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PCR实验技术

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1 拼音

PCR shí yàn jì shù

2 PCR引物设计

2.1 PCR引物设计的原则

PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列。因此,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。

要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构,就要避开它。如这一段不能形成二级结构,那就可以在这一区域设计引物。

现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基,扩增片段长度为100~600碱基对。

让我们先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布最好随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则P1引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。

同时引物之间也不能有互补性,一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。

引物确定以后,可以对引物进行必要的修饰,例如可以在引物的5′端加酶切位点序列;标记生物素荧光素地高辛等,这对扩增的特异性影响不大。但3′端绝对不能进行任何修饰,因为引物的延伸是从3′端开始的。这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位,因为密码子第3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率。

综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则:

① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

② 产物不能形成二级结构。

③ 引物长度一般在15~30碱基之间。

④ G+C含量在40%~60%之间。

⑤ 碱基要随机分布。

⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。

⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。

⑧ 引物5′端可以修饰。

⑨ 引物3′端不可修饰。

⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位。

PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功,但遵循某些原则,则有助于引物的设计。

1.引物的特异性

引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。

2.避开产物的二级结构区

某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响,选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA稳定二级结构,有助于选择模板。实验表明,待扩区域自由能(△G°)小于58.6lkJ/mol时,扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时,用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

3.长度

寡核苷酸引物长度为15~30bp,一般为20~27mer。引物的有效长度:Ln=2(G+C)+(A+T+,Ln值不能大于38,因为>38时,最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度(74℃),不能保证产物的特异性。

4.G+C含量

G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度,有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

5.碱基础随机分布

引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。

6.引物自身

引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断,引物自身连续互补碱基不能大于3bp。

7.引物之间

两引物之间不应不互补性,尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。

8.引物的3′端

引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能,除在特殊的PCR(AS-PCR)反应中,引物3′端不能发生错配。

在标准PCR反应体系中,用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dNTP(四种dNTP各200μmol/L)以质粒(103拷贝)为模板,按95℃,25s;55℃,25s;72℃,1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下,引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。A∶A错配使产量下降至1/20,A∶G和C∶C错七下降至1/100。引物A:模板G与引物G:模板A错配对PCR影响是等同的。

9.引物的5′端

引物的5′端限定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大。因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白质结合DNA序列;引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。

10.密码子的简并

如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增特异性与效率。

2.2 常用的PCR引物设计软件

[1]软件的引物设计功能主要体现在两个方面:首先是引物分析评价功能,该功能只有少数商业版软件能够做到,其中以“Oligo 6”最优秀;其次是引物的自动搜索功能,各种软件在这方面的侧重点不同,因此自动搜索的结果也不尽相同。

自动搜索功能以“Premier Primer”为最强且方便使用,“Oligo 6”其次,其他软件如“Vector NTI Suit”、“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都带有引物自动搜索功能,但搜索结果不是十分理想。要想得到效果很好的引物,在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。笔者认为引物设计软件的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用,以“Premier”进行自动搜索,“Oligo”进行分析评价,如此可快速设计出成功率很高的引物。

Premier Primer使用步骤及技巧

“Premier”软件启动界面如下

其主要功能在主界面上一目了然(按钮功能如上述)。限制性酶切点分析及基元查找功能比较简单,点击该功能按钮后,选择相应的限制性内切酶或基元(如-10序列,-35序列等),按确定即可。常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。你还可以编辑或者添加新限制性内切酶或基元。

进行引物设计时,点击按钮,界面如下:

进一步点击按钮,出现“search criteria”窗口,有多种参数可以调整。搜索目的(Seach For)有三种选项,PCR引物(PCR Primers),测序引物(Sequencing Primers),杂交探针(Hybridization Probes)。搜索类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引物(Sense/Anti-sense Primer,或Both),或者成对查找(Pairs),或者分别以适合上、下游引物为主(Compatible with Sense/Anti-sense Primer)。另外还可改变选择区域(Search Ranges),引物长度(Primer Length),选择方式(Search Mode),参数选择(Search Parameters)等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求,建议使用默认设置。然后,随之出现的Search Progress窗口中显示Search Completed时,再按,这时搜索结果以表格的形式出现,有三种显示方式,上游引物(Sense),下游引物(Anti-sense),成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式,并按优劣次序(Rating)排列,满分为100,即各指标基本都能达标(如下图)。

点击其中一对引物,如第1#引物,并把上述窗口挪开或退出,显示“Peimer Premier”主窗口,如图所示:

该图分三部分,最上面是图示PCR模板及产物位置,中间是所选的上下游引物的一些性质,最下面是四种重要指标的分析,包括发夹结构(Hairpin),二聚体(Dimer),错误引发情况(False Priming),及上下游引物之间二聚体形成情况(Cross Dimer)。当所分析的引物有这四种结构的形成可能时,按钮由变成,点击该按钮,在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构,因此最好的情况是最下面的分析栏没有,只有。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度,可参考应用。

在需要对引物进行修饰编辑时,如在5’端加入酶切位点,可点击,然后修改引物序列。若要回到搜索结果中,则点击按钮。

如果要设计简并引物,只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规则,反推至DNA序列即可。对简并引物的分析不需像一般引物那样严格。

总之,“Premier”有优秀的引物自动搜索功能,同时可进行部分指标的分析,而且容易使用,是一个相当不错的软件。

Oligo 6.22使用技巧简介

功能

在专门的引物设计软件中,“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂,但初学者容易被其复杂的图表吓倒。Oligo 5.0的初始界面是两个图:Tm图和ΔG图;Oligo 6.22的界面更复杂,出现三个图,加了个Frq图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一,就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。

使用(以Oligo 6.22为例)

Oligo 6.22的启动界面如下:

图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG和Frq,其中Frq是6.22版本的新功能,为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。因为分析要涉及多个指标,起动窗口的cascade排列方式不太方便,可从windows菜单改为tili方式。如果觉得太拥挤,可去掉一个指标,如Frq,这样界面的结构同于Oligo 5.0,只是显示更清楚了。

经过Windows/Tili项后的显示如图:

在设计时,可依据图上三种指标的信息选取序列,如果觉得合适,可点击Tm图块上左下角的Upper按钮,选好上游引物,此时该按钮变成,表示上游引物已选取好。

下游引物的选取步骤基本同上,只是按钮变成Lower。ΔG值反映了序列与模板的结合强度,最好引物的ΔG值在5’端和中间值比较高,而在3’端相对低(如图:)

Tm值曲线以选取72℃附近为佳,5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq曲线为“Oligo 6”新引进的一个指标,揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时,宜选用3’端Frq值相对较低的片段。

当上下游引物全选好以后,需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是,引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成,也有可能是在上下游引物之间形成(cross dimer)。二聚体形成的能值越高,越不符合要求。一般的检测(非克隆)性PCR,对引物位置、产物大小要求较低,因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构(hairpin);与二聚体相同,发夹结构的能值越低越好。一般来说,这两项结构的能值以不超过4.5为好。当然,在设计克隆目的的PCR引物时,引物两端一般都添加酶切位点,必然存在发夹结构,而且能值不会太低。这种PCR需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果,对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC含量,以45-55%为宜。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高,导致引物的GC含量不能被控制在上述范围内,这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近,以有利于退火温度的选择。如果PCR的模板不是基因组DNA,而是一个特定模板序列,那么最好还进行False priming site的检测。这项检查可以看出引物在非目的位点引发PCR反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较高,就可能出假阳性的PCR结果。一般在错配引发效率以不超过100为好,但对于特定的模板序列,还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大,比如在正确位点的引发效率为450以上,而在错误位点的引发效率为130,那么这对引物也是可以接受的。

当我们结束以上四项检测,按Alt+P键弹出PCR窗口,其中总结性地显示该引物的位置、产物大小、Tm值等参数,最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。

由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“Primer Premier 5”的相类似,并且似乎并不比后者更好用,在此不再赘述。其实,使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求去寻找最佳引物,如果参数设置得当将大大提高工作效率。

除了本地引物设计软件之外,现在还有一些网上引物设计软件,如由Whitehead Institute 开发的“Primer 3”等。该软件的独特之处在于,对全基因组PCR的引物设计;可以将设计好的引物对后台核酸数据库进行比对,发现并排除可引发错配的引物。因此建议经常做全基因组PCR的用户试用。

3 PCR反应条件选择

3.1 PCR反应体系与反应条件

标准的PCR反应体系:

10×扩增缓冲液      10ul

4种dNTP混合物   各200umol/L

引物           各10~100pmol

模板DNA       0.1~2ug

Taq DNA聚合酶    2.5u

Mg2+         1.5mmol/L

加双或三蒸水至     100ul

上述体系为100ul,实验中一般用50ul体系,即以上所有试剂减半。也可根据Taq酶说明书上的推荐配方。

PCR反应五要素: 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物: 引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

