1 拼音
kǎ jiè jūn duō táng hé suān zhù shè yè
2 英文参考
BCG Polysaccharide andNucleic Acid Injection[2010年版药典]
3 卡介菌多糖核酸注射液药典标准
3.1 品名
3.1.1 中文名
卡介菌多糖核酸注射液
3.1.2 汉语拼音
Kajiejun Duotang Hesuan Zhusheye
3.1.3 英文名
BCG Polysaccharide and Nucleic Acid Injection
3.2 定义、组成及用途
本品系用卡介菌经培养后收集菌体，采用热酚法提取菌体中的多糖与核酸，经纯化后以灭菌生理氯化钠溶液配制而成。不含防腐剂和抗生素。
3.3 1 基本要求
生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
卡介菌多糖核酸制造及检定设施必须与其他生物制品制造室严格分开。所需用具如高压锅、冰箱及器具等，均须单独设置并专用。从事卡介菌多糖核酸制造的工作人员及进入卡介菌多糖核酸制造室的人员，必须身体健康，经X线检查无结核病，且以后每年需接受X线检查1～2次，可疑者应暂离卡介菌多糖核酸制造室工作，其健康检查记录必须保存备查。
3.4 2 制造
3.4.1 2.1 菌种
生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”规定。
3.4.1.1 2.1.1 名称及来源
采用卡介菌CMCC95060（D2PB302）菌株。严禁采用通过动物传代的菌种用于生产。
3.4.1.2 2.1.2 种子批的建立
应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”规定。
3.4.1.3 2.1.3 种子批的传代
自工作种子批启开至菌体收集，传代应不超过12代。
3.4.1.4 2.1.4 种子批的检定
2.1.4.1 鉴别试验
（1）培养特性
卡介菌在苏通培养基上生长良好，培养温度为37～39℃之间。抗酸染色应为阳性。在苏通马铃薯培养基上培养的卡介菌应干皱成团略呈浅黄色。在牛胆汁马铃薯培养基上为浅灰色黏膏状菌苔。在鸡蛋培养基上有突起的皱型和扩散型两类菌落，且带浅黄色。在苏通培养基上卡介菌应浮于表面，为多皱、微带黄色的菌膜。
（2）鉴别试验
采用多重PCR法检测卡介菌基因组特异的缺失区RD1，应无RD1序列存在，供试品PCR扩增产物应为196bP核酸片段，并与检测参考品一致。
2.1.4.2 纯菌试验
按（2010年版药典三部附录Ⅻ A）的方法进行，生长物做涂片镜检，不得有杂菌。
2.1.4.3 毒力试验
用结核菌素纯蛋白衍生物皮肤试验（皮内注射0.2ml，含10IU）阴性、体重300～400g的同性豚鼠4只，各腹腔注射1ml菌液（5mg/ml），每周称体重，观察5周动物体重不应减轻；同时解剖检查，大网膜上可出现脓疱，肠系膜淋巴结及脾可能肿大，肝及其他脏器应无肉眼可见的病变。
2.1.4.4 无有毒分枝杆菌试验
用结核菌素纯蛋白衍生物皮肤试验（皮内注射0.2ml，含10IU）阴性、体重300～400g的同性豚鼠6只，于股内侧皮下各注射1ml菌液（10mg/ml），注射前称体重，注射后每周观察1次注射部位及局部淋巴结的变化，每2周称体重1次，豚鼠体重不应降低。6周时解剖3只，满3个月解剖另3只，检查各脏器应无肉眼可见的结核病变。若有可疑病灶时，应做涂片和组织切片检查，并采取部分病灶磨碎，加少量生理氯化钠溶液混匀，由皮下注射2只豚鼠，若证实系结核病变，该菌种即应废弃。当试验未满3个月时，豚鼠死亡则应解剖检查，若有可疑病灶，即按上述方法进行，若证明系结核病变，该菌种即应废弃。若证实属非特异性死亡，且豚鼠死亡1只以上时应复试。
3.4.1.5 2.1.5 种子批的保存
种子批应低温冷冻保存或冻干后保存于8℃以下。
3.4.2 2.2 精制卡介菌多糖核酸
3.4.2.1 2.2.1 生产用培养基
生产用培养基为苏通马铃薯培养基、胆汁马铃薯培养基或液体苏通培养基。
3.4.2.2 2.2.2 菌种传代与培养
