1 拼音
tóng lǜ jiǎ dān bāo jūn zhù shè yè
2 英文参考
Pseudomonas AeruginosaInjection[2010年版药典]
3 铜绿假单胞菌注射液药典标准
3.1 品名
3.1.1 中文名
铜绿假单胞菌注射液
3.1.2 汉语拼音
Tonglüjiadanbaojun Zhusheye
3.1.3 英文名
Pseudomonas Aeruginosa Injection
3.2 定义、组成及用途
本品系用铜绿假单胞菌（MSHA菌毛株）培养后，取菌苔制成悬液，加甲醛杀菌，以PBS稀释制成。
3.3 1 基本要求
生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
3.4 2 制造
3.4.1 2.1 菌种
生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。
3.4.1.1 2.1.1 名称及来源
生产用菌种为铜绿假单胞菌（MSHA菌毛株），CGMCC0190。
3.4.1.2 2.1.2 种子批的建立
应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。
3.4.1.3 2.1.3 种子批的传代
主种子批启开后传代至工作种子批为2代；工作种子批菌种启开后至接种生产用培养基传代次数不得超过4代。
3.4.1.4 2.1.4 种子批的检定
主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。
2.1.4.1 形态及培养特性
将待检菌种接种于pH 7.2～7.4的肉汤琼脂、马丁琼脂或其他适宜培养基，应为革兰氏阴性直或弯曲杆菌；有单根或数根端鞭毛。有动力、能溶血和产生绿脓素。
2.1.4.2 生化反应
氧化酶、液化明胶及水解乙酰胺酶试验呈阳性反应。
2.1.4.3 血清凝集试验
取37℃培养18～20小时的琼脂培养物，用含1%（ml/ml）甲醛的生理氯化钠溶液稀释至含菌9.0×108个/ml，加入等量特异性铜绿假单胞菌免疫血清（效价1：2560～1：5120）充分混合后，置37℃18～20小时，以肉眼可见凝集（+）之血清最高稀释度为凝集反应效价。凝集效价应不低于原血清效价之半。
2.1.4.4 毒力试验
取37℃培养18～20小时的琼脂培养物，用无菌生理氯化钠溶液稀释成含菌1.2×109个/ml、8.0×108个/ml、4.0×108个/ml、2.0×108个/ml等浓度菌液，腹腔注射体重14～16g小鼠，每个浓度菌液至少注射5只小鼠，每只0.3ml，观察3～7天，计算LD50，应不低于4.0×108。
2.1.4.5 毒性试验
取37℃培养18～20小时的琼脂培养物混悬于生理氯化钠溶液内，于56℃加温2小时（或其他方法）杀菌。取杀菌后菌悬液用生理氯化钠溶液稀释成每1ml含菌6.0×109个、3.0×109个及1.5×109个共3个浓度，取每个浓度菌悬液分别腹腔注射体重15～18g小鼠15只，每只0.5ml，观察3天，应全部健存。
2.1.4.6 免疫力试验
取37℃培养18～20小时的琼脂培养物，以终浓度为1%（ml/ml）的甲醛溶液杀菌后，用无菌生理氯化钠溶液稀释至含菌1.8×109个/ml，分别皮下注射体重14～16g小鼠至少
30只，每只0.5ml，间隔5天注射1次，共注射3次，末次免疫后7～10天，腹腔注射3个LD50的活菌进行攻击。同时取同批饲养的14～16g小鼠至少10只作对照，分别腹腔注射3个LD50活菌。攻击后观察3天，对照组小鼠死亡数应不低于80%，免疫组小鼠保护率应不低于70%。
2.1.4.7 抗原性试验
取37℃培养18～20小时的琼脂培养物，以终浓度为1%（ml/ml）的甲醛溶液杀菌后，用无菌生理氯化钠溶液稀释至含菌1.8×109个/ml。
选体重约2kg的家兔至少3只，取上述菌液分别于第1、3、5、8、11天皮内注射，第1天注射时，首剂注射0.1ml/只后观察30分钟，应无局部红肿和全身异常反应，随后于同一动物的其他部位再分别多点皮内注射0.1ml/点，第14、18天耳静脉注射1.0ml/只，每只家兔全程共注射8次。末次注射后7～10天，采血做定量凝集试验，测定效价。2/3家兔血清凝集价应不低于1: 2560。
3.4.1.5 2.1.5 种子批的保存
种子批应冻干保存于2～8℃。
3.4.2 2.2 原液
