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杜克雷嗜血杆菌

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1 拼音

dù kè léi shì xuè gǎn jūn

2 英文参考

haemophilus ducreyi[WS/T 191—2017 软下疳诊断]

3 概述

杜克雷嗜血杆菌(haemophilus ducreyi)为兼性厌氧菌,由Ducrey 1889年在意大利发现。杜克雷嗜血杆菌无运动能力,无芽胞,革兰染色阴性,短杆状,两端钝圆,长1.6μm~2μm,宽0.5μm,大多数在细胞外呈链状或鱼群状排列,少数在细胞内呈团状分布[1]

4 杜克雷嗜血杆菌的实验室检查方法

4.1 标本采集

4.1.1 取材工具

棉拭子或藻酸钙拭子。

4.1.2 取材部位

生殖溃疡或有波动感的肿大淋巴结

4.1.3 皮肤黏膜损害取材

无菌棉拭子轻轻擦去溃疡表面的痂皮和污物,再用拭子采取分泌物,从溃疡基底部或边缘取材,做涂片检查或培养。

4.1.4 淋巴结取材

选有波动的淋巴结,消毒淋巴结表面皮肤,用无菌干棉球擦干。用ImL无菌注射器配12号针头,吸取生理盐水0.25 mL~0.5 mL,以无菌操作穿刺淋巴结并注入盐水,再吸入注射器内,反复2次~3次后,取抽吸液做涂片检查或培养。

4.2 显微镜检查

4.2.1 材料

光学显微镜、无菌拭子、载玻片、注射器、生理盐水。

4.2.2 方法

将标本均匀轻轻地涂在干净的玻片上,然后在空气中干燥火焰固定。

4.2.3 革兰染色

操作步骤如下:

a) 将经过固定的涂片铺满结晶紫溶液,染30 s~60 s,迅速在流水中洗净。

b) 用碘液铺满涂片,染30 s~60 s,用流水洗净。

c) 用丙酮乙醇液脱色,直到涂片无紫色脱下为止。通常要10 s~20 s,取决于涂膜的厚薄。避免脱色过分,否则革兰阳性菌可误认为阴性菌。很快在流水中淋洗停止脱色,将过量的水用吸水纸吸干。

d) 用复红液复染1 min,用流水淋洗,用吸水纸吸干。

4.2.4 结果及解释

使用10×100倍油镜检查。

杜克雷嗜血杆菌为革兰染色阴性,短杆状,两端钝圆,长1.6 μm~2μm,宽0.5μm,大多数在细胞外呈链状或鱼群状排列,少数在细胞内呈团状分布。

因生殖器溃疡中常有多种微生物寄居,临床标本直接涂片革兰染色镜检的结果不可靠,假阳性假阴性较高,故涂片检查只用于初步判断,不作为确诊依据。

4.3 杜克雷嗜血杆菌运送与分离培养

4.3.1 材料

4.3.1.1 运送培养基

BM-SGA运送培养基。主要成分包括:L-谷氨酰胺、小牛白蛋白V、3 mg/L万古霉素

4.3.1.2 分离培养基

1.改良Thayer-Martin培养基。主要成分包括:GC基础培养基粉、血红蛋白、1%IsoVitaleX增菌剂、3 mg/L万古霉素。

2.巧克力琼脂培养基。主要成分包括:肉浸液(肉膏液)琼脂、无菌脱纤维血、3 mg/L万古霉素(培养基制备参见附录B)。

4.3.2 培养条件

将标本接种于培养基上,分区划线分离。接种了标本的培养基应置于相对湿度80%以上,培养温度33℃~35℃,5%~10%-氧化碳环境(烛缸)中培养。48 h~72 h观看结果。未出现阳性结果的平皿应继续观察7d后才能丢弃。

4.3.3 培养菌落初步鉴定

菌落特征:杜克雷嗜血杆菌经48 h~72 h培养后,可形成直径1 mm~2 mm菌落,菌落光滑、呈半透明状,浅灰色或黄灰色。陈1日性培养物,菌落扁平,颜色变成灰白到棕黄。用白金耳可以完整地将菌落沿琼脂表面推动,即推动试验阳性,为杜克雷嗜血杆菌菌落的典型特征。

革兰染色:从菌落取材做涂片,革兰染色镜检(见A.2)。

4.4 生化鉴定试验

4.4.1 氧化酶试验

原理:杜克雷嗜血杆菌酶系统不完善,但能产生弱氧化酶,它产生的氧离子能将氧化酶试剂(盐酸二甲基对苯胺)氧化成醌类化合物,出现弱颜色反应。但也有报告氧化酶试验阴性的菌株。

方法:将氧化酶试剂配制成0.5%~1.0%水溶液。将溶液滴加可疑菌落上,观察颜色变化。 A.

