1 拼音
huà zhuāng pǐn zhōng fū nán xiāng dòu sù lèi （sān jiǎ shā lín 、8-jiǎ yǎng jī bǔ gǔ zhī sù 、5-jiǎ yǎng jī bǔ gǔ zhī sù ）hé ōu qián hú nèi zhǐ de jiǎn cè fāng fǎ
《化妆品中呋喃香豆素类（三甲沙林、8-甲氧基补骨脂素、5-甲氧基补骨脂素）和欧前胡内酯的检测方法》由国家食品药品监督管理局于2012年1月18日国食药监保化[2012]13号发布。
化妆品中呋喃香豆素类（三甲沙林、8-甲氧基补骨脂素、5-甲氧基补骨脂素）和欧前胡内酯的检测方法
2 1 适用范围
本方法规定了用高效液相色谱法测定化妆品中呋喃香豆素类（三甲沙林、8-甲氧基补骨脂素、5-甲氧基补骨脂素）和欧前胡内酯的方法。
本方法适用于化妆品中呋喃香豆素类（三甲沙林、8-甲氧基补骨脂素、5-甲氧基补骨脂素）和欧前胡内酯含量的测定。
3 2 方法提要
样品在经过提取后，用高效液相色谱仪分离，二极管阵列检测器检测，经与平行操作的三甲沙林、8-甲氧基补骨脂素、5-甲氧基补骨脂素和欧前胡内酯对照品比较，以保留时间和紫外光谱图定性，峰面积定量，以标准曲线法计算含量。必要时，采用液相色谱-质谱方法（LC-MS/MS）进行确证。本方法对三甲沙林、8-甲氧基补骨脂素、5-甲氧基补骨脂素和欧前胡内酯的检出限、定量限和取样品0.5 g时的检出浓度、定量浓度见表1。
表1 4种香豆素类成分的检出限和检出浓度
化合物 | 检出限 （ng） | 定量限 （ng） | 检出浓度 （μg/g） | 定量浓度 （μg/g） |
三甲沙林 | 0.13 | 0.25 | 0.26 | 0.50 |
8-甲氧基补骨脂素 | 0.13 | 0.27 | 0.26 | 0.54 |
5-甲氧基补骨脂素 | 0.05 | 0.26 | 0.10 | 0.52 |
欧前胡内酯 | 0.15 | 0.29 | 0.30 | 0.58 |
4 3试剂和材料
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为实验室用一级水。
3.1 甲醇，色谱纯。
3.2 三甲沙林，纯度≥99%。
3.3 8-甲氧基补骨脂素，纯度≥98%。
3.4 5-甲氧基补骨脂素，纯度≥99%。
3.5 欧前胡内酯，纯度≥99%。
3.6 混合标准储备溶液 [ （待测成分）=10 μg/mL]：分别称取三甲沙林（3.2）、8-甲氧基补骨脂素（3.3）、5-甲氧基补骨脂素（3.4）和欧前胡内酯（3.5）对照品各5 mg（精确到0.1 mg），置5 mL量瓶中，用甲醇（3.1）溶解并稀释至刻度，摇匀，配置成质量浓度各为1 mg/mL的标准溶液。精密量取各标准溶液0.5 mL置50 mL量瓶中，加甲醇（3.1）稀释至刻度，摇匀，即得10 μg/ mL的混合标准储备溶液。
3.7 系列浓度标准溶液：精密量取一定体积的混合标准储备溶液（3.6），置10 mL量瓶中，加甲醇（3.1）稀释至刻度，配制得各待测成分的质量浓度分别为0.05 μg/ mL、0.1 μg/ mL、0.5 μg/ mL、1.0 μg/ mL、5.0 μg/ mL、10.0 μg/ mL的系列浓度标准溶液。
5 4 仪器
4.1 高效液相色谱仪：具二极管阵列检测器。
4.2 液相色谱-三重串联四级杆质谱联用仪。
4.3 分析天平：感量为0.1 mg。
4.4 移液器。
4.5 涡旋振荡器。
4.6 超声波清洗仪（功率不低于200W）。
4.7 高速离心机：转速不小于10000 r/min。
6 5 测定步骤
5.1 样品预处理
膏、霜、乳类：称取0.5 g（精确至0.1 mg）样品，置10 mL量瓶中，加6 mL甲醇（3.1），涡旋振荡使试样与提取溶剂充分混匀，超声提取20 min，放至室温，加甲醇（3.1）稀释至刻度，摇匀，转移至10 mL具塞塑料离心管中，以12000 r/min离心5 min，上清液经0.45 μm滤膜过滤，滤液作为待测溶液备用。
液体类：称取0.5 g（精确至0.1 mg）样品，置10 mL量瓶中，加甲醇（3.1）稀释至刻度，混匀，必要时，转移至10 mL具塞塑料离心管中，以12000 r/min离心5 min，上清液经0.45 μm滤膜过滤，滤液作为待测溶液备用。
固体粉类：称取0.5 g（精确至0.1 mg）样品，置10 mL量瓶中，加8 mL甲醇（3.1），混匀，超声提取20 min，放至室温，加甲醇（3.1）稀释至刻度，摇匀，静置，必要时，转移至10 mL具塞塑料离心管中，以12000 r/min离心5 min，上清液经0.45 μm滤膜过滤，滤液作为待测溶液备用。