启开工作种子批菌种，在苏通马铃薯培养基、胆汁马铃薯培养基以及液体苏通培养基上每传1次为1代。在马铃薯培养基上培养的菌种放冰箱保存，不得超过2个月。用于生产的培养物的代次不得超过12代。
3.4.2.3 2.2.3 菌体收集
培养物应逐瓶检查，若有污染、浑浊等情况应废弃。收集马铃薯培养基内培养物或液体苏通表面培养物，压干，加入适量注射用水，以高速粉碎机破碎菌体后备用。
培养物自收获之日起，其低温（-20℃以下）保存的时间不得超过2周，且每个提取批混合的菌体不得超过5个培养批。
3.4.2.4 2.2.4 提取
取破碎菌悬液与等量热酚混匀，静置或离心沉淀菌体，收集上清液，可采用凝胶层析过滤法、超滤法或其他适宜的方法除酚，所用方法应为经批准的方法。除酚后的上清液加入适量乙醇沉淀多糖核酸，收集沉淀物。分别以乙醇、乙醚混匀洗涤，离心或抽滤后干燥即得精制多糖核酸。
3.4.2.5 2.2.5 精制多糖核酸检定
按3.1项进行。
3.4.2.6 2.2.6 精制多糖核酸保存与有效期
应密封避光保存。自干燥之日起有效期为18个月。
3.4.3 2.3 半成品配制
用生理氯化钠溶液将精制多糖核酸稀释至多糖浓度为0.35mg/ml，核酸应不低于50μg/ml。
3.4.4 2.4 成品
3.4.4.1 2.4.1 分批
应符合“生物制品分批规程”规定。
3.4.4.2 2.4.2 分装与灭菌
应符合“生物制品分装和冻干规程”及附录Ⅰ A 有关规定，封口后于121℃湿热灭菌20分钟。
3.4.4.3 2.4.3 规格
每安瓿1ml，含卡介菌多糖0.35mg、核酸不低于40μg。
3.4.4.4 2.4.4 包装
应符合“生物制品包装规程”及附录Ⅰ A 有关规定。
3.5 3 检定
3.5.1 3.1 精制多糖核酸检定
3.5.1.1 3.1.1 干燥失重
依法检查（2010年版药典三部附录Ⅶ L），失重应小于10%。
3.5.1.2 3.1.2 多糖含量测定
用生理氯化钠溶液将供试品稀释至0.05mg/ml，采用蒽酮法测定多糖，多糖含量应为70%～80%。
3.5.1.3 3.1.3 核酸含量测定
用生理氯化钠溶液将供试品稀释至0.05mg/ml，采用分光光度法（2010年版药典三部附录Ⅱ A），于258nm波长下测定核酸，核酸含量应为10%～20%。
3.5.1.4 3.1.4 蛋白质含量测定
用生理氯化钠溶液将供试品稀释至0.05mg/ml，采用Lowry法测定（2010年版药典三部附录Ⅵ B 第二法），蛋白质含量应小于0.5%。
3.5.1.5 3.1.5 乙醇和乙醚残留量测定
采用毛细管柱顶空进样系统程序升温气相色谱法测定（2010年版药典三部附录Ⅵ V），乙醚、乙醇残留量均应不高于0.5%。
采用固定液为二甲基聚硅氧烷毛细管柱（30m×0.53mm，涂膜厚0.88μm）；柱温50℃，维持2分钟，以适宜的升温速率升至200℃，维持1分钟；以氮气为载气；流速为每分钟3ml；进样口温度220℃；顶空瓶平衡温度80℃，平衡时间30分钟；采用火焰离子化检测器（ FID），温度为250℃。理论板数不低于5000，分离度不低于2.0；以内标法测定（采用0.2mg/ml丁酮溶液为内标溶液），相对标准偏差（RSD）应不大于5%。
3.5.1.6 3.1.6 微生物限度检查
依法检查（2010年版药典三部附录Ⅻ G），不得检出大肠杆菌和霉菌，杂菌检出应不高于100个菌/g。
3.5.2 3.2 成品检定
3.5.2.1 3.2.1 物理检查
3.2.1.1 外观应为无色澄明液体。
3.2.1.2 可见异物
依法检查（2010年版药典三部附录Ⅴ B），应符合规定。
3.2.1.3 装量
依法检查（2010年版药典三部附录Ⅰ A），应不低于标示量。
3.5.2.2 3.2.2 pH值
应为6.0～7.2（2010年版药典三部附录Ⅴ A）。
3.5.2.3 3.2.3 无菌检查
依法检查（2010年版药典三部附录Ⅻ A），应符合规定。
3.5.2.4 3.2.4 异常毒性检查
依法检查（2010年版药典三部附录Ⅻ F），应符合规定。
3.5.2.5 3.2.5 多糖含量测定
采用蒽酮法测定多糖，其含量应为0.28～0.42mg/ml。
