    2021/1/18 23:17:30 | #0
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本页最后修订于 2010年3月17日 星期三 12:38:51 (GMT+08:00)
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