若样品中被测成分的浓度超过了线性范围的上限，需对待测溶液进行适当稀释处理。
5.2 高效液相色谱参考条件
色谱柱：C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂）或具有同等柱效的色谱柱。
流动相：甲醇＋水，梯度洗脱，洗脱程序见表2。
表2 流动相甲醇和水梯度洗脱程序（体积比）
时间/min | 0 | 15 | 16 | 19 | 20 |
甲醇＋水 | 70＋30 | 90＋10 | 100＋0 | 100＋0 | 70＋30 |
注：梯度洗脱条件，操作者可根据样品的不同选择最佳条件，使待测成分与其他组分峰获得完全分离。
流速：1.0 mL/min。
检测波长：248 nm。
柱温：30℃。
进样量：10 μL。
5.3 样品测定
按设定的色谱条件（5.2），取系列浓度标准溶液（3.7）分别进样，进行高效液相色谱分析，以系列浓度标准溶液质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，建立标准曲线，得到回归方程。取待测溶液（5.1）进样10 μL分析，色谱图检出的成分，经与该成分的保留时间和紫外光谱图比较确证后，根据待测成分的峰面积，代入回归方程计算待测成分的浓度。按“6”项下计算公式计算化妆品样品中呋喃香豆素类成分的质量分数。
5.4 平行试验
按以上步骤操作，对同一样品独立进行测定，获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算数平均值的10%。
5.5 阳性结果确证
测定过程中若有阳性结果，可采用液相色谱-质谱法进一步确证。
在相同的实验条件下，如果样品中检出的色谱峰的保留时间和紫外光谱图与标准溶液中对应成分一致，所选择的监测离子对的相对丰度比与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比的偏差不超过表3规定范围，则可以判定样品中存在对应的待测成分。
表3 阳性结果确证时相对离子丰度比的最大允许偏差
相对离子丰度（k） | k≥50% | 50%＞k≥20% | 20%＞k≥10% | k≤10% |
最大允许偏差 | ±20% | ±25% | ±30% | ±50% |
液相色谱-质谱（LC/MS）参考条件：
色谱参考条件：
同前。
质谱参考条件：
离子源：电喷雾离子源（ESI源）。
监测模式：正离子监测模式。
离子源电压（IS）：4500V。
碰撞气（CAD）、气帘气（CUR）、雾化气（GS1）、辅助气2（GS2）均为高纯氮气，使用前调节各气流流量以使质谱灵敏度达到检测要求。4种呋喃香豆素类成分的定性离子对和去簇电压（DP）、碰撞能量（CE）等电压值的设定参考值见表4。在以上色谱、质谱条件下，待测成分的定性离子及丰度比见表5。
表4 4种呋喃香豆素类成分的定性离子对及相关电压参数
编号 | 物质名称 | 母离子（m/z） | DP（V） | 子离子（m/z） | CE（V） |
1 | 8-甲氧基补骨脂素 | 217 | 40 | 202，174 | 30 |
2 | 5-甲氧基补骨脂素 | 217 | 40 | 202，174 | 30 |
3 | 欧前胡内酯 | 271 | 30 | 203，69 | 10 |
4 | 三甲沙林 | 229 | 40 | 173，142 | 30 |
表5 待测成分的定性离子及丰度比
编号 | 待测成分 | 分子式 | 定性离子及丰度比 |
1 | 8-甲氧基补骨脂素 | C12H8O4 | 217（47），202（100），174（75） |
2 | 5-甲氧基补骨脂素 | C12H8O4 | 217（29），202（100），174（31） |
3 | 欧前胡内酯 | C16H14O4 | 271（45），203（100），69（7） |
4 | 三甲沙林 | C14H12O3 | 229（100），173（47），142（57） |
7 6 计算
w（被测成分）=ρV/m
式中：
w（被测成分） —— 样品中被测成分的质量分数，μg/g；
—— 从标准曲线中得出的待测溶液中被测成分的质量浓度，μg/mL；
V —— 样品定容体积，mL；
m—— 样品取样量，g。
8 7 回收率和精密度
两个浓度水平中，低浓度的平均提取回收率和平均方法回收率在80%～120%之间，并且RSD小于10%（n=6）；高浓度的平均提取回收率和平均方法回收率在85%～115%之间，并且RSD小于5%（n=6）。
9 8 色谱图
4种被测成分混合标准溶液（10μg/ mL）HPLC色谱图
色谱峰：1. 8-甲氧基补骨脂素，2. 5-甲氧基补骨脂素，3. 三甲沙林，4. 欧前胡内酯。