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微生态活菌制品总论

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目录

1 拼音

wēi shēng tài huó jūn zhì pǐn zǒng lùn

2 英文参考

Microecologics for Therapeutic Use[2010年版药典]

3 微生态活菌制品总论药典标准

3.1 品名

3.1.1 中文名

微生态活菌制品总论

3.1.2 汉语拼音

Weishengtai Huojun Zhipin Zonglun

3.1.3 英文名

Microecologics for Therapeutic Use

3.2 定义、组成及用途

微生态活菌制品系人体正常菌群成员或具有促进正常菌群生长和活性作用的无害外籍细菌,经培养、收集菌体、干燥成菌粉后,加入适宜辅料混合制成。用于预防和治疗因菌群失调引起的相关症状和疾病。

微生态活菌制品必须由非致病的活细菌组成,无论在生产过程、制品贮存和使用期间均应保持稳定的活菌状态。它可由一株、多株或几种细菌制成单价或多价联合制剂。根据其不同的使用途径和方法可制备成片剂胶囊剂颗粒剂散剂等多种剂型

3.3 基本要求

微生态活菌制品的制备方法、工艺应能保证成品含有足够的活菌数量,保持其稳定性,同时应防止外源因子污染

生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。

3.4 制造

3.4.1 生产用菌种

生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定

3.4.1.1 1.名称及来源

选用的生产用菌种应来自人体内正常菌群,或对人体无毒无害、具有促进正常菌群生长和活性作用的外籍细菌。细菌的分离过程和传代背景应清晰,应具备稳定的生物学遗传学特性,并能保持稳定的活菌状态,经实验室和临床试验证明安全、有效。

3.4.1.2 2.种子批的建立

生产用菌种应按照“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定建立种子批系统。三级种子批应分别冻干,置适宜温度保存;种子批传代应限定传代次数,原始种子批主种子批启开后传代次数不得超过10代,工作种子批启开后至发酵培养传代次数不得超过5代。3.种子批的检定

菌种的属、种型分类鉴定,应依据最新版伯杰氏细菌系统鉴定手册(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology)和伯杰氏细菌命名手册(Bergey's Manual of Determinative Bacteriology)的有关规定进行,包括形态、生长代谢特性检查。原始种子或主种子还应做遗传特性和抗生素敏感性等检查。

三级种子批常规检查包括以下3项:

取菌种的新鲜培养物涂片做革兰氏染色,在显微镜下观察菌体的染色反应、形态、大小和排列等,有芽孢的细菌应同时观察芽孢的形状、大小和位置(也可增做芽孢染色)。检查结果均应符合原始菌种的特性。

(2)生化反应  按2010年版药典三部附录XIV“细菌生化反应培养基”选择相应的培养基或其他适宜的方法进行,结果应符合原始菌种的特性。

(3)毒性试验  毒性试验是通过动物试验检查菌种是否存在不安全因素,以保证人体使用安全。

用体重18~22g小鼠5只,每只腹腔注射0.3ml新鲜菌液(不少于1.0×109 CFU/0.3ml),连续观察3天,小鼠均应健康存活、体重增加;或每只小鼠经口灌胃0.5ml新鲜菌液(不少于1.0×109 CFU/0.5ml),每天1次,连续3天,从第1天灌胃起连续观察至第7天,小鼠均应健康存活、体重增加。

(2)遗传特性分析  可采用细菌DNA的G+C mol%的含量测定或其他适宜方法进行,应符合该菌种的遗传特性。

(3)抗生素敏感性试验  采用琼脂扩散纸片法或其他适宜方法进行菌株的抗生素敏感性检查,应符合该菌种的特性。

(4)稳定性试验  菌种在适宜培养基中,连续传代30代次后,将第30代培养物作种子批检定,全部检查结果应与原始菌种的特性一致。

3.4.1.3 4.种子批的保存

原始种子和主种子应冻干保存于8℃以下,工作种子应置于适宜温度保存。

3.4.2 菌粉制造

应包括种子液制备、大罐培养、收获菌体(或芽孢)和菌体干燥制成菌粉。如生产多价制品时,应每种菌分别培养,制备单价菌粉。

3.4.2.1 1.生产用种子

启开工作种子批菌种,接种子适宜培养基进行多级种子扩增,应涂片做革兰氏染色,在显微镜下观察5~10个视野,细菌的染色反应、形态应一致并符合原始菌种的特征。制备过程应防止污染,菌种传代次数应符合规定。