设计引物应遵循以下原则:

①引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。

②引物扩增跨度: 以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3’端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。

⑤引物3’端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

引物量: 每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。

酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应, 一种是从栖热水杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。

dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0~7.5,小量分装, -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP应为50~200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。

模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是:溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS 还能与蛋白质结合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA。

Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为1.5~2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少。

PCR反应条件的选择

PCR反应条件为温度、时间和循环次数。

温度与时间的设置: 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90~95℃变性,再迅速冷却至40 ~60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70~75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100~300bp时)可采用二温度点法, 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。

①变性温度与时间:变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下,93℃~94℃lmin足以使模板DNA变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR失败。

②退火(复性)温度与时间:退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃~60℃,可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度:

Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)

复性温度=Tm值-(5~10℃)

在Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合,提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30~60sec,足以使引物与模板之间完全结合。

③延伸温度与时间:Taq DNA聚合酶的生物学活性:

70~80℃ 150核苷酸/S/酶分子

70℃ 60核苷酸/S/酶分子

55℃ 24核苷酸/S/酶分子

高于90℃时, DNA合成几乎不能进行。

PCR反应的延伸温度一般选择在70~75℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min是足够 的。3~4kb的靶序列需3~4min;扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些。

循环次数  循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30~40次之间,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多。

3.2 PCR反应条件的选择及优化

PCR技术已经在生物学研究和临床医学检验域中得到了广泛的应用,PCR技术也日臻完善。PCR技术操作简便,特异性强,敏感度极高,正因为敏感度高,很容易受其他因素的影响,因此要得到准确可靠的反应结果,需根据不同的模板,摸索最适合的条件,配制出PCR反应试剂。

聚合酶链反应必须具备下述基本条件:①模板核酸(DNA或RNA),②人工合成的寡核苷酸引物,③合适的缓冲体系,④镁离子,⑤三磷酸脱氧核苷酸,⑥耐热DNA聚合酶,RNA反转录酶及RNA酶抑制剂(RNasin),⑦温度循环参数(变性、复性和延伸的温度与时间及循环次数)。

1.模板的选择

PCR反应用DNA(单、双链DNA)或RNA都可以作模板进行核酸的体外扩增。若起始材料是RNA,须先通过逆转录得到cDNA后才能进行正常PCR扩增。核酸标本来源广泛,可以从纯培养的细胞或微生物中直接提取,也可以从临床标本(血、尿、便、痰、体腔积液、漱口水等)、犯罪现场标本(血斑、精斑、毛发等)、病理标本(新鲜或固定石蜡包埋标本)以及木乃伊标本中提取。无论标本来源如何,待扩增核酸都需部分纯化,以使核酸样品中不混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白质。虽然PCR可以仅用微量样品(甚至是来自单一细胞的DNA),但为保证反应的特异性,一般还宜用纳克级(ng)的克隆DNA、微克水平的染色体DNA或102-105拷贝的待扩增DNA片段做起始材料。

2.引物

PCR扩增产物的大小及扩增的靶序列在基因组中的位置是由引物限定的。因此,引物的选择与合成对PCR成功与否具有决定性意义。对某一DNA片段来说,由于同源顺序的存在,随意设计的两条引物链,其PCR产物经电泳分析时可能会出现多条电泳带。因此,在引物的设计过程中要考虑引物链的特异性,即它们只与被检测的DNA片断互补。

(1)    引物长度以16-30个碱基为宜,最佳20-24个bp,不会形成稳定的复合体。

(2)    有时引物不起作用,理由不明,可以移动序列位置来解决。

(3)    (G+C)%含量一般40%-60%为佳,两个引物中(G+C)%含量应尽量相似

(4)    两个引物之间不应发生互补,特别是在引物3’端避免形成“引物二聚体”。如无法避免,其3’端互补不应大于2个碱基。应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列,避免同源序列(尤其6个以上相同)。

(5)    引物内部避免形成次级结构,尤其是发卡结构,必要时应通过计算机进行结构分析。

(6)    引物浓度不宜偏高,浓度过高有两个弊端,一是易形成引物二聚体,二是当扩增微量靶目标并且起始材料又不太纯时容易产生非特异性产物。一般来说,用低浓度引物不仅经济,反应特异性也较好。