结果:在滴加1%盐酸二甲基对苯胺溶液后,一般于15 s~20 s内菌落即呈淡红色,然后逐步变成深紫蓝色,最后呈黑色。

临床意义:氧化酶试验、菌体形态和菌落形态是初步鉴定杜克雷嗜血杆菌的三个重要标准。

4.4.2 过氧化氢酶试验

原理:具有触酶(即过氧化氢酶)的细菌可催化过氧化氢放出初生态氧,继而形成氧分子出现气泡。

方法(玻片法):挑取培养基上的菌落,置于干净的玻片上,然后加1滴3%~6%过氧化氢,立即观察结果。

结果:于30 s内有气泡产生者为阳性。

临床意义:杜克雷嗜血杆菌不产生气泡因而为阴性。

4.4.3 卟啉试验

原理:用于检测细菌将盐酸δ-氨基-γ-酮戊酸转变成卟啉及卟吩胆色素原的能力。因为杜克雷嗜血杆菌是严格依赖氯化血红素生长的一种嗜血杆菌,它没有将盐酸δ-氨基-γ-酮戊酸转变成卟啉的能力,试验结果为阴性反应。

方法:在12 mm×75 mm的试管中加入0.5 mL的2 mmol/L盐酸-δ-氨基乙酰丙酸溶液中制备浓菌悬液(1×109/mL),将试管放在35℃~37℃孵箱中4h。再将试管于暗室中用wood灯照射,观察结果。

结果:出现红色荧光则表示有卟啉存在为阳性。

临床意义:严格依赖氯化血红素的杜克雷嗜血杆菌缺乏转变成卟啉能力,因而呈阴性。

4.4.4 硝酸盐还原试验

原理:硝酸盐还原反应包括两个方面:

1) 细菌在合成代谢过程中,将硝酸盐还原为亚硝酸盐和氮,再由氨转化成氨基酸和细菌内其他    含氮化合物。

2) 在分解代谢过程中,硝酸盐或亚硝酸盐替代氧作为呼吸系统中的终末受氢体。硝酸盐的还原    过程因细菌而异,杜克雷嗜血杆菌能还原培养基中的硝酸盐为亚硝酸盐,亚硝酸盐与试剂中的醋酸作用,生成亚硝酸,亚硝酸与试剂中的氨基苯磺酸作用生成重氮苯磺酸,再与试剂中的α-萘胺结合而成为N-α-萘胺偶氮苯磺酸(红色)。

方法:取48 h的培养物制成浓菌悬液(109/mL),取0.04 mL于小试管中,加入0.04 mL 0.05% NaNO3溶液和0.04 mL的25 mmol/L磷酸缓冲液(pH 6.8)。在35℃水浴孵育1 h。分别加入0.5%对氨基苯磺酸乙酸溶液和0.5%萘胺乙酸溶液各0.06 mL,摇匀,观察。

结果:2 min~10 min内显色,出现粉红色为阳性,不出现粉红色为阴性。

临床意义:杜克雷嗜血杆菌硝酸盐还原试验阳性。

4.4.5 碱性磷酸酶试验

方法:在含0.5 mL 0.03%无酚磷酸二钠试管中制备浓菌悬液(109/mL)。将试管置37℃水浴孵育4h,加4滴0.5%2,6-二溴醌-4-氯亚胺甲醇溶液,摇匀,置室温15 min。加入0.3 mL n-丁醇,摇匀静置5 min。观察。

结果:在丁醇层出现蓝紫色为阳性。

临床意义:杜克雷嗜血杆菌碱性磷酸酶试验阳性。

4.4.6 杜克雷嗜血杆菌生化试验鉴定结果

嗜血杆菌氧化酶试验阳性,过氧化氢酶试验阴性,卟啉试验阴性,硝酸盐还原试验阳性,碱性磷酸酶试验阳性。

4.4.7 培养意义及注意事项

杜克雷嗜血杆菌培养法的敏感性为60%~80%,是目前世界卫生组织推荐和诊断软下疳病人的主要实验室方法。杜克雷嗜血杆菌对环境的抵抗力很弱,为提高培养的成功率,标本的离体时间越短越好,取材后应立即接种于分离培养基。对不能及时接种到分离培养基的临床标本,应置于运送培养基,但必须在一周内转种到分离培养基上。