3.4.2.2 2.生产用培养基

采用经批准的培养基用于生产。

3.4.2.3 3.培养

采用液体培养。将种子液置适宜条件下培养(包括厌氧或需氧、温度、时间等),培养过程中取样涂片做革兰氏染色镜检、pH值检测等,芽孢菌需进行芽孢形成率的检测,均应符合规定。培养结束后取样做纯菌检查,如发现污染应予废弃。

生产多价制品的单价菌粉时,应分别培养。

3.4.2.4 4.收获菌体和制成菌粉

培养结束后离心收获湿菌体,与适宜的分散剂、稳定剂混合。采用真空冷冻干燥法干燥菌体,芽孢菌可采用加热干燥方法,再经粉碎、过筛制成粉末状菌粉。

3.4.2.5 5.菌粉的保存及有效期

应通过活菌稳定性试验确定保存温度和有效期。

3.4.2.6 6.菌粉检定

按“菌粉检定”项进行,符合规定后方可进行半成品配制。

3.4.3 半成品

3.4.3.1 1.配制

同一工作种子批菌种生产的最多2批单价菌粉可按批准的比例与辅料混合均匀后制成半成品。配制多价制品时,应将各单价菌粉、辅料按配方比例和配制程序混合均匀,配制过程应防止污染。

3.4.3.2 2.半成品检定

按“半成品检定”项进行,应符合规定。

3.4.4 成品

3.4.4.1 1.剂型制备

根据制品的用途、使用对象和用药途径等因素确定剂型。制备过程应符合2010年版药典三部附录Ⅰ 制剂通则”项下相关剂型的规定。

3.4.4.2 2.分批

成品批号应在半成品配制后确定,配制日期即为生产日期。同一批号的制品,应来源一致、质量均一,按规定要求抽样检验后,能对整批制品作出评定。应根据验证结果,规定半成品的分装时间,如超过24小时,应分为不同的亚批

3.4.4.3 3.分装、规格和包装

制品的分装应符合2010年版药典三部附录Ⅰ 制剂通则”的有关规定。包装应符合“生物制品包装规程”的有关规定。规格应符合批准的规格要求。

3.5 检定

微生态活菌制品质量检定应包括菌粉检定、半成品检定和成品检定。

3.5.1 菌粉检定

3.5.1.1 1.外观

应为白色、灰白色或灰黄色粉末。

3.5.1.2 2.目的菌检查

取少量菌粉加入适量灭菌生理氯化钠溶液或其他适宜稀释液后,涂布在适宜琼脂平皿上,在适宜条件下培养,其培养物的生长特性和染色镜检的特征应符合生产用菌种特征。

3.5.1.3 3.杂菌检查

方法和结果判断见本总论附录3。如不符合规定应废弃。

3.5.1.4 4.干燥失重

菌粉中残余水分的含量会直接影响活菌的生存,须进行菌粉干燥失重的检查。应按2010年版药典三部附录Ⅶ L或仪器方法测定。

3.5.1.5 5.活菌数测定

测定每克菌粉中含有的活菌数量。方法见本总论附录2。

3.5.2 半成品检定

半成品须做杂菌检查,根据用药途径确定杂菌检查的质控指标。方法和结果判断见本总论附录3。

3.5.3 成品检定

3.5.3.1 1.鉴别试验

检查成品中所含的目的菌是否符合生产用菌种的特性。即按上述“种子批的检定”方法进行生长特性、染色镜检和生化反应检查,应符合规定。对于多价制品,则须逐一检查单价菌特性。