3.镁离子浓度

Mg2+浓度对PCR扩增反应的特异性和产量有着显著影响。PCR中常用的体系应Mg2+浓度为1.5mmol/L,但对不同的反应体系应优化Mg2+浓度。浓度过高,使反应特异性降低;浓度过低,使产物产量减少。PCR反应中Mg2+的加入量要比dNTP浓度高0.5-2.5mmol/L。最好对每种PCR反应体系Mg2+量的优化。另外,还需注意引物和模板DNA原液中是否含EDTA等螯合剂影响游离Mg2+的浓度。

4.三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)

PCR反应中每种dNTP的终浓度为50-200μmol/L,在此范围内,扩增产物量、特异性与合成忠实性这间的平衡最佳,dNTP浓度过低必然影响扩增产量,过高则会导致错误掺入,其浓度不能低于10-15μmol/L。由于dNTP的量还受其他因素的影响,所以不同反应体系中dNTP的最佳浓度不尽相同。

5、TapDNA聚合酶

在其他参数最佳时,每100μl反应液中含1-2.5u Taq DNa酶。然而酶的需要量可以根据不同的模板分子或引物而变化,当优化一种PCR反应体系时,最好在每100μl体积中加入0.5-5u酶的范围内试验最佳酶浓度。如酶浓度太高,会出现非特异性扩增,而过低时,则扩增产量太低。另外不同来源的Taq DNA酶、测定条件和单位定义的不同、生产厂家产品品质的优劣,这些都是使用Taq酶时需要考虑的因素。

6.温度循环参数

变性温度通常为94℃左右,主要取决于扩增片段的长度和(G+C)的比例,达不到变性温度致使变性不完全,是导致PCR失败的常见原因。变性时间一般为30-60秒,时间太长不但没有必要反而会因降低酶的活性而影响产量和反应特异性。常用PCR一般为20-40个周期,随着周期次数增加TaqDNA聚合酶活性降低,聚合时间延长,引物或单核苷酸减少等原因,会造成反应后期容易发生错误碱基掺入。所以在满足产物得率的前提下,应尽量减少周期次数。

7.石蜡油

加入石蜡油的目的是防止反应液蒸发,以免造成反应体积和成分的改变,特别是当反应体积小或反应条件严格时更应注意。反应中加入的石蜡油必须是高质量的,无菌的,不能含有抑制PCR反应中各种试剂活性的污染物,加入的体积要求不太严格,应以盖住反应液液面为度。

8.平台效应

“平台效应”是指PCR后期循环产物累积趋于饱和,使原来以指数增长的速率变成平坦的曲线,同时出现非特异产物的大量增加的现象。下列因素可能与平台效应有关:

(1)dNTP或引物的消耗量。

(2)反应物的稳定度(dNTP或酶)

(3)最终产物的阻化作用(焦磷酸盐、双链DNA)。

(4)非特异产物或引物二聚体与反应物的竞争。

(5)产物在高浓度时变性不完全,影响引物的延伸。

(6)酶与PCR产物的结合,使酶分子减少。

合理的PCR循环参数,能最大限度地避免这些因素对产物扩增的影响。

3.3 PCR反应的常见问题总结

PCR 的问题,无疑是绝大多数学生物的人都关心的问题。今天我们把相关内容整理出来,与大家共同讨论,希望对大家能有所帮助。

一、引物设计

所谓“工欲善其事,必先利其器”,这年头手工设计引物的人似乎不多,还是用软件方便些,防止你一不小心看走眼,丢一个碱基,同时计算起来也方便。设计软件有很多,既可以在线设计(如Primer3 http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi),也可以用Primer5、Oligo6.65 等等。

