t-PA

目录

1 检查名称

组织纤维溶酶原激活物

2 分类

临床血液检查/出血和凝血检查

3 别名

t-PA

4 概述

组织纤溶酶原激活物是一种单链糖蛋白,主要由血管内皮细胞合成、分泌,不断释放入血液,广泛存在于机体的各种组织内,肝脏是组织纤溶酶原激活物灭活的主要场所。它对纤维蛋白有高度亲和力,然后将酪氨酸纤溶酶原形成纤溶酶。降解纤维蛋白(原)和部分凝血因子。是纤溶系统的关键物质。

5 原理

(1)活性测定(t-PA∶A,发色底物法之一):血浆优球蛋白部分含有包括t-PA以及全部凝血因子,但不含PA抑制物。加入过量的纤溶酶原与纤维蛋白的共价物,样品中之t-PA易吸附于纤维蛋白,并将血纤溶酶原转变成纤溶酶,后者使发色底物显色。血浆t-Pt-PA与显色的深浅呈正相关。

(2)活性测定(t-PA∶A发色底物法之二):在t-PA和加速剂作用下,纤溶酶原转变为纤溶酶,后者使发色底物S-2390释放出发色基团PNA。PNA显色的深浅与纤溶酶和t-PA呈正比关系。

(3)抗原测定(t-PA∶Ag)ELISA法:本试验根据双抗体夹心法原理,即将纯化的t-PA单克隆抗体包被在固相载体上温育,然后加含有抗原的待测标本。标本中的t-PA抗原与固相载体上的抗体形成复合物。此复合物与过氧化物酶标记的t-PA单克隆抗体起抗原抗体结合反应,形成t-PA-POD复合物。后者可使邻苯二胺基质液呈棕色反应,其反应颜色深浅与标本中t-PA含量呈正比关系。

6 试剂

6.1 (1)活性测定(t-PA∶A,发色底物法之一):

①50mmol/L磷酸盐缓冲液。

②纤维蛋白-纤溶酶原共价物:375mg/L的纤维蛋白,250μ/L的纤溶酶原。

③发色底物:3mol/L S-2251(H-D-Val-Leu-Lys-PNA)。

④组织纤溶酶原激活原激活剂。

⑤0.25%醋酸。

⑥t-PA标准1和2(S15.6IU/ml,S22.8IU/ml)。

6.2 (2)活性测定(t-PA∶A发色底物法之二):

上海医科大学试剂盒。

①标准品t-PA(80IU)。

②去t-PA人血浆。

③人纤溶酶原。

④发色底物S-2390。

⑤浓缓冲液TB。

⑥加速剂。

⑦浓抗凝液。

⑧浓酸化液。

⑨其他:蒸馏水、50%冰醋酸。

6.3 (3)抗原测定(t-PA∶Ag)ELISA法:

①抗体:抗t-PAF(2b')2

②过氧化物酶抗体复合物抗:t-PA-peroxidase。

③基质:邻苯二胺。

④基质缓冲液:0.2mol/L柠檬酸,0.2mol/L柠檬酸钠缓冲液。

⑤稀释缓冲液:白蛋白-磷酸盐缓冲液(PBS-BSA)。

⑥洗涤液:0.025mol/L氯化钙-Tween-20-PBS缓冲液。

⑦t-PA标准:组织纤溶酶原缴活物。

⑧0.11mol/L柠檬酸钠溶液。

⑨30% H2O2

⑩终止液:3mol/L硫酸或1mol/L盐酸。

7 操作方法

(1)活性测定(t-PA∶A,发色底物法之一):

①血浆处理:按表1进行操作。

②操作方法:按表2进行。

(2)活性测定(t-PA∶A发色底物法之二):

①血浆制备:静脉采血,置于含1/10体积抗凝液的硅化试管中,尽快低温分离血浆。取血浆200μl,加酸化液200μl,混匀,置-30℃保存。测定时酸化血浆作1∶60稀释。

②取去t-PA血血浆和t-PA标准品配制标准t-PA系列(表3)。

③加样:取洁净96孔平底酶标板一块,将上述准备好的待测血浆样品和t-PA标准品加到各孔中,100μl/孔。

④发色底物混合液:将纤溶酶原、发色底物和加速剂混合,立即100μl/孔加至酶标板各孔中。

⑤反应:置湿盒中,37℃温育5h,加50%冰醋酸20μl终止反应。

⑥测定:测定各孔A405。以标准系列中不含t-PA孔调零点,然后读数。

(3)抗原测定(t-PA∶Ag)ELISA法:

①用0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释t-PA抗体。

②用稀释缓冲液稀释抗体-POD结合物。

③用基质缓冲液溶解邻苯二胺(8mg/ml),并加入10μl 30% H2O2

④将t-PA标准倍比稀释成10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125IU/ml。

⑤标本稀释:1份柠檬酸钠抗凝血浆加5份稀释液。如果估计t-PA值增高,血浆作1∶10稀释。

⑥用稀释之t-PA抗体包被ELISA反应板,每孔200μl,温育过夜,然后用洗涤液洗3次。

⑦加标准/标本200μl,温育1h后,同上洗涤3次。

⑧加过氧化物酶抗体复合物200μl,温育1h后,同上洗涤3次,洗后立即加基质。

⑨每孔加基质200μl,显色10~15min。

⑩加硫酸(3mol/L)50μl或盐酸(1mol/L)100μl,10min中止反应,于492nm,2h内比色,以稀释缓冲液为本底。

⑪据吸光度读数由标准曲线查得t-PA含量。

8 正常值

(1)活性测定(t-PA∶A,发色底物法之一):0.3IU/ml。

(2)活性测定(t-PA∶A发色底物法之二):  1.9±0.7IU/ml。

(3)抗原测定(t-PA∶Ag)ELISA法:        1~12ng/ml。

9 临床意义

(1)活性测定(t-PA∶A,发色底物法之一):

①肝坏死常伴有纤溶活性的异常,由于消除功能障碍,故t-PA∶A往往增高。但同时由于PAI的活性增强故t-PA的活性实际上是降低的。在DIC和伴有血栓形成倾向的疾病往往有t-PA活性减低。冠心病心肌梗死患者PA活性减低。

②先天性t-PA活性增强已有报道。急性早幼粒细胞白血病患者t-PA往往增高。

③遗传性PA活性缺乏为常染色体显性遗传。患者表现为多发性静脉血栓形形形成。

(2)活性测定(t-PA∶A发色底物法之二):

①t-PA∶A增高:表明纤溶活性亢进,见于原发性及继发性纤溶症,如DIC等。

②t-PA∶A减低:表明纤溶活性减弱,见于高凝状态和血栓性疾病。

(3)抗原测定(t-PA∶Ag)ELISA法:

①t-PA含量随年龄、剧烈运动和应激反应而增高,静脉滞留导致t-PA含量增加。

②先天性t-PA含量增高症。

③高血脂、肥胖症、口服避孕药、冠心病、心肌梗死、动脉血栓形成、缺血性中风等t-PA含量减低。

10 附注

(1)活性测定(t-PA∶A,发色底物法之一):

①血浆中肝素浓度超过1.5IU/ml,对本试验有影响。

②采血时最好不用止血带,加压后会引起t-PA进入血液。

③样本必须酸化处理。否则受PAI的影响较大。

(2)抗原测定(t-PA∶Ag)ELISA法:ELISA法是一项特异性和敏感性较高的免疫学试验。因此必须严格控制每项试验的条件。

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