3.5.3.2 2.理化检查
3.5.3.2.1 (1)外观

根据剂型,观察制品的外观、色泽

片剂外观应完整、光洁,呈白色或类白色,间有菌粉色斑;颗粒剂、散剂和胶囊剂内粉末的粒子大小、色泽应均匀,间有菌粉色斑。

3.5.3.2.2 (2)干燥失重

按2010年版药典三部附录Ⅶ L或仪器方法测定,减失重量应不得超过5.0%,芽孢菌制品应不得超过7.0%。

3.5.3.2.3 (3)粒度

散剂和颗粒剂应进行粒度检查。

2010年版药典三部附录Ⅴ G第二法,采用单筛分法或双筛分法检查,应符合规定。

3.5.3.2.4 (4)装量(重量)差异

各剂型按2010年版药典三部附录Ⅰ 制剂通则”的相应规定进行,应符合规定。

3.5.3.2.5 (5)崩解时限

胶囊剂、片剂按2010年版药典三部附录Ⅴ C进行,应符合规定。

3.5.3.3 3.活菌数测定

按本总论附录2方法测定每克制品中的活菌数,应符合规定。多价制品应分别测定各单价活菌数。

3.5.3.4 4.杂菌检查

目的是检查成品中外微生物的污染情况,以保证人体使用安全。

方法和结果判断与半成品的“杂菌检查”项相同。

3.5.3.5 5.安全试验

安全试验是通过动物试验进行的非特异性毒性检查,应根据制品的使用途径和人用剂量确定试验方法。

3.5.3.5.1 (1)肠道微生态活菌制品检查

称取2g制品,加入8ml生理氯化钠溶液中,混合均匀。用5只体重18~22g小鼠,每只小鼠经口灌胃0.5ml,每天1次,连续3天。自第1天灌胃起,连续观察7天,小鼠应健康存活、体重增加,判为合格。如不合格,可另选10只小鼠复试1次,判定标准同前。

3.5.3.5.2 (2)阴道微生态活菌制品检查

用24~26g雌性小鼠5只,每只小鼠阴道内置入10mg制品,每天1次,连续3天。自给药第1天起,连续观察7天,小鼠应健康存活、体重增加,阴道局部无红肿、分泌物等症状,判为合格。

