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石蜡切片

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1 拼音

shí là qiē piàn

2 英文参考

paraffin section

3 器材

切片刀,切片机,恒温箱,温台,熔蜡炉,蜡杯,酒精灯,蜡铲,展片台,解剖刀,解剖针,解剖剪,解剖盘,培养皿,吸管,镊子,单面刀片,台木,毛笔,洒精灯,包埋纸盒,染色缸,盖玻片,载玻片,玻片盘,树胶,树胶瓶,显微镜温度计,脸盆,水浴锅。

4 试剂

卡诺氏固定液、FAA固定液、各种浓度的酒精、二甲苯、石蜡蜂蜡、埃利希苏木精染液, 1%伊红酒精溶液,1%盐酸酒精溶液,甘油蛋白粘片剂,郝普特氏粘片剂,中性树胶。1%番红,1%固绿,1%过碘酸,Schiff试剂,0.5%偏重亚硫酸钠溶液,醋酸酐-吡啶混合液,0.5%~1%淀粉糖化酶溶液。

5 材料

鼠肝、肾、心肌骨骼肌或其他组织大豆小麦绿豆洋葱大蒜蚕豆的根、茎、叶等。

6 每个实验小组的用量

6.1 器材

切片机,切片刀,温台,恒温箱,熔蜡炉,水浴锅等这类几个小组用一台就行;解剖刀,单面刀片,小台木,毛笔一只,蜡铲一个,盖玻片和载玻片30个,脸盆一个,酒精灯各一个,包埋纸盒2~3个,染色缸一个,瓷杯3个,显微镜一台。

6.2 试剂

FAA固定液50ml、1%番红100ml、1%固绿100ml、1%过碘酸100ml、Schiff试剂100ml、亚硫酸盐300ml、醋酸酐-吡啶混合液100ml、0.5%~1%淀粉糖化酶溶液200ml,石蜡半盒、蜂蜡10块、埃利希苏木精染液100ml、1%伊红酒精溶液100ml、1%盐酸酒精溶液100ml、95%酒精5瓶、二甲苯2瓶,甘油蛋白粘片剂数滴,中性树胶数滴。

6.3 材料

小白鼠一只、蚕豆种,小麦和大豆种10~20粒,洋葱和大蒜由实验室统一种,然后取其所需部分。

7 石蜡切片法实例(一)

—苏木精-伊红对染法

7.1 目的要求

1、 熟悉石蜡切片的制作过程。

2、 掌握HE染色的基本原理和染色方法

7.2 实验原理

石蜡切片是最基本的切片技术,冰冻切片和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来的。苏木素与伊红对比染色法(简称H.E.对染法)是组织切片最常用的染色方法。这种方法适用范围广泛,对组织细胞的各种成分都可着色,便于全面观察组织构造,而且适用于各种固定液固定的材料,染色后不易褪色可长期保存。经过HE染色,细胞核被苏木素染成蓝紫色,细胞质被伊红染色呈粉红色。

7.3 实验用品

(一) 器材

切片机,切片刀,温台,恒温箱,解剖刀,镊子,剪刀,解剖针,单面刀片,小台木,洒精灯,包埋纸盒,染色缸,烧杯,水盆,熔蜡炉,蜡杯。

(二) 试剂

卡诺(Carnoy)固定液,埃利希苏木精染液,1%伊红酒精溶液,1%盐酸乙醇液,各级酒精(30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%),二甲苯,甘油蛋白粘片剂,中性树胶。

试剂配法:

1、卡诺氏固定液:

100%酒精3份

冰醋酸 1份

或:100%酒精6份

氯仿 3份

冰醋酸 1份

2、埃利希苏木精染液的配法:

苏木精 1g

纯酒精 50ml

冰醋酸 5 ml

甘油 50 ml

钾矾(硫酸铝钾)约5g(饱和量)

蒸馏水 50 ml

配法:

ⅰ、将苏木精溶于约15 ml的纯酒精中,再加冰醋酸后搅拌。

ⅱ、当苏木精溶解后即将甘油倒入并摇动容器,同时加入其余的酒精。

ⅲ、将钾矾在研钵中研碎并加热,然后将它溶解于水中。

ⅳ、将温热的钾矾溶液一滴一滴地加入上述染液中,并随时搅动。

ⅴ、此液混合完毕,将瓶口用一层纱布包着小块棉花塞起来,放在暗处通风的地方,并经常摇动以促进它的成熟。成熟时间约3~4周。若加入0.2g碘酸钠,可立刻成熟。此液稳定而染色均匀,染核效果良好,不会发生沉淀,长期贮备无妨。此液可分别与伊红等进行二重染色。

3、1%伊红酒精溶液:

伊红1g溶于100 ml95%酒精溶液。

4、1%盐酸乙醇液

盐酸 1份

70%酒精 100份

5、甘油蛋白贴片剂:

蛋白 50 ml

甘油 50 ml

水杨酸钠防腐剂) 1g

配制时将鸡蛋一个打破入碗或杯中,去蛋黄留下蛋白,用玻棒调打成雪花状泡沫,然后用粗纸或双层纱布过滤到量筒中,经数小时或一夜,即可滤出透明蛋白液。此时在其中再加等量的甘油,稍稍振摇使两者混合。最后加入防腐剂(水杨酸钠)作防腐用。可保存几个月。

(三) 材料

鼠肝

7.4 实验程序

1、 取材

颈椎脱臼法处死小鼠,打开腹腔,剪取肝组织(或小肠)。切取的组织块不宜太大,以便固定剂穿透,通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm为宜。取下所需要的肝组织,切成一小块2~3mm厚。

取材的注意事项:

(1)取材动作要迅速,不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。

(2)切片材料应根据需要观察的部位进行选择,尽可能不要损伤所需要的部分。

2、固定

将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下,立即投入卡诺固定液中固定,固定30~50min。

固定的注意事项:

(1)一般固定液,都以新配为好,配好后应贮存在阴凉处,不宜放在日光下,以免引起化学变化,失去固定作用

(2)有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用,一定要在使用前才混合,如果混合太早,固定时就没有作用了。

(3)固定材料时,固定液必须充足,一般为材料块的20~30倍,有些水分多的材料,中间应更换1~2次新液。

(4)材料固定完毕后,保存于严密紧塞或加盖的容器里,同时在容器外上标签,并随同材料在溶液中投入相应的标签,以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字,应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。

1、 洗涤

材料经固定后,除乙醇外,组织中的固定液必须冲洗干净,尤其是含有重金属的固定液。因为残留在组织中的固定液,有的不利于染色,有的产生沉淀或结晶影响观察。冲洗方法根据固定液的性质而定,固定液为水溶液的常用水洗涤,固定液含有乙醇的则用50%~70%乙醇冲洗。

2、 脱水

30%、50%、70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水各40min,放入95%、100%各两面三刀次,每次20min。各种材料经固定与洗涤后,组织中含有大量水分,由于水与石蜡不能互溶,所以必须将组织中的水分除去。

脱水注意事项

(1)脱水必须在有盖的玻璃品中进行,防止吸收气中的水分。

(2)在更换高一级的脱水剂时,最好不要移动材料以免损坏,可用吸管吸出器皿中的脱水剂,再用吸水吸尽器皿内剩余液,然后于皿中加入高一级脱水剂。

(3)在低浓度或纯酒精中,每级停留不宜太长,否则易使组织变软,助长材料的解体。

(4)在高浓度或纯酒精中,每级停留的时间也不宜太长,否则会使组织变脆,影响切片。

(5)如需过夜,应停留在70%酒精中。

(6)脱水必须彻底,否则不易透明,甚至使透明剂内出现白色混浊现象

5、透明

纯酒精、二甲苯等量混合液15min,二甲苯0.5h(或至透明为止),须换一次二甲苯。

由于乙醇与石蜡不相溶,而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡,所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时,光线可以透过,组织呈现出不同程度的透明状态。