1. 引物设计的原则 细心地进行引物设计是PCR 中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同时扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点: 1)典型的引物18 到24 个核苷长。引物需要足够长,保证序列独特性,并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24 核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交,降低了特异性,而且比短序列杂交慢,从而降低了产量。 2)选择GC 含量为40%到60%或GC 含量与模板GC 含量接近的引物。 3)设计5'端和中间区为G 或C 的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。 4)避免引物对3'末端存在互补序列,这会形成引物二聚体,抑制扩增。在用软件设计时大家常常会疑惑,究竟? G 不能低于多少?这里有个数据: ? G 为0~-2时,PCR 产率可达100%, ? G=-6 时,为40%. 5)避免3'末端富含GC。设计引物时保证在最后5 个核苷中含有3 个A 或T。 6)避免3'末端的错误配对。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。3’最好以G或C 结尾,防止AT 的松散结合引起错配。 7)避免存在可能会产生内部二级结构如发夹结构的序列,这会破坏引物退火稳定性。 8)引物的一个重要参数是熔解温度(Tm)。这是当50%的引物和互补序列表现为双链DNA 分子时的温度。两引物的Tm 值相差不应大于5℃。计算Tm 有几种公式。第一个公式(Wallace 规则):Tm = 4℃(g + C) +2℃(a + T),这来源于高盐溶液中的杂交,适用于小于15-20个碱基的引物,也适用于手工设计时的简单计算。第二个公式(Baldino 算法)适用于计算14-70个核苷酸在≤0.4mol\L 的阳离子溶液中的Tm, 也可用于扩增产物的Tm 计算.Tm=81.5+16.6*lg[K+]+0.41(%[G+C])-(675/n)。以上两种算法都是基于碱基组成而不是碱基排列而计算的,事实上相同碱基组成的引物Tm 可能差异不小:GGGAA 和GAGAG 的Tm 是不一样的,所以确定引物Tm 最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序如Primer5 等均使用近邻分析法。 9)当在引物5’端添加酶切位点时要考虑:a)该目的序列内部不得含有相同的酶切位点,在引物发出后才发现错误的事情本人就干过,在论坛上也能看到这样的粗心人。这样的错误会给将来的克隆造成麻烦。b)如果打算PCR 后直接酶切,不要忘了在酶切位点的外侧再加上保护碱基,不同的酶对于保护碱基的要求是不同的。如果不设计保护碱基,则多半要用TA 克隆的方式连接到质粒上,这时要注意Taq 酶的选择,这一点在后面再聊。若想在目的序列上附加上并不存在的序列,如限制位点和启动子序列,可以加入到引物5'端而不影响特异性。当计算引物Tm 值时并不包括这些序列,但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。 10)有时候,对于引物设计仅了解有限的序列信息。比如,如果仅知道氨基酸序列,可以设计兼并引物。兼并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性,可以参考密码子使用表,根据不同生物的碱基使用偏好,减少兼并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对,降低引物的退火温度。特别要注意的是:不要在引物的3'端使用兼并碱基,因为3'端最后3 个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。使用较高的引物浓度(1µM 到3µM),因为许多兼并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。说了半天了,想起来还得提醒大家一句:千万别搞错了引物的位置!这句话似乎多余。仔细琢磨一下,特别是5’端再接上酶切位点可别搞错了!合成错了一条可就是50 块钱,到时候挨老板批的时候别怪我没提醒你哦:)设计好了引物就要让公司合成,这时候别忘了谈价格:)现在竞争很厉害,价格已经挺便宜了,注意两个参数:一个是OD 值,如果公司说1OD 能比2OD 优惠,那通常1OD 足够了。第二是纯度,是HPLC 的还是OPC 的,事先要说好,建议看看这里(唉,不是我给他们做广告,只是他们的说明书写得真不错):http://www.takara.com.cn/product/cs/c_3.htm#1引物设计方面还有很多话题可说,比如如何利用引物搭桥将两个片段通过PCR 而不是酶连接起来、如果要设计引物表达蛋白时注意“N 端规则”。

二、PCR 成分

引用《分子克隆3》提供的PCR 标准反应条件: 模板1pg-1μg 引物1μmol/L DNA 聚合酶1-5 单位 Mg2 1.5mmol/L dNTPs 200μmol/L KCl 50 mmol/L

1. 模板 模板可是PCR 的关键,模板的质量是PCR 成功的先决条件,巧妇难为无米之炊嘛!怎样得到模板,这可是一个大问题,仅仅一个提取基因组DNA 就有很多的名堂,这会是我们后面专辑的内容,这里不多说啦,有问题来论坛讨论吧。P 不出东西的时候不妨先考虑:模板有没有问题?(DNA 样品中发现有多种污染物会抑制PCR。一些在标准基因组DNA 制备中使用的试剂,如SDS,在浓度低至0.01%时就会抑制扩增反应。)所需的最佳模板量取决于基因组的大小。你的目的片段在基因组中占多少?至少要保证模板中含有一个单拷贝吧!100ng 到1µg 的人类基因组DNA,相当于3×104 到3×105 个分子。所以对于单拷贝基因,这需要0.1μg 的人基因组DNA,10ng的酵母DNA,1ng 的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时,用量更少.灵敏的PCR 可从一个细胞,一根头发,一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列.模板量过多则可能增加非特异性产物.DNA中的杂质也会影响PCR的效率。