3.5.2.6 3.2.6 核酸含量测定
采用分光光度法（2010年版药典三部附录Ⅱ A）于258nm波长下测定核酸，核酸含量应为配制量（μg/ml）±20%，并在40～100μg/ml限度范围之内。
3.5.2.7 3.2.7 热原检查
依法检查（2010年版药典三部附录Ⅻ D），应符合规定。按家兔体重每1kg注射0.5ml，含多糖应不少于0.1mg。
3.5.2.8 3.2.8 效力测定
用体重20～22g BALB/c小鼠，试验组和对照组各10只。每只腹腔注射经预标化的稀释猪血清0.5ml进行致敏，隔日1次，共三次。未次致敏后次日，试验组每只腹腔注射样品1ml，对照组每只腹腔注射生理氯化钠溶液1ml，隔日1次，共7次，末次注射后次日，每只小鼠静脉注射致敏浓度10倍量猪血清，对照组与试验组发病动物数及发病指数应有显著差异。
卡介菌多糖核酸效力测定发病指数记分标准如下。
0.5分：过度兴奋或活动减弱；
1分：匍匐不起，走路摇摆；
2分：瘫痪；
3分：痉挛跳跃或蛙跳、侧卧、呼吸深、在31～60分钟或更长时间后死亡；
4分：30分钟以内死亡。
过敏值在1分以上者为发病。
3.5.2.9 3.2.9 鉴别试验
采用多重PCR法检测制品中核酸产物，应无RD1序列存在，供试品PCR扩增产物应为196bP核酸片段，并与参考品一致。
采用ET1（5'-AAGCGGTTGCCGCCGACCGACC-3'）、ET2（5'-CTGGCTATATTCCTGGGCCCGG-3'）、ET3（5'-GAGGCGATCTGGCGGTTTGGGG-3'）三条引物，分别以灭菌超纯水稀释至终浓度为10μM。DNA分子量标记物为50bp DNA ladder。
取冻干BCG DNA参考品1支，加入灭菌超纯水200μl复溶，静置2～3分钟待用（参考品溶液复溶后可重新分装于容器中置-20℃冻存，每次使用1支，避免反复冻融）。
取供试品5μl，加至45μl反应试剂中[10倍PCR缓冲液（pH 8.3 100mmol/L Tris-HCl, 500mmol/L KCl,7.5mmol/LMgCl2）5μl、dNTP Mixture 2μl、5U/μl TaKaRa Taq 酶0.3μl、2μl引物ET1、4μl引物ET2、2μl引物ET3，灭菌超纯水29.7μl]，共50μl反应体系。取BCG DNA参考品溶液5μl作为对照，同法操作。每个样品重复2管。
反应体系于94℃预变性10分钟，然后94℃变性1分钟、64℃退火1分钟、72℃延伸30秒，循环30次后，72℃再延伸7分钟。取PCR产物10μl加6倍lodding buffer[配方为①吸取2ml EDTA （500mmol/L pH 8.0）加入约40ml双蒸水；②再称量250mg溴酚蓝；③量取50ml丙三醇；④定容至100ml，4℃保存]2μl混匀后上样于3%的琼脂糖凝胶泳道，50bp DNA ladder直接上样6μl。于100mA电泳50分钟。采用凝胶成像仪，以50bp DNA ladder为分子量标记，观察供试品与参考品PCR扩增片段分子量大小。供试品扩增片段应为196bp的核酸片段，与参考品DNA扩增条带长度一致，判为合格。
3.5.2.10 3.2.10 乙醇和乙醚残留含量测定
采用毛细管柱顶空进样系统程序升温气相色谱法测定（2010年版药典三部附录Ⅵ V），乙醇残留含量小于0.005%，乙醚残留含量小于0.0005%。
采用固定液为二甲基聚硅氧烷毛细管柱（30m×0.53mm，涂膜厚0.88μm）；柱温为50℃，维持2分钟，以适宜的升温速率升至200℃，维持1分钟；以氮气为载气；流速为每分钟3ml；进样口温度220℃；顶空瓶平衡温度80℃，平衡时间30分钟；采用火焰离子化检测器（FID），温度为250℃。理论板数不低于5000，分离度不低于2.0；以内标法测定（采用0.2mg/ml丁酮溶液为内标溶液），相对标准偏差（RSD）应不大于5%。
3.6 4 保存、运输及有效期
于25℃以下避光干燥处保存和运输。自生产之日起，有效期为24个月。5 使用说明应符合“生物制品包装规程”规定和批准的内容。
3.7 版本
《中华人民共和国药典》2010年版 第二增补本