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毛细管电泳

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1 拼音

máo xì guǎn diàn yǒng

2 英文参考

Capillary Electrophoresis

毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)又叫高效毛细管电泳(HPCE), 是近年来发展最快的分析方法之一。1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在75μm内径毛细管柱内用高电压进行分离, 创立了现代毛细管电泳。1984年Terabe等建立了胶束毛细管电动力学色谱。1987年Hjerten 建立了毛细管等电聚焦, Cohen和Karger提出了毛细管凝胶电泳。1988~1989年出现了第一批毛细管电泳商品仪器。短短几年内, 由于CE符合了以生物工程为代表的生命科学各领域中多肽蛋白质(包括酶,抗体)、核苷酸乃至脱氧核糖核酸(DNA)的分离分析要求, 得到了迅速的发展。

3 高效毛细管电泳的基本原理

粒子在电场作用下,以不没的速度向电荷反方向迁移和现象,是一种在空芯、微小内径的毛细管(内径10~200um)中进行的大、小分子的高效分离技术,毛细管两端分别浸入缓冲液中分别插入连有高压电源的电极,该电压使得分析样品沿毛细管迁移,根据被分离物之间电荷和体积的不同,各种分子在高电压下被分离,在自由区带毛细管电泳中,电泳的移动(带电荷分子朝相反极性的电极方向移动)和电渗流(在毛细管内壁上的电荷和应用的势能而引起的电解质移动)导致了分离。

电渗流的大小取决于电场强度、电解质的PH、缓冲液的组成和离子强度、内磨擦和毛细管表面的等特点,这些因素能单一或互相结合地提高分离效果,检测可使用UV直接通过毛细管上的小窗口进行检测,也可选择激光诱发荧光、二极管阵列、电化学和质谱检测器检测。样品进样方式是应用气压或电压将样品压入毛细管中完成。高效毛细管电泳具有多样化分离模式,其分离的机理是不同的,它们之间具有相互补充的作用。

4 高效毛细管电泳的分离模式

4.1 毛细管区带电泳(Capillary Zone Electroporesis,CZE)

分离原理:毛细管区带电泳出称为自由溶液毛细管电泳,是毛细管电泳是最简单的一种形式。其分离机理是基于各被物质的净电荷与质量之间比值的差异,不同离子按照各自表面电荷密度的差异,以不同的速度在中解质中移动而导致分离,它要求缓冲液具有均一性,毛细管内各处具有恒定的电场强度,是目前应用最广的一种分离模式。适用于蛋白质、氨基酸、多肽类和离子的分析。毛细管中除电解液外,无需填充任何物质,操作容易,自动化程度高。

4.2 毛细管凝胶电泳(Capillary Gel Electrophoresis,CGE)

分离原理:凝胶电泳是凝胶移到毛细管中用为支撑物进行分离的区带电泳。凝胶是一种固态的分散的体系。具有多孔性,类似于分子筛的作用,被分离物在通过装入毛细管内的凝胶力,按照各自分子的体积大小逐一分离,分子体积大的首先被分离出来,适用于生物大分子的分析,可纯粹按分子体种大小进行分离(SDS-PAGE),以决定蛋白质的分子量,可以识别一个碱基差异的寡核苷酸,可分离DNA片段,如微卫星(STR)分析,可改变凝胶的浓度不控制分离的范围,如PCR产物的分析。

4.3 胶束电动斩学毛细管色谱(Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography,MECC)

分离原理:是电泳技术和色谱技术的交叉,当把离子型表面活性剂加入缓冲液中,并且其浓度足够大时,这种表面活性剂的单体就结合在一起,形成球体(胶束)。目前以十二烷基磺酸钠(SDS)胶束用的最为普遍,MECC存在二个相之间分配,由于它们在胶束中具有保留能力而产生不同的保留时间,和CZE一增,缓冲液在管壁处形成正电,产生强烈的向负极方向移动的最渗流,面SDS胶束由于外壳带负电性,具有向正极迁移的倾向,一般电渗流的速度>胶束向正极迁移速度,迫使胶束最终以较低的速度向负极移动。中性粒子之间的分离是根据其本身的疏水性的不同而达到的,不同疏水性的粒子和胶束的相互作用不同。疏水性强的作用力大,保留的时间长。

