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凝集反应

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1 拼音

níng jí fǎn yìng

2 英文参考

agglutination

3 概述

凝集反应是一种血清反应颗粒性抗原(完整的病原微生物红细胞等)与相应抗体结合,在有电介质存在的条件下,经过一定时间,出现肉眼可见的凝集小块。参与凝集反应的抗原称为凝集原,抗体称为凝集素。可分为直接凝集反应和间接凝集反应两类。

直接凝集反应 颗粒状抗原(如细菌、红细胞等)与相应抗体直接结合所出现的凝集现象。分为玻片法和试管法。玻片法是一种定性验方法。可用已知抗体来检测未知抗原。若鉴定分离菌种时,可取已知抗体滴加在玻片上,将待检菌液一滴与其混匀。数分种后,如出现肉眼可见的凝集现象,为阳性反应。该法简便快速,除鉴定菌种外,尚可用于菌种分型、测定人类红细胞的ABO血型等。试管法是一种定量试验的经典方法。可用已知抗原来检测受检血清中有无某抗体及抗体的含量。用来协助临床诊断或供流行病学调查研究。操作时,将待检血清用生理盐水连续成倍稀释,然后加入等量抗原,最高稀释度仍有凝集现象者,为血清的效价,也称滴度,以表示血清中抗体的相对含量。诊断伤寒副伤寒病的肥达氏反应(Widaltest)、布氏病的瑞特氏反应(Wright test)均属定量凝集反应。

间按凝集反应 将可溶性抗原(或抗体)先吸附于一种与免疫无关的、一定大小的颗粒状载体的表面,然后与相应抗体(或抗原)作用。在有电介质存在的适宜条件下,即可发生凝集,称为间接凝集反应。用做载体的微球可用天然的微粒性物质,如人(O型)和动物(绵羊、家兔等)的红细胞、活性炭颗粒或硅酸铝颗粒等;也可用人工合成或天然高分子材料制成,如聚苯乙烯胶乳微球等。由于载体颗粒增大了可溶性抗原的反应面积,当颗粒上的抗原与微量抗体结合后,就足以出现肉眼可见的反应,敏感性比直接凝集反应高得多。

4 凝集反应的特点

细菌和红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后,可出现肉眼可见的凝集(agglutination)现象。早在1896年,Widal就利用伤寒病人的血清与伤寒杆菌发生特异性凝集的现象,有效地诊断伤寒病。至1900年Landsteriner在特异性血凝现象的基础上发现了人类血型,并于1930年获得了诺贝尔奖金。凝集试验灵敏度高,方法简便,迄今已成为通用的免疫学试验,广泛应用于临床检验

凝集反应的发生分两阶段:①抗原抗体的特异结合;②出现可见的颗粒凝集。通常,细菌和红细胞等颗粒抗原在悬液中带弱负电荷,周围吸引一层与之牢固结合的正离子,外面又排列一层松散的负离子层,构成一个双层离子云。在松散层内界和外界之间的电位差形成Z电位。溶液中的离子强度愈大,Z电位也就愈大。Z电位使颗粒相互排斥。当特异抗体与相应抗原颗粒互补结合时,抗体的交联作用克服了抗原颗粒表面的Z电位,而使颗粒聚集在一起。但当抗体分子太少,不足以克服相当厚度的离子云层时,则不能使颗粒聚集。因此在凝集反应中,IgM类抗体的作用比IgG类抗体要大数百倍,所以IgG类抗体常出现不完全反应,即不可见的抗原抗体反应。这种抗体有时又称不完全抗体。不完全的含义是:可与抗原牢固结合,但因其分子量较小,不能起到由桥联作用而形成的可见凝集现象。在试验过程中,为促使凝集现象的出现,可采取以下措施:增加蛋白质电解质,降低溶液中离子强度以缩短颗粒间的距离;增加试液的粘滞度,如加入右旋糖酐或葡聚糖等;用胰酶神经氨酸酶处理,改变细胞的表面化学结构;以离心方法克服颗粒间的排斥等。

凝集试验是一个定性的检测方法,即根据凝集现象的出现与否判定结果阳性或阴性;也可以进行半定量检测,即将标本作一系列对倍稀释后进行反应,以出现阳性反应的最高稀释度作为滴度。由于凝集反应方法简便,敏感度高,因而在临床检验中被广泛应用。