透明注意事项

(1)使用透明剂时,要随时盖紧盖子,以免空气中的水分进入。

(2)更换每级透明剂,动作要迅速,一方面为了不使材料块干涸,另一方面能避免吸收湿气

(3)在透明过程中, 如果材料周围出现白色雾状,说明材料中的水未被脱净,应退回纯酒精中重新脱水,然后再透明。

6、透蜡

放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min,再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各20~30分钟。

透蜡的目的是除去组织中的透明剂(如二甲苯等),使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以

便包埋。透蜡时间根据组织的透蜡时间较长,约需1~2d。透蜡应在恒温箱内进行,并保持箱内温度在55~60℃左右,注意温度不要过高,以免组织发脆。置于恒温箱0.5h。

透蜡注意事项

(1)尽量保持在较低温度中进行,以石蜡不凝固为度;

(2)透蜡温度要恒定,不可忽高忽低;

(3)操作要迅速,力求在最短的时间内完成石蜡透入过程,以免引起组织变硬、变脆、收缩等。

1、 包埋

将经过透蜡的组织连同熔化的石蜡,一起倒入容器内,然后立即投入冷水中,使其立刻凝固成蜡块。

用于包埋的石蜡的熔点在50~60℃之间,包埋时应根据组织材料、切片厚度、气候条件等因素,选择不同熔点的石蜡。一般动物材料常用的石蜡熔点为52~56℃,植物材料用的石蜡熔点为54~58℃。

包埋的操作过程

包埋时,将纸盒放在已经加热的温台上,从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯,倒入包埋用的纸盒中,取出存放材料的蜡杯3,迅速轻轻地用镊子夹取材料平放于纸盒底部(注意切面朝下放置),再用温镊子轻轻拨动材料,使之排列整齐。轻轻将纸盒两侧的把手提起,慢慢地平放在面盆,并立即使它沉入水中,使盒中包埋块迅速凝固。待石蜡完全凝固(约30min)后即可取出备用。

2、 切片

①将已固定和修好的石蜡块台木装在切片机的夹物台上。

②将切片刀固定在刀夹上,刀口向上。

③摇动推动螺旋,使石蜡块与刀口贴近,但不可超过刀口。

④调整石蜡块与刀口之间的角度与位置,刀片与石蜡切片约成15度左右。

⑤调整厚度调节器到所需的切片厚度,一般为4~10微米。

⑥一切调整好后主可以开始切片。此时右手摇动转轮,让蜡块切成蜡带,左手持毛笔将蜡带提起,摇转速度不可太急,通常以40~50r/min。

⑦切成的蜡带到20~30cm长时,右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起,以免卷曲,并牵引成带,平放在蜡带盒上,靠刀面的一面较光滑,朝下,较皱的一面朝上。

⑧用单面刀片切取蜡片一小段,放在载玻上加水一滴,置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好。

⑨切片工作结束后,应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡,把切片机擦拭干净妥为保存。

3、 贴片

①、取一片清洁的载玻片,滴一滴粘片剂于玻片中央,然后用洗净的手指加以涂抹,便成

均匀薄层。

②、滴1~2滴的蒸馏水已涂粘片剂的载玻片上。

③、用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带,放在水面上,注意蜡片光亮平整的一面贴于玻片上,并使之处于稍偏玻片的一端,另一端便于粘贴标签。

④、把玻片摆好片位置,在酒精灯火焰上方适度加热至蜡片舒展。或放置置于预先加热的展片台上(温度保持在40~45℃)。此时蜡片因受热而伸展摊平。并使之处于稍偏玻片的一端,另一端便于粘贴标签。

⑤、展片后把载玻片放在平盘上编好记号置于37℃温箱烘干,一昼夜干燥后即可取出存放于切片盒待染。

10、脱蜡复水

石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5~10min,然后放入100%、95%、90%、80%、70%等各级酒精溶液中各3~5min,再放入蒸馏水中3min。

