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siRNA

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1 拼音

siRNA

2 概述

Small interfering RNA (siRNA):是一种小RNA分子(~21-25核苷酸),由Dicer(RNAase Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶)加工而成。双链RNA经酶切后会形成很多小片段,称为siRNA。SiRNA是siRISC的主要成员,激发与之互补的目标mRNA的沉默。

3 siRNA原理

RNA干涉(RNAi)在实验室中是一种强大的实验工具,利用具有同源性的双链RNA(dsRNA)诱导序列特异的目标基因的沉寂,迅速阻断基因活性。siRNA在RNA沉寂通道中起中心作用,是对特定信使RNA(mRNA)进行降解的指导要素。siRNA是RNAi途径中的中间产物,是RNAi发挥效应所必需的因子。siRNA的形成主要由Dicer和Rde-1调控完成。由于RNA 病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转录等原因,细胞中出现了dsRNA,Rde-1(RNAi缺陷基因-1)编码蛋白质识别外源dsRNA,当dsRNA达到一定量的时候,Rde-1引导dsRNA与Rde-1编码的Dicer(Dicer是一种RNaseIII 活性核酸内切酶,具有四个结构域:Argonaute家族的PAZ结构域,III型RNA酶活性区域,dsRNA结合区域以及DEAH/DEXHRNA解旋酶活性区)结合,形成酶-dsRNA复合体。在Dicer酶的作用下,细胞中的单链靶mRNA(与dsRNA具有同源序列)与dsRNA的正义链互换,原来dsRNA中的正义链被mRNA代替而从酶-dsRNA复合物中释放出来,然后,在ATP的参与下,细胞中存在的一种RNA诱导的沉默复合体RNA-induced silencing complex (RISC,由核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等构成,作用是对靶mRNA进行识别和切割)利用结合在其上的核酸内切酶的活性来切割dsRNA上处于原来正义链位置的靶mRNA分子中与dsRNA反义链互补的区域,形成21-23nt的dsRNA小片段,这些小片段即为siRNA。RNAi干涉的关键步骤是组装RISC和合成介导特异性反应的siRNA蛋白。siRNA并入RISC中,然后与靶标基因编码区或UTR区完全配对,降解靶标基因,因此说siRNA只降解与其序列互补配对的mRNA。其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达,所以是一种典型的负调控机制。siRNA识别靶序列是有高度特异性的,因为降解首先在相对于siRNA来说的中央位置发生,所以这些中央的碱基位点就显得极为重要,一旦发生错配就会严重抑制RNAi的效应。

4 siRNA的特点

1. 长度约在22nt左右。

2. 依赖Dicer酶的加工,是Dicer的产物,所以具有Dicer产物的特点。

3. 生成需要Argonaute家族蛋白存在。

4. 是RISC组分。

5. siRNA合成是由双链的RNA或RNA前体形成的。

6. siRNA是人工体外合成的,通过转染进入人体内,是RNA干涉的中间产物。

7. 结构上, siRNA是双链RNA。

8. 在Dicer酶的加工过程中, siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂。

9. 在作用位置上, siRNA可作用于mRNA的任何部位。

10. 在作用方式上, siRNA只能导致靶标基因的降解,即为转录水平后调控。

11. siRNA不参与生物生长,是RNAi的产物,原始作用是抑制转座子活性和病毒感染

5 siRNA制备方法

5.1 体外制备

化学合成

许多国外公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高,定制周期长,特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高,为一个基因合成3―4对siRNAs 的成本就更高了,比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。

最适用于:已经找到最有效的siRNA的情况下,需要大量siRNA进行研究

不适用于:筛选siRNA等长时间的研究,主要原因是价格因素

体外转录

DNA Oligo为模版,通过体外转录合成siRNAs,成本相对化学合成法而言比较低,而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的规模受到限制,虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs,但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比,还是需要占用研究人员相当的时间。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小,稳定性好,效率高,只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果,从而使转染效率更高。

最适用于:筛选siRNAs,特别是需要制备多种siRNAs,化学合成的价格成为障碍时。

不适用于:实验需要大量的,一个特定的siRNA。长期研究。

用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA

其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法――制备一份混合有各种 siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。选择通常是200―1000碱基的靶mRNA模版,用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ,然后用RNase III (or Dicer) 在体外消化,得到一种siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后,这个siRNA混合物就可以直接转染细胞,方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs,通常能够保证目的基因被有效地抑制。

dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤,为研究人员节省时间和金钱(注意:通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜)。不过这种方法的缺点也很明显,就是有可能引发非特异的基因沉默,特别是同源或者是密切相关的基因。现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。

最适用于:快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型。

不适用于:长时间的研究项目,或者是需要一个特定的siRNA进行研究,特别是基因治疗

5.2 体内表达

前面的3种方法主要都是体外制备siRNAs,并且需要专门的RNA转染试剂将siRNAs转到细胞内。而采用siRNA表达载体和基于PCR的表达框架则属于:从转染到细胞的DNA模版中在体内转录得到siRNAs。这两种方法的优点在于不需要直接操作RNA。

siRNA表达载体

多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种,操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA,而且它是通过添加一串(3到6个)U来终止转录的。要使用这类载体,需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链,退火克隆 到相应载体的pol III 启动子下游。由于涉及到克隆,这个过程需要几周甚至数月的时间,同时也需要经过测序以保证克隆 的序列是正确的。

siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究――带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达,持续数星期甚至更久。

病毒载体也可用于siRNA表达,其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究,避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便,而且转染效果更加稳定。

最适用于:已知一个有效的siRNA序列,需要维持较长时间的基因沉默。

不适用于:筛选siRNA序列(其实主要是指需要多个克隆 和测序等较为费时、繁琐的工作)。

siRNA表达框架

siRNA表达框架(siRNA expression cassettes,SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版,包括一个RNA pol III启动子,一段发夹结构siRNA,一个RNA pol III终止位点,能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。和siRNA表达载体不同的是,SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤,可以直接由PCR得到,不用一天的时间。因此,SECs成为筛选siRNA的最有效工具,甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配。如果在PCR两端添加酶切位点,那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后,可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。

这个方法的主要缺点是

①PCR产物很难转染到细胞中(晶赛公司的Protocol可以解决这一问题)

②不能进行序列测定,PCR和DNA合成时可能差生的误读不能被发现导致结果不理想

最适用于:筛选siRNA序列,在克隆到载体前筛选最佳启动子。

不适用于:长期抑制研究。(如果克隆到载体后就可以了)

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开放分类:生物学
词条siRNAababab创建,由sun进行审核
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参与讨论
  • 评论总管
    2020/11/29 13:12:41 | #0
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本页最后修订于 2009年2月18日 星期三 15:18:48 (GMT+08:00)
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