在免疫学技术中,凝集反应可分为直接凝集反应和间接凝集反应两大类。自身红细胞凝集试验和抗球蛋白参与的凝集试验是两种特殊的凝集反应。

5 直接凝集反应

细菌、螺旋体和红细胞等颗粒抗原,在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集,称为直接凝集反应(direct agglutination)。凝集反应中的抗原称为凝集原(agglutinogen),抗全称为凝集素(agglutinin)。常用的凝集试验有玻片法和试管法两种。

5.1 (一)玻片凝集试验

玻片凝集试验为定性试验方法,一般用已知抗体作为诊断血清、与受检颗粒抗原如菌液或红细胞悬液各加一滴在玻片上,混匀,数分钟后即可用肉眼观察凝集结果,出现颗粒凝集的为阳性反应。此法简便、快速,适用于从病人标本中分离得到的菌种的诊断或分型。玻片法还用于红细胞ABO血型的鉴定。

5.2 (二)试管凝集试验

试管凝集试验为半定量试验方法,在微生物学检验中常用已知细菌作为抗原液与一系列稀释的受检血清混合,保温后观察每管内抗原凝集程度,通常以产生明显凝集现象的最高稀释度作为血清中抗体的效价,亦称为滴度。在试验中,由于电解质浓度和pH不适当等原因,可引起抗原的非特异性凝集,出现假阳性反应,因此必须设不加抗体的稀释液作对照组。

临床上常用的直接试管凝集试验为肥达试验(Widal test)和外斐试验(Weil-Felix test)。在输血时也常用于受体和供体两者的红细胞和血清的交互配血试验。

6 间接凝集反应

将可溶性抗原(或抗体)先吸附于适当大小的颗粒性载体的表面,然后与相应抗体(或抗原)作用,在适宜的电解质存在的条件下,出现特异性凝集现象,称间接凝集反应(indirectagglutination)或被动凝集反应(passiveagglutination)。这种反应适用于各种抗体和可溶性抗原的检测,其敏感度高于沉淀反应,因此被广泛应用于临床检验。

6.1 间接凝集反应的类型

根据致敏载体用的是抗原或抗体以及凝集反应的方式,间接凝集反应可分为4类:

1.(正向)间接凝集反应用抗原致敏载体以检测标本中的相应抗体(图13-1)。

图13-1(正向)间接凝集反应原理示意图

2.反向间接凝集反应用特异性抗体致敏载体以检测标本中的相应抗原(图13-2)。

图13-2反向间接凝集反应原理示意图

3.间接凝集抑制反应诊断试剂为抗原致敏的颗粒载体及相应的抗体,用于检测标本中是否存在与致敏抗原相同的抗原。检测方法为将标本先与抗体试剂作用,然后再加入致敏的载体,若出现凝集现象,说明标本中不存在相同抗原,抗体试剂未被结合,因此仍与载体上的抗原起作用。如标本中存在相同抗原,则凝集反应被抑制(图13-3)。同理可用抗体致敏的载体及相应的抗原作为诊断试剂,以检测标本中的抗体,此时称反向间接凝集抑制反应。

图13-3间接凝集抑制反应原理示意图

A:标本中含抗原B:标本中不含抗原

4.协同凝集反应协同凝集反应(coaggoltination)与间接凝集反应的原理相类似,但所用载体既非天然的红细胞,也非人工合成的聚合物颗粒,而是一种金黄色葡萄球菌。它的菌体细胞壁中含有A蛋白(staphylococcusprotienA,SPA)。SPA具有与IgG的Fc段结合的特性,因此当这种葡萄球菌与IgG抗体连接时,就成为抗体致敏的颗粒载体。如与相应抗原接触,即出现反向间接凝集反应。协同凝集反应也适用于细菌的直接检测。

在间接凝集反应中,可用作载体的颗粒种类很多,常用的有动物或人红细胞、细菌和多种惰性颗粒如聚苯乙烯胶乳(polystyrenelatex)、皂土(bentonite)及明胶颗粒、活性炭、火棉胶等。在临床检验中最常用的为间接血凝试验和胶乳凝集试验。

