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t-PA

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1 检查名称

t-PA

2 分类

临床血液检查/出血和凝血检查

3 t-PA的别名

组织纤维溶酶原激活物

4 概述

组织纤溶酶原激活物是一种单链糖蛋白,主要由血管内皮细胞合成、分泌,不断释放入血液,广泛存在于机体的各种组织内,肝脏是组织纤溶酶原激活物灭活的主要场所。它对纤维蛋白有高度亲和力,然后酪氨酸纤溶酶原形成纤溶酶。降解纤维蛋白(原)和部分凝血因子。是纤溶系统的关键物质。

5 原理

(1)活性测定(组织纤维溶酶原激活物∶A,发色底物法之一):血浆球蛋白部分含有包括组织纤维溶酶原激活物以及全部凝血因子,但不含PA抑制物。加入过量的纤溶酶原与纤维蛋白的共价物,样品中之组织纤维溶酶原激活物易吸附于纤维蛋白,并将血纤溶酶原转变成纤溶酶,后者使发色底物显色。血浆t-P组织纤维溶酶原激活物与显色的深浅呈正相关

(2)活性测定(组织纤维溶酶原激活物∶A发色底物法之二):在组织纤维溶酶原激活物和加速剂作用下,纤溶酶原转变为纤溶酶,后者使发色底物S-2390释放出发色基团PNA。PNA显色的深浅与纤溶酶和组织纤维溶酶原激活物呈正比关系。

(3)抗原测定(组织纤维溶酶原激活物∶Ag)ELISA法:本试验根据双抗体夹心法原理,即将纯化的组织纤维溶酶原激活物单克隆抗体包被在固相载体上温育,然后加含有抗原的待测标本。标本中的组织纤维溶酶原激活物抗原与固相载体上的抗体形成复合物。此复合物与过氧化物酶标记的组织纤维溶酶原激活物单克隆抗体起抗原抗体结合反应,形成组织纤维溶酶原激活物-POD复合物。后者可使邻苯二胺基质液呈棕色反应,其反应颜色深浅与标本中组织纤维溶酶原激活物含量呈正比关系。

6 试剂

6.1 (1)活性测定(组织纤维溶酶原激活物∶A,发色底物法之一):

①50mmol/L磷酸缓冲液

②纤维蛋白-纤溶酶原共价物:375mg/L的纤维蛋白,250μ/L的纤溶酶原。

③发色底物:3mol/L S-2251(H-D-Val-Leu-Lys-PNA)。

④组织纤溶酶原激活原激活剂。

⑤0.25%醋酸

⑥组织纤维溶酶原激活物标准1和2(S1 5.6IU/ml,S2 2.8IU/ml)。

6.2 (2)活性测定(组织纤维溶酶原激活物∶A发色底物法之二):

上海医科大学试剂盒。

标准品组织纤维溶酶原激活物(80IU)。

②去组织纤维溶酶原激活物人血浆。

③人纤溶酶原。

④发色底物S-2390。

⑤浓缓冲液TB。

⑥加速剂。

⑦浓抗凝液。

⑧浓酸化液。

⑨其他:蒸馏水、50%冰醋酸

6.3 (3)抗原测定(组织纤维溶酶原激活物∶Ag)ELISA法:

①抗体:抗组织纤维溶酶原激活物F(2b')2

②过氧化物酶抗体复合物抗:组织纤维溶酶原激活物-peroxidase。

③基质:邻苯二胺。

④基质缓冲液:0.2mol/L柠檬酸,0.2mol/L柠檬酸钠缓冲液。

⑤稀释缓冲液:白蛋白-磷酸盐缓冲液(PBS-BSA)。

洗涤液:0.025mol/L氯化钙-Tween-20-PBS缓冲液。

⑦组织纤维溶酶原激活物标准:组织纤溶酶原缴活物。

⑧0.11mol/L柠檬酸钠溶液

⑨30% H2O2

⑩终止液:3mol/L硫酸或1mol/L盐酸

7 操作方法

(1)活性测定(组织纤维溶酶原激活物∶A,发色底物法之一):

①血浆处理:按表1进行操作。

②操作方法:按表2进行。

(2)活性测定(组织纤维溶酶原激活物∶A发色底物法之二):

①血浆制备:静脉采血,置于含1/10体积抗凝液的硅化试管中,尽快低温分离血浆。取血浆200μl,加酸化液200μl,混匀,置-30℃保存。测定时酸化血浆作1∶60稀释。