MECC是目前惟一既能分离中性离子又能分离带电组分的HPCE模式。

4.4 等电聚焦电泳(Isoelectric Focusing,IEF)

分离原理:两性电解质在分离介质中的迁移,在毛细管内形成pH梯度,各种具有不同等电点的多肽和蛋白质按照这一梯度迁移到其不同的等电位置并停下,由此产生一条非常窄的聚焦区带,利用等电点的细微差异进行分离,将不同的蛋白质聚焦在不同的位置上后,阴极的缓冲液换成盐类,再加上高压,使末端引起梯度降低,让组分一个个通过检测器可求得精确的等电点。

4.5 等速聚焦电泳(Isotachophoresis,ITP

分离原理:在被分离组分与电解质一起向前移动的同时进行聚焦分离的电泳方法,与IEF一样,ITP在毛细管中的电渗流为零,缓冲系统前后两种不同淌度的电解质组成,分离时毛细管内首先导入尾随电解质(淌度低于被分离组分)。在强电场的作用下,各被分离组分在两种电解质之间的空隙是发生聚焦分离。

选择处理或未处理硅交毛细管均右,电渗流可用0.25%羟脯氨酰甲本纤维抑制.前导电解质:5nM磷酸,尾随电解质:缬氨酸,在分离开始时,电流会由于高淌度的电解质完全充满毛细管而迅速增大,进入分离过程时,电流会随着低淌度的电解质进入毛细管而下降.

4.6 毛细管电色谱(capillary electrochromatography,CEC)

分离原理:是将高效液相色谱众多的固定相填冲到毛细管中,以样品与固定相间的相互作用为分离机制,以电流流相为驱动力的色谱过程.

4.7 亲和毛细管电泳(affinity capillary electrkphoresis,ACE)

分离原理:在电泳过程中具有生物专一性亲和力,即受体(recepror)和配体(ligand)相互间发生的特异亲和作用.形成了受体的配体的复合物.对受体和配体在发生亲和作用前后的电泳图谱变化,可获得有关受体和配体亲和力大小结构变化作用产物等方面的信息.

4.8 电动色谱(electrokinetic chromatography,EKC)

分离原理:是根据电动现象命名的一种电泳模式,涉及电渗,电泳和色谱三方面的原理,主要用于手性化合物的分离.

4.9 非水相毛细管电泳(non-aqueous capillary electrphoresis,NACE)

分离原理:是分析物在有机溶剂中进行电泳分离的一种模式,使用非水相介质可增加方法的选择性,并有利于非水溶性物质的分离.

5 高效毛细管电泳的临床应用

5.1 血清蛋白质分析

采用CE分离血清蛋白获得的效果,并能准确计算各蛋白质的相对浓度,避免了凝胶电泳法染色,脱色过程中多种影响因素造成的误差,HPCE法的结果重复性好,可信度高,便于贮存和检索。前白蛋白在血清中的浓度可表明营养状态,且是确定恶性肿瘤炎症肝硬化何杰金氏病的重要指标,多数电泳法难以分辨,而用HPCE法很容易分离定量,检测波长为214或200nm.CE增加了增加了白蛋白部分的分辨率,这导致对双白蛋白血症检测的灵敏度有了很大的提高.CE提供了足够的在α1区的分辨率以区分α1酸性糖蛋白与α1抗胰蛋白酶.在α2区的球蛋白区, α2巨球蛋白与触球蛋白不易区分,但在β-球蛋白区具高分辨率,CE法对肾病综合征,慢性炎症,自身免疫病和肝硬化等多克隆免疫球蛋白的分析显示明确的特征,血清蛋白电泳是单克隆蛋白(monoclonal protein,MP)血症重要的筛选试验,如多发性骨髓瘤,巨球蛋白血症,对典型的单克隆轻链和你浓度单克隆蛋白的检测有较高的敏感性.寡克隆蛋白成分是未确定临床意义或反映某种传染病存在的一种寡克隆γ-球蛋白血症,也是临床上某些疾病过程的组成部分,如B-细胞淋巴瘤,使用化学免疫抑制剂,自身免疫免疫复合物病等的线索.