6.2 间接血凝试验

血凝试验(hemagglutinationtest)是红细胞凝集试验的简称。间接血凝试验是以红细胞作为载体的间接凝集试验,在临床检验中应用广泛,以下简述其操作过程。

(一)载体

红细胞是大小均一的载体颗粒,最常用的为绵羊、家兔、鸡的红细胞及O型人红细胞。新鲜红细胞能吸附多糖类抗原,但吸附蛋白质抗原或抗体的能力较差。致敏的新鲜红细胞保存时间短,且易变脆、溶血污染,只能使用2~3天。为此一般在致敏前先将红细胞醛化,可长期保存而不溶血。常用的醛类有甲醛戊二醛丙酮醛等。红细胞经醛化后体积略有增大,两面突起呈圆盘状。

醛化红细胞具有较强的吸附蛋白质抗原或抗体的能力,血凝反应的效果基本上与新鲜红细胞相似。如用两种不同醛类处理效果更佳。也可先用戊二醛,再用鞣酸处理。醛化红细胞能耐60℃加热,并可反复冻融不破碎,在4℃可保存3~6个月,在-20℃可保存一年以上。

(二)致敏

致敏用的抗原或抗体要求纯度高,并保持良好的免疫活性。用蛋白质致敏红细胞的方法有直接法和间接法。直接法只须在低pH,低离子浓度下,用醛化红细胞直接吸附即可。间接法则需用偶联剂将蛋白质结合到红细胞上。常用偶联剂为双偶氮联苯胺(bidiazotizedbenzidine,BDB)和氯化铬。前者通过共价键,后者通过金属阳离子静电作用使蛋白质与红细胞表面结合而达到致敏的目的。

(三)血凝试验

可在微量滴定板或试管中进行,将标本倍比稀释,一般为1:64,同时设不含标本的稀释液对照孔。在含稀释标本1滴的板孔(或试管)中,加入0.5%致敏红细胞悬液1滴,充分混匀,置室温1~2小时,即可观察结果。凡红细胞沉积于孔底,集中呈一圆点的为不凝集(一)。如红细胞凝集,则分布于孔底周围。根据红细胞凝集的程度判断阳性反应的强弱(图13-4),以++凝集的孔为滴度终点。

图13-4血凝反应强度示意图

-:红细胞沉积于孔底;+:红细胞沉积于孔底,周围有散在少量凝集;

++:红细胞形成层凝集,面积较小,边缘较松散;+++:红细胞形

成片层凝集,面积略多于++;++++:红细胞形成片层凝集,均匀

布满孔底,或边缘皱缩如花边状

6.3 胶乳凝集试验

胶乳凝集试验也是一种间接凝集试验,所用的载体颗粒为聚苯乙烯胶乳,是一种直径约为0.8μm大小的圆形颗粒,带有负电荷,可物理性吸附蛋白分子,但这种结合牢固性差。也可制备成具有化学活性基团的颗粒,如带有羧基的羧化聚苯乙烯胶乳等,抗原或抗体以共价键交联在胶乳表面。化学交联一般通过缩合剂碳化二亚胺将胶乳上的羧基与被交联物上的氨基缩合在一起。这种用交联致敏的胶乳试剂性能稳定保存期长。

胶乳凝集试验分试管法与玻片法。试管法先将受检标本在试管中以缓冲液作倍比稀释,然后加入致敏的胶乳试剂,反应后观察胶乳凝集结果。玻片法操作简便,一滴受检标本和一滴致敏的胶乳试剂在玻片上混匀后,连续摇动2~3min即可观察结果。出现凝集大颗粒的为阳性反应,保持均匀乳液状为阴性反应。胶乳为人工合成的载体,因此其性能比生物来源的红细胞稳定,均一性好。但胶乳与蛋白质的结合能力以及凝集性能不如红细胞,因此作为间接凝集试验,胶乳试验的敏感度不及血凝试验。