②取去组织纤维溶酶原激活物血血浆和组织纤维溶酶原激活物标准品配制标准组织纤维溶酶原激活物系列(表3)。

③加样:取洁净96孔平底酶标板一块,将上述准备好的待测血浆样品和组织纤维溶酶原激活物标准品加到各孔中,100μl/孔。

④发色底物混合液:将纤溶酶原、发色底物和加速剂混合,立即100μl/孔加至酶标板各孔中。

⑤反应:置湿盒中,37℃温育5h,加50%冰醋酸20μl终止反应。

⑥测定:测定各孔A405。以标准系列中不含组织纤维溶酶原激活物孔调零点,然后读数。

(3)抗原测定(组织纤维溶酶原激活物∶Ag)ELISA法:

①用0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释组织纤维溶酶原激活物抗体。

②用稀释缓冲液稀释抗体-POD结合物。

③用基质缓冲液溶解邻苯二胺(8mg/ml),并加入10μl 30% H2O2

④将组织纤维溶酶原激活物标准倍比稀释成10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125IU/ml。

⑤标本稀释:1份柠檬酸钠抗凝血浆加5份稀释液。如果估计组织纤维溶酶原激活物值增高,血浆作1∶10稀释。

⑥用稀释之组织纤维溶酶原激活物抗体包被ELISA反应板,每孔200μl,温育过夜,然后用洗涤液洗3次。

⑦加标准/标本200μl,温育1h后,同上洗涤3次。

⑧加过氧化物酶抗体复合物200μl,温育1h后,同上洗涤3次,洗后立即加基质。

⑨每孔加基质200μl,显色10~15min。

⑩加硫酸(3mol/L)50μl或盐酸(1mol/L)100μl,10min中止反应,于492nm,2h内比色,以稀释缓冲液为本底。

⑪据吸光度读数由标准曲线查得组织纤维溶酶原激活物含量。

8 正常值

(1)活性测定(组织纤维溶酶原激活物∶A,发色底物法之一):0.3IU/ml。

(2)活性测定(组织纤维溶酶原激活物∶A发色底物法之二):  1.9±0.7IU/ml。

(3)抗原测定(组织纤维溶酶原激活物∶Ag)ELISA法:        1~12ng/ml。

9 临床意义

(1)活性测定(组织纤维溶酶原激活物∶A,发色底物法之一):

①肝坏死常伴有纤溶活性的异常,由于消除功能障碍,故组织纤维溶酶原激活物∶A往往增高。但同时由于PAI的活性增强故组织纤维溶酶原激活物的活性实际上是降低的。在DIC和伴有血栓形成倾向的疾病往往有组织纤维溶酶原激活物活性减低。冠心病心肌梗死患者PA活性减低。

先天性组织纤维溶酶原激活物活性增强已有报道。急性早幼粒细胞白血病患者组织纤维溶酶原激活物往往增高。

遗传性PA活性缺乏为常染色体显性遗传。患者表现为多发性静脉血栓形形形成。

(2)活性测定(组织纤维溶酶原激活物∶A发色底物法之二):

①组织纤维溶酶原激活物∶A增高:表明纤溶活性亢进,见于原发性继发性纤溶症,如DIC等。

②组织纤维溶酶原激活物∶A减低:表明纤溶活性减弱,见于高凝状态和血栓性疾病

(3)抗原测定(组织纤维溶酶原激活物∶Ag)ELISA法:

①组织纤维溶酶原激活物含量随年龄、剧烈运动和应激反应而增高,静脉滞留导致组织纤维溶酶原激活物含量增加。

②先天性组织纤维溶酶原激活物含量增高症。

③高血脂、肥胖症、口服避孕药、冠心病、心肌梗死、动脉血栓形成、缺血性中风等组织纤维溶酶原激活物含量减低。

10 附注

(1)活性测定(组织纤维溶酶原激活物∶A,发色底物法之一):

①血浆中肝素浓度超过1.5IU/ml,对本试验有影响。

②采血时最好不用止血带,加压后会引起组织纤维溶酶原激活物进入血液。

样本必须酸化处理。否则受PAI的影响较大。

(2)抗原测定(组织纤维溶酶原激活物∶Ag)ELISA法:ELISA法是一项特异性敏感性较高的免疫学试验。因此必须严格控制每项试验的条件。

相关文献

开放分类:化验及医学检查临床血液检查出血和凝血检查
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    本页最后修订于 2013年2月20日 星期三 15:43:42 (GMT+08:00)
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    2019/10/21 16:28:46