3.6 保存、运输及有效期

按批准的温度保存和运输。自生产之日起,按批准的有效期执行。

3.7 附录

附录1  已批准上市的微生态活菌制品

附录2  微生态活菌制品活菌数测定法

附录3  微生态活菌制品杂菌检查法

3.8 使用说明

应符合“生物制品包装规程”规定和批准的内容。

3.9 附录1  已批准上市的微生态活菌制品

制品名称

细菌种类

双歧杆菌活菌胶囊

青春型双歧杆菌

双歧杆菌活菌散

青春型双歧杆菌

长型双歧杆菌

双歧杆菌三联活菌胶囊

嗜酸乳杆菌

粪肠球菌

长型双歧杆菌

双歧杆菌三联活菌肠溶胶囊

嗜酸乳杆菌

粪肠球菌

长型双歧杆菌

双歧杆菌三联活菌散

嗜酸乳杆菌

粪肠球菌

长型双歧杆菌

双歧杆菌乳杆菌三联活菌片

保加利亚乳杆菌

嗜热链球菌

地衣芽孢杆菌活菌胶囊

地衣芽孢杆菌

地衣芽孢杆菌活菌颗粒

地衣芽孢杆菌

地衣芽孢杆菌活菌片

地衣芽孢杆菌

蜡样芽孢杆菌活菌胶囊

蜡样芽孢杆菌

蜡样芽孢杆菌活菌片

蜡样芽孢杆菌

婴儿型双歧杆菌

双歧杆菌四联活菌片

嗜酸乳杆菌

粪肠球菌

蜡样芽孢杆菌

酪酸梭菌活菌胶囊

酪酸梭状芽孢杆菌

醋酸梭菌活菌散

酪酸梭状芽孢杆菌

酪酸梭菌活菌片

酪酸梭状芽孢杆菌

续表

制品名称

细菌种类

凝结芽孢杆菌活菌片

凝结芽孢杆菌

酪酸梭菌二联活菌胶囊

酪酸梭状芽孢杆菌

婴儿型双歧杆菌

酪酸梭菌二联活菌散

酪酸梭状芽孢杆菌

婴儿型双歧杆菌

枯草杆菌活菌胶囊

枯草芽孢杆菌

枯草杆菌肠球菌二联活菌多维颗粒

枯草芽孢杆菌

屎肠球菌

枯草杆菌肠球菌二联活菌胶囊

枯草芽孢杆菌

屎肠球菌

阴道用乳杆菌活菌胶囊

德氏乳杆菌

3.10 附录2  微生态活菌制品活菌数测定法

无菌称取3.0g制品或菌粉(胶囊取内容物),加入27.0ml稀释液中,充分摇匀,做10倍系列稀释(最终稀释度根据不同的指标要求而定)。取最终稀释度的菌液100μl,滴人选择性琼脂培养基平皿上,共做3个平皿,并以玻棒涂布均匀,置适宜条件下培养,到期观察每个平皿菌落生长情况,并计数。当平皿菌落数小于10或大于300时,应调整最终稀释度,重新测定。根据3个平皿菌落总数按下列公式计算活菌数:

活菌数(CFU/g) =3个平皿菌落数之和/3×10×最终稀释度

【附注】

(1)活菌数用“CFU”表示,即为细菌集落单位。

(2)稀释液使用灭菌生理氯化钠溶液或其他适宜的稀释液。

(3)选择性琼脂培养基,是指最适宜制剂(或菌粉)中活菌生长的培养基。须经批准后方可使用。

3.11 附录3  微生态活菌制品杂菌检查法

微生态活菌制品杂菌检查法系检查微生态活菌制品的菌粉、半成品及成品受外源微生物污染程度的方法。检查项目包括控制菌检查,非致病性杂菌、真菌计数。

杂菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作,防止再污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。

除另有规定外,本检查法中细菌培养温度为30~37℃;真菌培养温度为20~28℃。

3.11.1 检验量及供试品的准备

检验量,即一次试验所用的供试品量(g)。检验时,应从2个以上最小包装单位中随机抽取不少于3倍检验用量的供试品。

菌粉、半成品以及成品为散剂和颗粒剂的可直接称取备用;成品为片剂、胶囊剂的需研碎后备用。

3.11.1.1 控制菌检查
3.11.1.1.1 控制菌检查用培养基的适用性检查

控制菌检查用的培养基,即成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基,均应进行培养基的适用性检查。检查项目包括促生长、指示和抑制性能力。

3.11.1.1.2 菌种

试验所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第-代),并采用适宜的菌种保藏技术,以保证试验菌株的生物学特性。

大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC (B) 44102]

金黄色葡萄球菌(Staphylacoccus aureus) [CMCC(B) 26003]

乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B) [CMCC (B) 50094]

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) [CMCC (B) 10104]

生孢梭菌(Clostridium sporogenes) [CMCC (B) 64941]

白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC (F) 98001]

痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae) [CMCC (B)51252]

3.11.1.1.3 菌液制备

接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中,接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中,培养18~24小时;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中,培养24~48小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10~100CFU或100~1000CFU的菌悬液。