5.2 免疫碱法(Immunosubtraction)鉴别单克隆蛋白的特征

用特异的抗同型免疫球蛋制品(IgG IgA IgM Kappa Lambda)抗体包被琼脂糖凝胶(Sepharose)球与血清样品一起孵育,在孵育前与孵育后分别进行CE检测,通过用特异性抗体包被的Sepharose球消除一个特殊的峰来指示是哪种单克隆成分,借此对免疫球蛋白的型、亚型和轻链型予以鉴定分类

5.3 血红蛋白成分的分析

用等电聚焦毛细管电泳(CIEF)和区带电泳(CZE)可分离出十几种Hb变异链,有作者采用CZE法对正常人和地中海贫血患者血液样品在PH11.8碱性磷酸盐缓冲液(PBS)中进行分离 ,分离的速度很快(<8min),两者的电泳图谱明显不同,对胎儿红细胞处理后,分离其血红蛋白,可分离出α、β和γ球蛋白链,和C几种球蛋白链,如采用低pH3.2的缓冲液,虽然分析时间延长,但变异体的分辨效果更佳,显然CE技术对鉴别诊断血红蛋白病起重要作用.

5.4 肌红蛋白分析

急性心肌梗死后患者的血甭和尿液中常出现的肌红蛋白异常升高,低浓度肌红蛋白难以用免疫比浊法测定,CZE可在8分钟内快速分离尿中低浓度肌红蛋白并与血红蛋白相鉴别.

5.5 脂蛋白分析

可将血浆脂蛋白分离出14个亚组份,如在分离缓冲液中加入表面活性剂,可在短时间内对两个主要组份:高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)进行定量,对LDL进一步分离为三个亚组份:LDL,中密度脂蛋白(ILD)和极低密度脂蛋白(VLDL),并对各组份的比例进行推算,从而对脂蛋白异常提供不同脂肪代谢的信息.

5.6 糖化血红蛋白(HbAlc)分析

CE能分离几种糖蛋白的糖基构型,可鉴别糖化血红蛋白A1、Alc和其他异构体,对糖尿病的监控具有重要意义。

5.7 同功酶的分离

应用HPLC技术对多种同功酶进行了成功的分离,其原理是先将样品在毛细管中电泳分离,待形成同功酶分离区带后,切断电源,再加入含底物的液体缓冲液,酶可催化底物而显色,形成右检测的同功酶区带,再重新接通电源,继续电泳,使同功酶形成的染色区带先后通过检测器,测定最大吸收外的光密度值,因此被分离同功酶可被分析并测定,如检测βb-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的A、B同工酸、淀粉酶P(胰)和S(唾液)型、肌酸磷本激酶、碱性磷酸酶蛋白水解酶、γ-谷氨酰胺基转肽酸、激肽释放酶血管紧张素还原酶、组织蛋白酶B和5′核苷酸酶等,均可采用HPCE技术分离其同功酶。

5.8 免疫复合物分析

CE可将免疫复合物从结合的抗原抗体中迅速分离出来,应用荧光标记单克隆抗体,经L功F-CE检测限可达毫克量,可用于混合液体中低浓度的免疫复合物鉴定。

5.9 DNA片段和染色体分析

HPCE分离DNA分子需多聚物交联剂如聚丙酰稀胺,聚乙二醇甲基纤维素等材料添加到缓冲液中作为分子筛,可对窄范围DNA高效分离,有作者应用HPCE适应X连锁隐性遗传病,成功地对DNA限制片段进行了基因多态性分析。研究表明HPCE可用于分析携带者及胎儿产前诊断,目前,CE可分离3个bpDNA片段,若分析较大分子DNA片段,当然HPCE分析DNA片段尚有许多技术需要完善,其中最为突出的问题是选择合适的交联剂,提高现有方法的分辨率,成为分析基因组的有效工具。

