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巨噬细胞移动抑制试验

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1 拼音

jù shì xì bāo yí dòng yì zhì shì yàn

2 英文参考

macrophage migration inhibition test

test for macrophage migration inhibition

3 概述

巨噬细胞移动抑制试验(MIT)是体外测定机体特异性细胞免疫反应的一种方法。MIT的原理是人体内致敏淋巴细胞受相应的抗原作用后,可释放出一种淋巴因子抑制巨噬细胞的正常移动,借助于指示系统的移动情况来了解T淋巴细胞功能

4 巨噬细胞移动抑制试验的别名

MIT

5 检查名称

巨噬细胞移动抑制试验

6 分类

免疫学检查 > 细胞免疫测定

7 化验取材

血液

8 巨噬细胞移动抑制试验的原理

移动抑制试验(migration inhibition test)是指致敏淋巴细胞当再次接触相应抗原时,可产生移动抑制因子(MIF),后者能够抑制巨噬细胞的移动。参与此试验的有三种成分:①被检测的淋巴细胞。②特异性抗原。③指示细胞,如豚鼠腹腔巨噬细胞,人外周血白细胞等。按选用的指示细胞不同本试验又分为巨噬细胞移动抑制试验和白细胞移动抑制试验

9 试剂

(1)聚蔗糖-泛影葡胺分层液。

(2)Hank液。

(3)PPDSK-SD。

10 操作方法

(1)分离淋巴细胞:取人肝素凝血10ml,用聚蔗糖-泛影葡胺分层液用密度梯度离心法分离淋巴细胞,用Hank液配成5×106/ml细胞悬液,再用2.5g/L伊红溶液观察细胞活率。要求细胞活率>95%。所得白细胞中如果含有红细胞可用红细胞溶解液或低渗处理加以去除,其中的B细胞可用过尼龙柱的方法除去。

(2)MIF的提取:直接法不需提取MIF。使用间接法时首先应将相应抗原与待测淋巴细胞悬液共同温育,使其产生MIF,然后再提取配养液中的MIF加以浓缩,具体方法如下:

①将分离的淋巴细胞用不含小牛血清和双抗的Hank液配成3×106/ml细胞悬液。

②在待测细胞悬液中加入相应抗原,其剂量随各种抗原性质而定。一般PPD的剂量为100μg/ml溶液,SK-SD50μg/ml。大部分蛋白性抗原用100μg/ml浓度,肿瘤细胞或其提取物的用量在1mg/ml左右。

③将上述混合液置37℃ 5%CO2条件下孵育3天。每天将培养管(800r/min)离心10min,吸去上清后补加无血清培养液至原溶液量,将3天所得上清液混合后置4℃保存

④将混合上清液先经0.15mol/L NaCl 4℃透析过夜,再用蒸馏水透析,换液3次,共计36h。最后冷冻干燥,保存于-20℃,临用时加蒸馏水恢复至原液量的1/5体积,调节pH至7.4。

(3)收集巨噬细胞:可从豚鼠、小白鼠、大鼠和兔等的淋巴结、肺、肝、脾、外周血、腹腔液中分离巨噬细胞。

①在试验开始前12h先用心脏抽血或双侧颈动脉放血处死豚鼠,以免腹腔液中混有红细胞影响结果观察。豚鼠去毛用碘酒和酒精消毒皮肤后,在无菌条件下收集腹腔渗出细胞。

②将收集到的腹腔液离心(1500~2000r/min)15min,去上清后洗涤细胞3次,计数后配成约7×106/ml的细胞悬液备用。

(4)移动抑制试验

①细胞悬液的制备:在直接法时,将已制备好的巨噬细胞悬液和待测淋巴细胞悬液以4∶1比例混合;间接法时只用巨噬细胞悬液。

②用毛细管灌注细胞 取内径为0.8~1.0mm,长约70mm毛细管将其一端用火焰烧融法封闭,然后用1ml注射器和5号针头将充分混匀的细胞液灌注到毛细管内,勿使其发生气泡。

③将注满细胞液的毛细管置于底部填有少许棉絮的离心管内,水平位离心500r/min,5min,使巨噬细胞和白细胞沉入毛细管底部(约2~5mm高),要求各管压积高度基本一致。用锯刀在细胞层和液体层交界面锯断毛细管,切面要求平整。用小镊子将有压积细胞的毛细管黏在凹孔玻璃板的小孔底部(小孔内径为17mm,深度为5mm),每孔可放2只毛细管。

④直接法时小孔中加入含有抗原的培养液。间接法时加入经浓缩的淋巴细胞培养上清。勿使产生气泡。直接法的对照小室中只加培养液,不加抗原。间接法则用未加抗原培养的淋巴细胞上清液做对照。

⑤将玻璃管培养于37℃ 5% CO2条件下24h,然后用低倍显微镜和显微扫描仪测量毛细管外细胞游走面积,试验结果用移动指数(MI)表示。

一般每组试验作4支毛细管,求出平均移动面积进行比较,同一组中每只毛细管的移动面积相差应在10%~20%之内,否则可能是技术上的误差

11 正常值

100%左右。

12 化验结果临床意义

(1)降低:机体对抗原有特异性作用。

(2)升高:抗原对巨噬细胞有刺激作用或机体有另一种特异性免疫反应存在。

13 附注

(1)为防止污染影响结果,所有器材均要求无菌,操作过程要求在无菌条件下进行。

(2)毛细管内径要求一致。

(3)在毛细管中灌注细胞时,细胞液要充分混匀,以免因各管浓度差异影响结果。

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开放分类:化验及医学检查免疫学检查细胞免疫测定
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参与讨论
  • 评论总管
    2019/9/23 9:28:10 | #0
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本页最后修订于 2013年2月27日 星期三 23:28:36 (GMT+08:00)
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