菌悬液制备后应在2小时内使用,若保存在2~8℃的菌悬液可以在24小时内使用。

控制菌

培养基

特性

试验菌株

大肠埃希菌

胆盐乳糖培养基

促生长能力

大肠埃希菌

抑制能力

金黄色葡萄球菌

曙红亚甲蓝琼脂培养基

促生长能力+指示能力

大肠埃希菌

续表

控制菌

培养基

特性

试验菌株

沙门菌、

志贺菌

胆盐乳糖培养基

促生长能力

乙型副伤寒沙门菌、痢疾志贺菌

抑制能力

金黄色葡萄球菌

沙门、志贺菌属琼脂

培养基

促生长能力十指示能力

乙型副伤寒沙门菌、痢疾志贺菌

铜绿假单胞菌

NAC液体培养基

促生长能力

铜绿假单胞菌

抑制能力

金黄色葡萄球菌

NAC琼脂培养基

促生长能力

铜绿假单胞菌

抑制能力

大肠埃希菌

绿脓菌素测定用培养基

促生长能力+指示能力

铜绿假单胞菌

金黄色葡萄球菌

7.5%氯化钠肉汤培养基

促生长能力

金黄色葡萄球菌

抑制能力

大肠埃希菌

甘露醇氯化钠琼脂培养基

促生长能力+指示能力

金黄色葡萄球菌

抑制能力

大肠埃希菌

梭菌

梭菌增菌培养基

促生长能力

生孢梭菌

哥伦比亚琼脂培养基

促生长能力

生孢梭菌

白色念珠菌

沙氏葡萄糖肉汤培养基

促生长能力

白色念珠菌

沙氏葡萄糖琼脂培养基

促生长能力+指示能力

白色念珠菌

念珠菌

促生长能力+指示能力

白色念珠菌

显色培养基

抑制能力

大肠埃希菌

1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基

促生长能力+指示能力

白色念珠菌

(1)增菌培养基促生长能力检查  分别接种不超过100CFU的试验菌于被检培养基和对照培养基中,在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基比较,被检培养基试验菌应生长良好。

(2)固体培养基促生长能力检查取试验菌各0.1ml(含菌数50~100CFU)分别涂布于被检培养基和对照培养基平皿中,每种培养基平行制备2个平皿,在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。被检培养基与对照培养基相比,生长的菌落大小、形态特征应一致。

(3)培养基抑制能力检查  接种不小于100CFU的试验菌于被检培养基中,在相应控制菌检查规定的培养温度及最长时间下培养,试验菌应不得生长。

(4)培养基指示能力检查  分别接种不超过100CFU的试验菌于被检培养基和对照培养基平皿上,在相应控制菌检查规定的培养温度及时间下培养。被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。

3.11.1.2 供试品检查

供试品的控制菌检查应按下述方法进行。

阳性对照试验  供试品进行控制菌检查时,应做阳性对照试验。取阳性对照菌于相应选择性培养基平皿上划线接种,按供试品的控制菌检查方法培养,观察菌落生长情况。阳性对照试验应检出相应的控制菌。

阴性对照试验  取增菌液0.1ml,照相应控制菌检查法检查,作为阴性对照。阴性对照应无菌生长。

(1)增菌培养  称取供试品1g,加到9ml灭菌胆盐乳糖培养基中,培养18~24小时。

(2)特异培养  将上述增菌液摇匀,取0.1ml滴加到曙红亚甲蓝琼脂平皿上,以玻棒涂匀,一式3份,培养18~24小时,观察菌落生长情况。

(3)结果判定  阳性对照平皿应长出紫黑色、圆形、稍凸起、边缘整齐、表面光滑、带有金属光泽的菌落。供试品平皿上若未见菌落生长或生长的菌落与阳性对照的菌落形态特征不符,判供试品未检出大肠埃希菌;若生长的菌落与阳性对照的菌落形态特征相符或疑似,应做革兰氏染色镜检等适宜的鉴定试验,鉴别是否为制品中的目的菌或大肠埃希菌。

2.志贺菌(Shigella)、沙门菌(Salmonella)