4.5 运送和分离杜克雷嗜血杆菌培养基的制备

4.5.1 运送培养基BM-SGA制备

4.5.1.1 BM成分

BM成分如下:

a) 磷酸氢二钠Na2HPO4)  10.0 g;

b) 硝酸镁(magnesium nitrate) 0.1 g;

c) 磷酸二氢钾(KH2PO4)2.0 g;

d) 氯化钠(sodium chloride) 5.0 g;

e) 氯化钙(Calcium Chloride) 0.1 g;

f) 血红素0.2 g;

g) 巯基乙酸钠(sodium thiglycollate) 1.0 g;

h) Bacto琼脂7.5 g;

i) 蒸馏水990 mL;

j) 调pH至7.5。

4.5.1.2 SGA成分

SGA成分如下:

a) 二氧化硒(SeO2) 0.003 mg/L;

b)L-谷氨酰胺(L-glutamine)3 mg/L;

c) 万古霉素(vancomycin)3 mg/L;

d) 牛血清蛋白(白蛋白)2.0 g/L;

e) 蒸馏水10 mL。

4.5.1.3 配制方法

SGA成分采用孔径为0.45μm滤膜过滤除菌备用。BM成分于121℃灭菌15 min,待冷至50℃,无菌操作加入SGA溶液混匀,分装于带螺旋盖的无菌试管内,每管6 mL,放4℃可用30 d。

4.5.2 分离培养基制备

4.5.2.1 改良Thayer-Martin培养基制备
4.5.2.1.1 成分

GC基础培养基粉

每3.6 g GC基础培养基粉可配100 mL T-M成品培养基,其中含蛋白胨1.5 g、玉米粉0.1 g、磷酸氢二钾(K2HPO4)0.4 g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.1 g、氯化钠(NaCl)0.5 g和琼脂1.2 g。

VCN抑菌剂

1 mL溶液中含万古霉素(vancomycin) 300μg、粘菌素(colistin) 750μg和制霉菌素(nystatin)1250单位。为抑制变形杆菌可加三甲氧苄氨嘧啶500μg。制成后立即用完或贮存-200C以下于2周内用完。

lsoVitaleX增菌剂

每1L蒸馏水中加入成分如下:

a) 维生素B12 (vitamin B12) 0.01 g;

b) L-谷氨酰胺(L-glutamine)  10.0 g;

c) P-氨基苯甲酸(P-aminobenzoic acid) 0.012 g;

d) 腺嘌呤(adenine)1.0 g;

e) 鸟嘌呤(guanine)0.03 g;

f) 二磷酸吡啶核苷酸(diphosphopyridine nucleotide osidized,coenzyme Ⅰ)0.25 g;

g) 辅羧酶(cocarboxylase)0.1 g;

h) 硝酸铁(ferric nitrate)0.02 g;

i) 盐酸硫胺(thiamine HCl) 0.003 g;

j) L-半胱氨酸(L-cysteine) 25.9 g;

k) L-胱氨酸(L-cystine)1.1 g;

1) 葡萄糖(dextrose) 100 g。

4.5.2.1.2 配制

以配500 mL T-M培养基为例,具体配制如下:

a) 制取双倍浓度的基础培养基:将GC基础粉18 g溶于235 mL蒸馏水中(用500 mL烧瓶),充分摇匀,边加热边搅动,直至煮沸1 min,使之完全溶解

b) 将5g血红蛋白粉加到250 mL水中制成2%溶液。混合时,5g血红蛋白先加水5 mL~10 mL,研成糊状,再逐步加入蒸馏水,使整个溶液成匀浆状。也可用2%血红蛋白溶液成品。

c) 将上述二液分别以121℃高压灭菌15 min后冷却到500C左右备用。2%血红蛋白溶液成品不必高压,只需在临用前稍加热即可。

d) 配制增菌液:每安瓿增菌剂加入随同附来的稀释液10 mL,使溶解。

e) 配制抑菌剂:每安瓿抑菌剂用无菌操作加入蒸馏水5 mL,摇动,使充分溶解。

f) 用无菌操作将2%血红蛋白溶液250 mL、增菌液10 mL、抑菌剂5 mL和GC培养基235 mL混合。

总体积为500 mL,可倒70 mm平皿25个~30个。

4.5.2.2 巧克力琼脂的配制
4.5.2.2.1 成分

肉浸液(或肉膏液)琼脂(pH 7.2~7.4)1000 mL,无菌脱纤维血(羊血兔血)80 mL~100 mL,万古霉素3 mg/L(或多粘菌素B 25 U/mL)。

4.5.2.2.2 配制

将肉浸液琼脂高压灭菌,待凉至45℃时加入脱纤维血(血液在临用前置于370C水浴预热),摇匀后再置于水浴中,徐徐加热到85℃~90℃作用5 min~10 min,再冷却到50℃左右。为抑制杂菌,在冷却到45℃左右时加入万古霉素3 mg/L(或多粘菌素B 25 U/mL),再轻轻摇匀后倾注于灭菌平皿中。

5 参考资料

  1. ^ [1] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.WS/T 191—2017 软下疳诊断[Z].2017-7-24.

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开放分类:病原微生物
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  • 评论总管
    2019/11/16 9:23:33 | #0
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本页最后修订于 2018年1月9日 星期二 12:50:20 (GMT+08:00)
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