3.4.2.1 2.2.1 生产用种子
将检定合格的工作种子批菌种启开后，接种于营养琼脂或其他适宜培养基，置35～37℃培养不超过18小时，传代次数不超过4代，制备适宜数量的生产用种子，用于生产。
3.4.2.2 2.2.2 生产用培养基
用pH 7.2～7.4的营养琼脂或经批准的其他培养基。培养基中不应含有对人体有害或其他过敏原物质。
3.4.2.3 2.2.3 菌种接种和培养
采用克氏瓶涂种法，置37℃培养18～20小时。在培养过程中及杀菌前取样进行纯菌试验，涂片做革兰氏染色镜检，发现污染杂菌应废弃。
3.4.2.4 2.2.4 采集和杀菌
培养结束后，于采集的培养物中加入适量含1% （ml/ml）甲醛的PBS溶液杀菌，于20～26℃放置14～16天，离心洗涤后，立即取样进行杀菌检查。
3.4.2.5 2.2.5 杀菌检查
取杀菌后经离心洗涤的菌液接种于不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基、马丁培养基及普通琼脂斜面各3管。置37℃培养5天，应无菌生长。
3.4.2.6 2.2.6 原液
来自同一工作种子批的培养物经杀菌后制备的菌液可进行合并，合并后的菌液经离心纯化后用PBS稀释至菌浓度为1.0×1011个/ml，即为原液，保存于2～8℃。
原液自采集杀菌之日起至菌苗稀释时，不得少于2个月。原液自采集杀菌之日起保存期不超过6个月。
3.4.2.7 2.2.7 原液检定
按3.1项进行。
3.4.3 2.3 半成品
3.4.3.1 2.3.1 半成品配制
可用单批或多批检定合格的原液合并，加入终浓度为8.0g/L的苯甲醇，用PBS稀释至每1ml含菌1.8×109个。
3.4.3.2 2.3.2 半成品检定
按3.2项进行。
3.4.4 2.4 成品
3.4.4.1 2.4.1 分批
应符合“生物制品分批规程”规定。
3.4.4.2 2.4.2 分装
应符合“生物制品分装和冻干规程”及附录Ⅰ A 有关规定。
3.4.4.3 2.4.3 规格
每支1.0ml，含菌1.8×109个；每支0.5ml，含菌9.0×108个。
3.4.4.4 2.4.4 包装
应符合“生物制品包装规程”及附录Ⅰ A 有关规定。
3.5 3 检定
3.5.1 3.1 原液检定
3.5.1.1 3.1.1 染色镜检
应为革兰氏阴性直的或弯曲杆菌，无杂菌。
3.5.1.2 3.1.2 浓度测定
应按“中国细菌浊度标准”进行测定，应不高于1.0×1011个/ml。
3.5.1.3 3.1.3 无菌检查
依法检查（2010年版药典三部附录Ⅻ A），应符合规定。
3.5.2 3.2 半成品检定
3.5.2.1 3.2.1 浓度测定
按“中国细菌浊度标准”测定浓度，每1ml应含菌1.6×109～2.0×109个。
3.5.2.2 3.2.2 无菌检查
依法检查（2010年版药典三部附录Ⅻ A），应符合规定。
3.5.3 3.3 成品检定
3.5.3.1 3.3.1 鉴别试验
与相应高效价血清进行凝集试验，应呈强凝集反应。
3.5.3.2 3.3.2 物理检查
3.3.2.1 外观
应为乳白色悬液，不应含有摇不散的凝块及异物。
3.3.2.2 可见异物
依法检查（2010年版药典三部附录Ⅴ B），应符合规定。
3.3.2.3 装量
依法检查（2010年版药典三部附录Ⅰ A），应不低于标示量。
3.5.3.3 3.3.3 化学检定
3.3.3.1 pH值
应为6.0～7.2（2010年版药典三部附录Ⅴ A）。
3.3.3.2 游离甲醛含量
应小于0.06g/L（2010年版药典三部附录Ⅵ L）。
3.3.3.3 苯甲醇含量
精密量取本品2.0ml，置于250ml碘瓶中，精密加入重铬酸钾液（0.01667mol/L） 10ml，加稀硫酸（1mol/L） 10ml，沸水浴20分钟，迅速冷却至室温。加碘化钾液（16.5%）10ml，密塞，放置10分钟。用硫代硫酸钠（0.10mol/L）滴定至淡黄色，加入淀粉指示液（0.5%）1ml，继续滴定至溶液由黄色消失而显亮绿色，并将滴定结果用空白试验校正。
结果计算：苯甲醇含量（g/L）=27.03×（V空-V样）×CNa2S2O3。
V空为空白试验消耗硫代硫酸钠滴定液的体积，ml；
V样为供试品消耗硫代硫酸钠滴定液的体积，ml；
CNa2S2O3为硫代硫酸钠浓度，mol/L。
苯甲醇含量应不高于8.5g/L。
3.5.3.4 3.3.4 染色镜检