染色液多数为水溶液,因此,染色前必须将蜡脱去,使切片中的材料由有机相进入到水相。一般采用二甲苯脱蜡,逐级复水与脱水浸蜡过程正好相反,但是,由于蜡片较薄,所需时间比脱水浸蜡要短的多。

11、染色

切片放入苏木精中染色约10~30min。染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低,适当缩短或延长。室温高时促进染色,染色时间可短些,否则可适当延长时间,冬季室温低时可放入恒温箱中染色。

12、水洗

用自来水流水冲洗约15min。冲洗过程中使切片颜色发蓝(或放入碱性水中也可,但用促蓝剂对伊红可能拒染,如果时间来得及,应以流水冲洗使切片显示蓝色为宜),但要注意流水不能过大,以防切片脱落,并随时用显微镜检查见颜色变蓝为止。

13、分化

就是将细胞质着的色褪去,使细胞核着色更加鲜明,也称分色。将切片放入1%盐酸乙醇液(盐酸1份+70%乙醇100份)中褪色,见切片变红,颜色较浅即可,约数秒至数十秒钟。这一步骤是H.E.染色成败的关键,,如分化不当会导致染色不匀,或深或浅,得到的切片染色效果差。如果染色适中,可取消此步骤。

14、漂洗

切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。低倍镜检查见细胞核呈蓝色、结构清楚;细胞质或结缔组织纤维成分无色为标准。然后放入蒸馏水中漂洗一次。

15、脱水Ⅰ

切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3~5min。

16、复染

用0.5%伊红乙醇液对比染色2~5min。伊红主要染细胞质,着色浓淡应与苏木精染细胞

核的浓淡相配合,如果细胞核染色较浓,细胞质也应浓染,以获得鲜明的对比。反之,如果细胞核染色较浅,细胞质也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染,促使细胞质容易着色,并且经乙醇脱水时不易褪色。

17、脱水Ⅱ

放入95%乙醇中洗去多余的红色,然后放入无水乙醇中3~5min。最后用吸水纸吸干多余的乙醇。

18、透明

切片放入二甲苯-乙醇等量混合液中约5min,然后放入纯二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3~5min。二甲苯应尽量保持无水,应经常更换,或用纱布包无水硫酸铜放入染色缸内吸收水分。切片如在二甲苯中出现白雾现象,说明脱水未尽,应退回乙醇中重新脱水,否则切片难以镜检。

19、封藏:中性树胶封存

切片经染色、脱水、透明后,即可用封藏剂将其封藏起来,目的是永久保存切片,便于镜检。常用的封藏剂一类为干性封藏剂如中性树胶、加拿大树胶等,另一类为湿性封藏剂如甘油明胶等。如果切片是经二甲苯透明,则用树胶作为封藏剂,树胶可以用二甲苯稀释至合适的稠度。如果切片是直接从水中或水溶液中取出,则常用甘油明胶作为封藏剂,可用于短期保存标本

封藏的方法:

封片前应根据材料的大小,选用不同规格的盖玻片。材料透明后,按照下列方法进行封藏。在桌上放一张洁净的吸水纸,将含材料的载玻片从二甲苯中取出放在纸上(切片的一面向上),迅速地在切片的中央滴一滴树胶(千万不能待二甲苯干燥后再进行),用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧,稍为倾斜使其左侧与封藏剂接角,然后再缓慢地将盖玻片放下,这样就可以减少或避免产生气泡。如胶液不足,可以用玻棒再滴一滴树胶从盖玻片边缘补足。如胶液过多,可在干燥以后用刀刮去,并用纱布蘸二甲苯拭去残留的树胶。

染色结果:细胞核被苏木素染成蓝色,细胞质被伊红染色呈粉红色。

 

8 石蜡切片法实例(二)