(2)特异培养  将上述增菌液摇匀,取0.1ml滴加到沙门、志贺菌属琼脂平皿上,以玻棒涂匀,一式3份,培养24~48小时,观察菌落生长情况。

(3)结果判定  阳性沙门菌对照平皿应长出无色透明或半透明、圆形、光滑、稍隆起菌落,中心呈黑褐色。阳性志贺菌对照平皿应长出无色、半透明、圆形、微凸、光滑的菌落。

供试品平皿培养24小时、48小时各观察结果1次,若未见菌落生长,判供试品未检出志贺菌、沙门菌;若有菌落生长,应与阳性对照的菌落比较,并做革兰氏染色镜检等适宜的鉴定试验,鉴别是否为制品中的目的菌或志贺菌、沙门菌。

3.铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)

(2)特异培养  将上述增菌液摇匀,取0.1ml滴加到NAC琼脂平皿上,以玻棒涂匀,一式3份,培养18~24小时,观察菌落生长情况。

(3)结果判定  阳性对照平皿应长出产绿色色素的菌落,可使整个培养基呈绿色。

如平皿上无菌落生长或生长的菌落与阳性对照菌落形态特征不符,判供试品未检出铜绿假单胞菌;如平皿

生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似,应挑选2~3个菌落,分别接种于营养琼脂培养基斜面上,培养18~24小时。取斜面培养物进行革兰氏染色、镜检及氧化酶试验,鉴别是否为制品中的目的菌或铜绿假单胞菌。

氧化酶试验  取洁净滤纸片置于平皿内,用无菌玻棒取斜面培养物涂于滤纸片上,滴加新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液,在30秒内若培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性,否则为阴性。

若斜面培养物为非革兰氏阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性,均判供试品未检出铜绿假单胞菌。否则,应进行绿脓菌素试验。

绿脓菌素(Pyocyanin)试验  取斜面培养物接种于PDP琼脂培养基斜面上,培养24小时,加三氯甲烷3~5ml至培养管中,搅碎培养基并充分振摇。静置片刻,将三氯甲烷相移至另一试管中,加入1mol/L盐酸试液约1ml,振摇后,静置片刻,观察。若盐酸溶液呈粉红色,为绿脓菌素试验阳性,否则为阴性。同时用未接种的PDP琼脂培养基斜面同法作阴性对照,阴性对照试验应呈阴性。

若上述疑似菌为革兰氏阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阳性,判供试品检出铜绿假单胞菌;若上述疑似菌为革兰氏阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阴性,应继续进行适宜的鉴定试验,确认是否为铜绿假单胞菌。

4.金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)

(2)特异培养  将上述增菌液摇匀,取0.1ml滴加到甘露醇氯化钠琼脂平皿上,以玻棒涂匀,一式3份,培养18~24小时,观察菌落生长情况。

(3)结果判定  阳性对照平皿应长出产金黄色素的圆形、凸起、边缘整齐的菌落。

供试品平皿上若未见菌落生长或生长的菌落与阳性对照菌落形态不符,判未检出金黄色葡萄球菌;若平皿上生长的菌落与阳性对照品的菌落特征相符或疑似,应挑选2~3个菌落,分别接种子营养琼脂培养基斜面上,培养18~24小时。取营养琼脂培养基的培养物进行革兰氏染色,并接种于营养肉汤培养基中,培养18~24小时,做血浆凝固酶试验。

血浆凝固酶试验  取灭菌小试管3支,各加入血浆和无菌水混合液(体积比1:1)0.5ml,再分别加入可疑菌株的营养肉汤培养物(或由营养琼脂培养基斜面培养物制备的浓菌悬液)0.5ml、金黄色葡萄球菌营养肉汤培养物(或由营养琼脂培养基斜面培养物制备的浓菌悬液)0.5ml、营养肉汤或0.9%无菌氯化钠溶液0.5ml,即为试验管、阳性对照管和阴性对照管。将3管同时培养,3小时后开始观察直至24小时。阴性对照管的血浆应流动自如,阳性对照管血浆应凝固,若试验管血浆凝固者为血浆凝固酶试验阳性,否则为阴性。如阳性对照管或阴性对照管不符合规定时,应另制备血浆,重新试验。