应为革兰氏阴性直的或弯曲杆菌，至少观察10个视野，不应有杂菌。
3.5.3.5 3.3.5 浓度测定
按“中国细菌浊度标准”测定浓度，每1ml含菌应为1.6×109～2.0×109个。
3.5.3.6 3.3.6 生物学活性
按本品附录进行。将供试品稀释至1: 100，即每1ml含菌1.8×107个时，刺激指数（SI）应不低于2.0。
3.5.3.7 3.3.7 无菌检查
依法检查（2010年版药典三部附录Ⅻ A），应符合规定。
3.5.3.8 3.3.8 异常毒性检查
依法检查（2010年版药典三部附录Ⅻ F），小鼠注射0.5ml，豚鼠注射1.5ml，应符合规定。
3.6 4 保存、运输及有效期
于2～8℃避光保存和运输，自生产之日起，有效期为30个月。
3.7 5 使用说明
应符合“生物制品包装规程”规定和批准的内容。
3.8 6 附录
脾淋巴细胞增殖试验
脾淋巴细胞增殖试验
本法系依据铜绿假单胞菌－甘露糖敏感血凝菌毛株（Pseudomonas aeruginosa Mannose-Sensitive Hemagglutination Pilus Strain，PA-MSHA）具有刺激脾淋巴细胞增殖的作用，根据脾淋巴细胞的刺激指数（SI）测定PA-MSHA的生物学活性。
3.8.1 试剂
（1） RPMI 1640培养液：取RPMI 1640培养基粉末1袋（规格为1L），加水溶解并稀释至1000ml，再加入碳酸氢钠2.1g，溶解后，混匀，经0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。
（2）含5%胎牛血清的培养液：量取经56℃、30分钟灭能的胎牛血清5ml，加RPMI 1640培养液95ml，4℃保存。
（3）红细胞裂解液（Tris-NH4Cl）：称取3.735g氯化铵、三羟甲基氨基甲烷（Tris）1.3g，加水溶解并稀释至500ml。0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。
（4）磷酸盐缓冲液（PBS）：称取氯化钠8.5g、磷酸氢二钠0.118g、磷酸二氢钾0.113g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃、30分钟灭菌，4℃保存。
（5）噻唑蓝（MTT）溶液：称取MTT粉末0.10g，加PBS溶解并稀释至20ml，配制成每1ml含5mg的溶液，经0.22μm滤膜过滤除菌，4℃避光保存。
（6）裂解液：二甲基亚砜（DMSO），使用期限不得超过12个月。
3.8.2 脾淋巴细胞悬液制备
取BALB/c小鼠（体重18～22g，雌雄不限）脾脏，研磨过100目不锈钢筛网，并置于RPMI 1640培养液中，1000转／分钟离心5分钟，弃上清。轻微振荡使细胞沉淀分散，加入预冷的红细胞裂解液，置于冰上5分钟。待红细胞完全裂解后，1000转／分钟离心5分钟，弃上清。将细胞再用RPMI 1640培养液离心洗涤2～3遍，最后用含5%胎牛血清的培养液重悬，制备成每1ml含1.0×107个细胞的脾淋巴细胞悬液，置37℃备用。以上操作在无菌条件下进行。
3.8.3 供试品溶液的制备
取成品，4000转／分钟离心60分钟，弃上清，加入等体积RPMI 1640培养液混匀。再用RPMI 1640培养液进行10倍系列稀释至1：10000，取原倍、1: 10、1: 100、1: 1000、1：100005个稀释度，作为供试品溶液。以上操作在无菌条件下进行。
3.8.4 测定法
取96孔细胞培养板，加入脾淋巴细胞悬液，每孔100μl。再分别加入各稀释度的供试品溶液，每孔100μl。同时设阴性对照，在含脾淋巴细胞悬液孔中，加入RPMI 1640培养液，每孔100μl。于培养板中直接加入RPMI 1640培养液作为空白对照。以上各组每个样品应至少做4个复孔。以上操作在无菌条件下进行。
将上述细胞培养板于37℃、5%二氧化碳条件下培养72小时，再在无菌条件下每孔加入MTT溶液25μl，于37℃、5%二氧化碳条件下继续培养4小时。2000转／分钟离心20分钟，弃上清，每孔加入裂解液100μl，振荡5～10分钟。
待甲瓒沉淀完全溶解后，用酶标仪于570nm波长处测定吸光度值，记录测定结果，并按下式进行计算：
刺激指数（SI）=（供试品平均吸光度值-空白对照平均吸光度值）／（阴性对照平均吸光度值-空白对照平均吸光度值）。
3.9 版本
《中华人民共和国药典》2010年版 第二增补本