5.10 在治疗药物监测中的应用

CE可简便快速分析生物样品中各种形式的药物成分,在药理学研究,法医学检查及临床毒理等方面也有广泛应用。如:抗肿瘤药氨甲蝶呤先经固相萃取,HPCE分离后用激光激活荧光检测器测定,其检测限可达0.1~1nmol/L;抗白血病药物孢嘧啶-β-D阿拉作糖苷,经简单有机溶剂提取样品,检测限为8umol/L;应用筛孔电动毛细管电泳(MECC)可监测类抗高血压药物(furopyr功d功ne),在分离液中加入SDS和γ-环糊精.经有机溶剂提取,最低检测限为10ug/L在临床常规用药的检测方面.如抗生素类药物阿莫西林可以不需进行样品的前处理,直接参与以血浆样品进样,但缓冲液中加入SDS可减少蛋白的管壁吸附;头孢类抗生素(Cef功x功me)经口服可被胃肠菌分解为五种代谢产物,其最终产物由尿液排泄,检测其血和尿药物浓度可作为临床观察指标;有的药物分析用其血和尿药物浓度可作为临床观察指标;有的药物分析用MECC可直接分离,不必特殊处理,如平滑肌解痉药(flavoxate).能缓解泌尿结石患者的疼痛.取患者尿液作MECC测定,检测限可达200ug/L.止喘药(theophyll功ne)为治疗哮喘,早产儿窒息的常用药,取血清,唾液和尿液样品,以直接进样多波长测定,其线性范围为0~200umol/L,浓度在5~110范围时有较好的精确度.催眠镇静类药物临床应用范围广,品种多,易发生药物依赖性,且中毒剂量与治疗剂量接近.如需进行药物浓度监测,最低检测限可达ng/L.抗癫阐(felbamate)也均可直接进入血,尿样品,还可分析人体中毒物的成分,如吗啡及其主要代谢产物海洛因,可卡因,吗啡等镇静药.在糖尿病的治疗监测中,可检测血中优降糖的浓度.防止药物使用不当导致低血糖.

5.11 其他小分子/离子的检测能

在3~4m功n内分离血和尿样品中血管造影剂含量、草酸盐等弱阴离子,检测尿样中十几种卟啉物质和维生素C异构体。在新生儿遗传有机酸尿症筛查中可检测10种有机酸标志物,如丙二酸二甲脂、戊二酸,3-甲基戊二酸、N-乙酰天冬氨酸、2-氨基乙酸丙酸乳酸、异戊酸、尿黑酸、2-氧你异戊酸等。

6 展望

传统电泳技术其局限性在于两端电压达到一定值时,会在电解质离子流中产生自热(焦耳热),引起径向黏度和速度的梯度,导致区带较宽、效率降低。高效毛细管电泳其根本在于它是散热效率极高的毛细管内(10~200mm)进行,操作简单,分析速度快,进样较其他分离方法少,仅需毫微升,灵敏度高,成本相对低,反复使用毛细管和可自行配制缓冲液。自八十年代以来得到了迅速发展,分为临床型和科研型两大类,临床型应用最多的是蛋白质分析与鉴定,该技术已十分成熟,国外在90年代已作为常规试验,国内也正在掀起。高效毛细管电泳是当今分析化学和生物医药学公认的前沿,该技术必将被临床医学实验室所接受。不仅能用于常规项目的分析,还可以用于其他特殊项目的检验,在许多其他领域内的临床应用也产生重大作用。

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  • 评论总管
    2019/10/22 6:59:32 | #0
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本页最后修订于 2009年9月26日 星期六 22:55:11 (GMT+08:00)
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2019/10/22 6:59:32