若上述疑似菌为非革兰氏阳性球菌、血浆凝固酶试验阴性,亦非制品中的目的菌,判供试品未检出金黄色葡萄球菌。

5.梭菌(Clostridium)

(2)特异培养  取上述每一培养物0.1ml,分别涂布接种子含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基平皿上,一式3份,置厌氧条件下培养48~72小时。

(3)结果判定  阳性对照平皿应长出典型的梭菌菌落。若供试品平皿上未见菌落生长,判供试品未检出梭菌;若供试品平皿上有菌落生长,应挑选2~3个菌落分别进行革兰氏染色和过氧化氢酶试验。

过氧化氢酶试验  取上述平皿上的菌落,置洁净玻片上,滴加3%过氧化氢试液,若菌落表面有气泡产生,为过氧化氢酶试验阳性,否则为阴性。

若上述可疑菌落为革兰氏阳性菌落,应对芽孢的位置、大小、形态进行观察,并做适宜的鉴定试验,判断是否为梭菌。

(1)增菌培养  取供试品1g,接种至9ml的沙氏葡萄糖肉汤培养基中,培养24~48小时。

(2)特异培养  取上述培养物0.1ml,滴加到沙氏葡萄糖琼脂培养基平皿上,以玻棒涂匀,一式3份,培养24~48小时(必要时延长至72小时)。

(3)结果判定  阳性对照平皿应长出乳白色偶见淡黄色的菌落,菌落表面光滑,有浓酵母气味,培养时间稍久则菌落增大、颜色变深、质地变硬或有皱褶。若供试品平皿上未见菌落生长或生长的菌落与阳性对照菌落形态特征不符,判供试品未检出白色念珠菌。如供试品平皿上生长的菌落与阳性对照菌落形态特征相符或疑似,应挑选2~3个菌落分别接种至念珠菌显色培养基平皿上,培养24~48小时(必要时延长至72小时)。若供试品平皿上无绿色或翠绿色的菌落生长,判供试品未检出白色念珠菌。若供试品平皿上生长的菌落为绿色或翠绿色,挑取相符或疑似的菌落接种于1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基上,培养24~48小时。取培养物进行革兰氏染色镜检及芽管试验。

芽管试验  挑取1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基上的培养物,接种子加有1滴血清的载玻片上,盖上盖玻片,置湿润的平皿内,于35~37℃放置1~3小时,显微镜下观察,可见到由孢子长出短小芽管。

若上述疑似菌为非革兰氏阳性菌,显微镜未见厚膜孢子、假菌丝、芽管,亦非制品中的目的菌,判供试品未检出白色念珠菌。

3.11.1.3 非致病性杂菌、真菌计数

大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC (B) 44102]

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC (B) 26003]

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC (B) 63501]

白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC (F) 98001]

菌液制备  接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中,培养18~24小时;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中,培养24~48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50~100CFU或500~1000CFU的菌悬液。菌悬液制备后应在2小时内使用,若保存在2~8℃的菌悬液可在24小时内使用。

适用性检查  取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌液各1ml(含50~100CFU),分别注入无菌平皿中,立即倾注营养琼脂培养基。每株试验菌平行制备2个平皿,混匀,凝固,置30~37℃培养48小时,计数;取白色念珠菌液1ml(含50~100CFU),注入无菌平皿中,立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,混匀,凝固,置20~28℃培养72小时,计数.或采用涂布法,取上述菌液各0.1ml(含菌数50~100CFU),分别涂布于相应琼脂培养基平皿上,以玻棒涂布均匀,一式2份,同法培养,计数。同时,用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。

