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发光免疫技术

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1 拼音

fā guāng miǎn yì jì shù

发光免疫技术是将发光系统免疫反应相结合,以检测抗原抗体方法。其既具有免疫反应的特异性,更兼有发光反应的高敏感性,在免疫学检验中应用日趋广泛。

2 发光的基本知识

一种物质由电子激发态回复到基态时,释放出的能量表现为光的发射,称为发光(luminescence)。发光可分为三种类型:光照发光、生物发光和化学发光。

1.光照发光(photoluminescence)发光剂经短波长入射光照射后进入激发态,当回复至基态时发出较长波长的可见光(见第十七章)。

2.生物发光(bioluminescence)典型例子为萤火虫发光。反应底物为萤火虫光素(fireflyluciferin),在荧光素酶(luciferase)的催化下利ATP产能,生成激发态的氧化荧光素(oxyluciferin),后者在回复到基态时多余的能量以光子形式放出。反应式如下:

3.化学发光(chemiluminescence)在常温下由化学反应产生的光的发射。化学发光是一个多步骤的过程,其机制为某些化合物(发光剂或发光底物)可以利用一个化学反应产生的能量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子激态。当此产物分子或中间态分子衰退至基态时,以发射光子的形式释放能量(即发光)。

3 化学发光底物

在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物称为化学发光剂或发光底物。在发光免疫技术中常用的化学发光底物有以下几类。

1.氨基苯二酰肼类主要是鲁米诺及异鲁米诺衍生物,是最常用的一类化学发光剂。鲁米诺(luminol,5'-氨基-2,3-二氢-1,4-酞嗪二酮)的分子结构及化学反应式如下:

鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物,也可用作过氧化物酶的底物。异鲁米诺衍生物ASEI和ABMI等也是常用的标记物。

2.吖啶酯(acridiniumester,AE)类这类发光剂不需催化剂的存在,在有过氧化氢的稀碱溶液中即能发光。反应式如下:

图18-1 电化学发光原理

上式反应迅速,在1~5s内即可完成;具有背景低、信比高的优点,其检测极限可达5×10-9mol,发光量与AE浓度呈良好的线性反应,是一类的标记物。

3.电化学发光(electrochemiluminescence,ECL)反应在电极表面进行。发光底物为三联吡啶钌[Ru(bpy)32+],另一反应物为三丙胺(TPA)。在阳电极表面,以上两化学物质可同时失去电子发生氧化反应(图18-1)。二价的Ru(bpy)32+被氧化成三价Ru(bpy)33+,TPA被氧化成阳离子自由基TPA+,后者失去一个质子(H+),成为自由基TPA,这是一个强还原剂,可将一个电子递给三价的Ru(bpy)32+*,而TPA自身被氧化成TPA氧化产物。激发态的Ru(bpy)32+*在衰减时发射一个波长为620nm的光子,重新生成基态的Ru(bpy)32+。这一过程在电极表面周而复始地进行,产生许多光子,使信号得以增强。化学发光免疫测定

化学发光反应参与的免疫测定分为二种类型。第一种是以发光剂作为酶免疫测定的底物,通过发光反应增强测定的敏感性;第二种是以发光剂作为抗体或抗原的标记物,直接通过发光反应检测标本中抗原或抗体的含量。

4 化学发光酶免疫测定

从标记免疫测定来看,化学发光酶免疫测定(chemiluminescentenzymeimmunoasssay,CLEIA)应属酶免疫测定。测定中2次抗原抗体反应步骤均与酶免疫测定相同,仅最后一步酶反应所用底物为发光剂,通过化学发光反应发出的光在特定的仪器上进行测定。两种常用的标记酶,辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶AP)均有其发光底物,由此建立的CLEIA均在临床检验中应用。

4.1 HRP标记的CLEIA

常用的底物为鲁米诺或其衍生物。鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行,通常以0.1mol/LpH8.6Tris缓冲液作底物液,鲁米诺和H2O2在无HRP催化时也能缓慢自发发光,而在最后光强度测定中造成空白干扰,因而宜分别配制成2瓶试剂溶液,只在用前即刻混合。