——番红-固绿对染法

8.1 目的要求

1、 熟悉植物石蜡切片的制作过程。

2、 掌握番红-固绿对染法的基本原理和具体方法。

8.2 实验原理

石蜡切片法也是在研究植物细胞的形态结构等方面常用的制片方法。它可以使植物材料切成薄的薄片,又可以切成连续薄片,切片经染色,观察效果甚好。番红-固绿对染法,为

植物制片上最普遍的一种二重染色法,其染色程序简单并能清晰地显示出细胞的结构。番红为碱性染料,能使细胞核及木质化细胞壁染成红色;固绿为酸性染料,能使细胞质及纤维素的细胞壁染成绿色。

8.3 实验用品

(一) 器材

切片刀,切片机,温箱,温台,解剖刀,镊子,单面刀片,台木,毛笔,蜡铲,酒精灯,包埋纸盒,染色缸,玻片盘,温度计,脸盆。

(二)试剂

FAA固定液,1%番红,1%固绿,各级酒精(30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%),二甲苯,石蜡,郝普特氏明胶粘片剂,树胶。

试剂配法:

1、FAA固定液(福尔马林-醋酸-洒精混合液)

福尔马林 5 ml

50%或70%的洒 90 ml

冰醋酸 5 ml

此液适用于植物组织,此液中的酒精,有用50%的,也有用70%的,一般薄嫩的材料右用50%的,厚硬的材料用70%的,醋酸的用量也可根据材料情况作适当的改变,对一些大块而密实的组织可增加用量,同时减少福尔马林的用量。固定时间可因材料及醋酸含量的变化而异,一般为5~20h。固定的材料,一般无需用水洗,可直接从70%的酒精开始脱水。

1、 1%番红

番红1g溶于100ml水中。

2、 1%固绿

1g固绿溶于100ml95%酒精中。

3、 郝普特氏明胶粘片剂

明胶 1g

蒸馏水 100ml

石炭酸 2g

甘油 15ml

配制时先将明胶溶解于30℃的蒸馏水中(在水浴锅内进行),待溶解后再加石炭酸和甘油,搅拌均匀后,趁热过滤,贮存于玻璃瓶中。

(三)材料

大豆、小麦、绿豆、洋葱、大蒜、蚕豆等。

8.4 实验程序

1、 取材

取已培养好的大豆、小麦、蚕豆根或茎、叶等用刀片将其尖端约1.2cm根尖切割下来,用刀

片切割其成熟区部分成5mm长的小段(亦可切带侧根的部分),将切好的材料放入玻管中。

2、 固定

将FAA固定液倒入盛有材料的玻管中,固定时间为24h。

3、 冲洗

用70%酒精换洗3次,每次0.5-2h。

4、 脱水

80%、90%酒精各1-2h,纯酒精(中间换一次)1-2h。

5、 透明

等量纯酒精及二甲苯中1-2h,二甲苯(中间换一次)1-2h。

6、 透蜡

方法同前。

7、 包埋

方法同前。

8、 切片

根为横切面,其厚度为8~10um。

9、 贴片。

方法同前。

10、 番红-固绿对染法染色程序如下:

(1)切片在二甲苯中脱蜡,约10min。

(2)等量纯酒精二甲苯5min。

(3)经纯酒精,95%、90%、80%、70%、505、305各级酒精各5min。

(4)蒸馏水2-5min。

(5)1%番红水溶液染色2h左右。

(6)用水洗去多余染液。

(7)50%、70%、80%、90%、95%各级酒精脱水10min。

(8)1%的固绿(用95%酒精配制)染色10-40s。

(9)95%酒精洗一下。

(10)纯酒精脱水5min。

(11)等量纯酒精二甲苯混合液中5min。

(12)二甲苯5min。

(13)中性树胶封藏。

注意:

(1)番红与固绿在酒精中很容易脱色,因此在酒精中脱水时,不能放置太久。

(2)用固绿对染之前应检查番红染色的是否合适,所染颜色应稍深一些,以防其在以后脱水步骤中仍会脱色,如果太浅,应退回重染。

 

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开放分类:生物学
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  • 评论总管
    2019/10/16 22:59:03 | #0
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本页最后修订于 2009年9月26日 星期六 22:44:38 (GMT+08:00)
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