结果判定  被检培养基的菌落平均数与对照培养基的菌落平均数相比大于70%,且菌落形态、大小应与对照培养基上的菌落一致,判该培养基的适用性检查符合规定。

2.供试品检查

(1)真菌计数  称取供试品1g,加到9ml 0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜稀释液中,混匀,做10倍系列稀释,取适宜稀释度供试品溶液0.1ml加到已备好的玫瑰红钠琼脂培养基上,以玻棒涂匀,一式3份,倒置,于恒温培养箱中培养96小时,每天观察结果,记录平皿上生长的真菌菌落数。

结果计算:以3个平皿上生长的菌落平均数计算。

(2)非致病性杂菌计数  称取供试品1g,加到9m10.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜稀释液中,混匀,做10倍系列稀释,取适宜稀释度供试品溶液0.1ml加到已备好的琼脂培养基上,以玻棒涂匀,一式3份,倒置,恒温培养箱中培养48小时,每天观察结果,记录平皿上生长的菌落数。

结果计算:方法同真菌计数。结果判定

供试品检出控制菌或其他致病菌时,按一次检出结果为准,不再复试。

供试品的非致病性杂菌总数、真菌数,任何一项不符合规定,不再复试。

控制菌检查、非致病性杂菌总数、真菌数3项结果均符合规定,判供试品杂菌检查合格;若其中任何一项不符合规定,判供试品杂菌检查不合格。

稀释液

除另有规定外,微生态活菌制品杂菌检查用稀释液采用0.9%无菌氯化钠溶液。稀释液配制后,应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

1.pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液照无菌检查法(2010年版药典三部附录Ⅻ A)制备。

2. 0.9%无菌氯化钠溶液

称取氯化钠9.0g,加水溶解使成1000ml,过滤,分装,灭菌。

3.11.1.4 培养基及其制备方法

无菌检查法2010年版药典三部附录Ⅻ A)和微生物限度检查法(2010年版药典三部附录Ⅻ G)中“培养基及其制备方法”的处方制备,未收录的培养基可按照以下配方配制,也可使用按该处方生产的符合要求的脱水培养基。配制后,应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

1.7.5%氯化钠肉汤培养基

氯化钠    75.0g

牛肉浸粉    3.0g

水    1000ml

取上述成分混合,微温溶解,调pH值为弱碱性,煮沸,滤清,调pH值使灭菌后为7.2±0.2,分装,灭菌。

2.NAC液体培养基

萘啶酮酸  0.015g

硫酸镁    0.3g

磷酸氢二钾  0.3g

溴化十六烷基三甲铵  0.3g

水    1000ml

取上述成分,混合,微温溶解,调pH值使灭菌后为7.5±0.1,分装,灭菌。

3.NAC琼脂培养基

萘啶酮酸    0.015g

硫酸镁    0.3g

磷酸氢二钾    0.3g

琼脂    14.0g

溴化十六烷基三甲铵  0.3g

水    1000ml

除琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解,调pH值使灭菌后为7.5±0.1,加入琼脂,加热溶胀后,分装,灭菌,冷至60℃,倾注平皿。

3.11.1.5 限度标准

杂菌检查的限度标准是基于药品的给药途径和对患者健康潜在的危害以及活菌制品的特殊性而制订的。

金黄色葡萄球菌  每1g不得检出。

铜绿假单胞菌  每1g不得检出。

沙门菌及志贺菌  每1g不得检出。

非致病性杂菌数  每1g不超过500CFU。

真菌数  每1g不超过100CFU。

(2)半成品、成品

大肠埃希菌  每1g不得检出。

金黄色葡萄球菌  每1g不得检出。

铜绿假单胞菌  每1g不得检出。

沙门菌及志贺菌  每1g不得检出。

非致病性杂菌数  每1g不超过1000CFU。

真菌数  每1g不得超过100CFU。

2.阴道微生态活菌制品

铜绿假单胞菌  每1g不得检出。

梭菌  每1g不得检出。

白色念珠菌  每1g不得检出。

真菌  每1g不得检出。

非致病性杂菌数  每1g不超过100CFU。

3.12 版本

中华人民共和国药典》2010年版

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  • 评论总管
    2020/8/8 19:14:27 | #0
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