HRP催化鲁米诺氧化的反应可被某些酚试剂(如邻-碘酚)或萤火虫荧光素酶等加强。加强剂的作用是增强发光和延长发光时间,由此可提高敏感度。

4.2 AP标记的CLEIA

在以AP为标记酶的CLEIA中,应用的底物为adamantyldioxetasephosphate,有不少衍生物的商品试剂如PPD可供应用。发光反应的反应式如下:

5 化学发光标记免疫测定

化学发光标记免疫测定亦称化学发光免疫测定(chemiluminescentimmunoassay,CLIA),是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的一类免疫测定方法。用作标记的化学发光剂应符合以下几个条件:①能参与化学发光反应;②与抗原或抗体偶联后能形成稳定的结合物试剂;③偶联后仍保留高的量子效应和反应动力;④应不改变或极少改变被标记物的理化特性,特别是免疫活性。鲁米诺类和吖啶酯类发光剂等均是常用的标记发光剂。

鲁米诺类的发光反应须有催化剂(例如过氧化物酶)催化,且与蛋白质或肽结合后其发光作用减弱,因此鲁米诺类在CLEIA中是很好的底物,但已较少用于CLIA的标记。吖啶酯类对CLIA更为适用,其显著的优点是:①氧化反应不需催化剂,只要碱性环境中就可以进行。反应物在加入H2O2后再加氢化钠溶液,发光反应迅速,本底低。②在氧化反应过程中,结合物被分解,因此游离的吖啶酯的发光不受抑制。试剂稳定性好。

6 电化学发光免疫测定

在电化学发光免疫测定(electrochemluminescenceimmunoassay,ECLI)中应用的标记物为电化学发光反应的底物三联吡啶钌,其衍生物N-羟基琥珀酰胺(NHS)酯可通过化学反应与抗体或不同化学结构的抗原分子结合,制成标记的抗体或抗原。ECLI的测定模式与ELISA相似,分二个步骤进行。以双抗体夹心法测定抗原为例,第一步在试管中进行,反应物为Ru(bpy)32+标记的抗体、吸附在磁性微球上的固相抗体以及受检的标本,反应式如图18-2。

图18-2 ECLI中的抗原抗体反应

反应后除由标记抗体、固相抗体与标本中的抗原形成的夹心复合物外,尚有多余的标记抗体和固相抗体。第二步是将反应液输入特殊的检测仪器的反应室中(图18-3),随即用含三丙胺(TPA)的缓冲液冲洗。反应室电极下有磁铁。含磁性微球的夹心复合物及游离的固相抗体被吸附在电极表面,游离的标记抗体随冲洗液流出。此时在反应室中即发生如图18-1的电化学发光反应。发出的光由光电倍增管转为信号,通过电信号的测定反映标本中抗原的含量。

图18-3 ECLI中的ECL反应

ECLI具有以下优点:①标记物在再循环利用,使发光时间更长、强度更高、易于测定;②敏感度高,可达pg/ml或pmol水平;③线性范围宽,>104;④反应时间短,20min以内可完成测定;⑤试剂稳定性好,2~5℃可保持一年以上。

7 发光免疫技术在医学检验中的应用

放射免疫分析因标记物的放射性在应用中存在不少问题。为替代这一广被采用的测定方法,近年来创立了多种新的标记免疫技术。化学发光免疫测定具有明显的优越性:①敏感度高,甚至超过RIA;②精密度和准确性均可与RIA相比;③试剂稳定,无毒害;④测定耗时短;⑤测定项目多;⑥已发展成自动化测定系统。因此化学发光免疫测定在医学检验中不仅能取代RIA,而且可得到更为广泛的应用。

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开放分类:手术
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  • 评论总管
    2020/12/6 6:24:05 | #0
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本页最后修订于 2012年3月12日 星期一 11:08:30 (GMT+08:00)
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