6.4 间接凝集反应的作用

间接凝集反应具有快速、敏感、操作简便、无需特殊的实验设备等特点,而且能用于抗原或抗体的测定,因此在临床检验中广为应用。

(一)抗原的检测

反向间接凝集试验可用于检测病原体的可溶性抗原,也可用于检测各种蛋白质成分。间接凝集反应的敏感度虽较沉淀反应高,但低于新发展的各种标记免疫测定。因此在微量抗原测定中其实用性取决于临床的要求。例如测定尿液HGG的胶乳凝集妊娠试验,直接凝集法的敏感度约为300mIU/ml,凝集抑制法的敏感度约为1000mIU/ml,停经35~40天以上的孕妇可测得阳性结果。检测乙型肝炎表面抗原HBsAg)的间接血凝试验敏感度一般在2~5ng/ml,对献血员的筛检已不符合要求。

(二)抗体的检测

可用于检测细菌、病毒寄生虫感染后产生的抗体,例如间接血凝试验或明胶颗粒凝集试验用于检测抗人免疫缺陷病毒(HIV)抗体以诊断艾滋病、胶乳凝集试验用于检测抗溶血素O等。也有用于检测自身免疫性疾病的抗体,例如类风湿因子胶乳凝集试验、抗DNA抗体抗甲状腺球蛋白抗体的间接血凝试验等。

7 自身红细胞凝集试验

自身红细胞凝集试验(autologousred cell agglutination assay)与一般间接血凝试验不同之处为反应中的红细胞是未经致敏的受检者新鲜红细胞。主要试剂材料为抗人O型红细胞的单克隆抗体,这种抗体能与不论何种血型的红细胞结合,但不引起凝集反应。这种抗体与另一特异性抗体连接成的双功能抗体可用于检测标本中的抗原;如与特异性抗原连接,则可用于检测标本中的抗体。反应中的标本为受检者的全血

图13-5 自身红细胞凝集试验原理示意图

A:检测抗原;B:检测抗体

试验的过程如下:在白色塑料片上加血液标本1滴和上述试剂1滴,混匀,2min后观察结果,出现红细胞凝集为阳性。反应机制见图13-5。血液标本中的红细胞和抗原(或抗体)分别与试剂中的抗红细胞单克隆抗体和特异性抗体(或抗原)反应,形成网络而导致红细胞的凝集。

自身红细胞凝集试验的特点是受检标本为全血,不需分离血清,采指血或耳垂血进行试验,受检者即刻可知检测结果。此试验已成功地用于抗HIV抗体的检测。也有检测HbsAg的试剂供应,其敏感度与间接血凝试验相仿。

8 抗球蛋白参与的血凝试验

抗球蛋白参与的血凝试验由Coombs于1945年建立,故又称为Coombs试验,是检测抗红细胞不完全抗体的一种很有用的方法。所谓不完全抗体,多半是7S的IgG类抗体,能与相应的抗原牢固结合,但在一般条件下不出现可见反应。Coombs利用抗球蛋白抗体作为第二抗体,连接与红细胞表面抗原结合的特异抗体,使红细胞凝集。经常用作试验的有两类方法。

8.1 (一)直接Coombs试验

将含球蛋白的试剂直接加到红细胞表面结合抗体的细胞悬液中,即可见细胞凝集(图13-6)。可用玻片法定性测定,也可用试管法作半定量分析。常用于新生儿溶血症自身免疫性溶血症、特发性自身免疫性贫血和医源性溶血性疾病等的检测。

图13-6直接Coombs试验

8.2 (二)间接Coombs试验

用以检测游离的血清中的不完全抗体。将受检血清和具有待测不完全抗体相应抗原性的红细胞相结合。再加入抗球蛋白抗体就可出现可见的红细胞凝集(图13-7)。此试验多用于检测母体Rh(D)抗体,以便及早发现和避免新生儿溶血症的发生。亦可对红细胞不相容的输血所产生的血型抗体进行检测。

图13-7间接Coombs试验

Coombs试验除了广泛应用于血液病的检测外,还可采用专一特异性的抗球蛋白的血清如IgG血清、抗IgA或抗IgM以及抗补体血清等,分析结合于红细胞上的不完全抗体的免疫球亚类。

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开放分类:生物学
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  • 评论总管
    2019/5/26 10:00:13 | #0
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本页最后修订于 2012年3月11日 星期日 23:41:54 (GMT+08:00)
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