2. 引物 引物以干粉形式运输。最好用TE 重溶引物,使其最终浓度为100µM。TE 比去离子水好,因为水的pH 经常偏酸,会引起寡核苷的水解。当然,如果担心TE 对于PCR 的影响,不妨用ddH2O。引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大于10µM 浓度溶于TE 的引物在-20℃可以稳定保存6 个月,但在室温(15℃到30℃)仅能保存不到1 周。干粉引物可以在-20℃保存至少1 年,在室温(15℃到30℃)最多可以保存2 个月。注意:溶解之前先离心一下,防止一开盖就飞了。引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1 到0.5µM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。通常跟着引物来的说明书会告诉你,关于寡核苷酸的计算可以看看这里:http://www.takara.com.cn/product/fl/i_1.htm

3. 聚合酶的选择 这可是有讲究,咱论坛里有个专题讨论这个问题。主要考虑两个方面:用途——对保真度的要求高不高?成本——高保真的酶总是会贵一些的。综合考虑一下找个平衡点吧,当然啦,该花钱的时候可不能省。Taq DNA聚合酶被看做是低保真度的聚合酶,因为其缺少3'到5'外切核酸酶(校正)活性。使用带有3'到5'外切核酸酶活性的热稳定聚合酶可以提高保真度。但是这些聚合酶的产量比Taq DNA聚合酶低。在很多公司的手册中有对各种酶特性的描述,大家不妨比较一下。提醒一点:高保真酶除了我所知的Merck的Easy-A 以外,都不会在3’端加A尾巴(因为其3’-5’外切酶活性),所以做TA克隆的时候需要一点小诀窍——扩增完了再加普通Taq去加个A。另外还有个方法:将Taq DNA聚合酶同带有3'到5'外切核酸酶活性第二种聚合酶混合在一起可以获得比单独Taq DNA聚合酶高的保真度,并可以得到高产量及扩增长模板。 4. Mg2+浓度 镁离子影响PCR的多个方面,如DNA聚合酶的活性,这会影响产量;再如引物退火,这会影响特异性。dNTP和模板同镁离子结合,降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同,但是包含200µM dNTP的典型PCR起始浓度是1.5mM(注意:对实时定量PCR,使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液)。在多数情况下,较高的游离镁离子浓度可以增加产量,但也会增加非特异性扩增,降低忠实性(当然,也有相反的报道)。为了确定最佳浓度, 可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。在PCR反应混合物中, 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团, 例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+ 离子浓度的物质,以保证最适Mg2+ 浓度。 5. dNTPs 高浓度的dNTPs会对扩增反应起抑制作用。将每种dNTP的浓度从200µM降低到25-50µM可以使扩增产物获得满意的产率。 6. KCl 标准浓度为50 mmol/L, 对于较短片段可将其提高到70-100 mmol/L.   三、PCR 反应参数 1. 变性:在第一轮循环前,在94℃下变性5-10min 非常重要,它可使模板DNA 完全解链,然后加入Taq DNA聚合酶(hot start),这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全,往往使PCR 失败,因为未变性完全的DNA 双链会很快复性,减少DNA 产量.一般变性温度与时间为94℃ 1min。在变性温度下,双链DNA 解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。对于富含GC 的序列,可适当提高变性温度.但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。 2. 退火:这是PCR 的一个关键参数。在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火,同时还要足够高,以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm 低5℃, 当产物中包含有影响实验的非可异性扩增带时,以2℃为增量,逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。如果两个引物Tm 不同,将退火温度设定为比最低的Tm 低5℃。或者为了提高特异性,可以在根据较高Tm 设计的退火温度先进行5 个循环,然后在根据较低Tm 设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。退火温度越高,所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,只用两种温度(例如用60℃和94℃)完成整个扩增循环, 既省时间又提高了特异性。退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。 3. 延伸:延伸反应通常为72℃,接近于Taq DNA 聚合酶的最适反应温度75℃.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为Taq DNA 聚合酶的作用温度范围可从20℃-85℃.延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度.在一般反应体系中,Taq DNA聚合酶每分钟约可合成1kb 长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加.但对很低浓度的目的序列, 则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物, 这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。   

4. 循环次数: 当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于DNA 浓度。一般而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多,会使PCR 产物中非特异性产物大量增加。通常经25-30 轮循环扩增后, 反应中Taq DNA 聚合酶已经不足, 如果此时产物量仍不够, 需要进一步扩增,可将扩增的DNA 样品稀释103-105倍作为模板, 重新加入各种反应底物进行扩增, 这样经60 轮循环后, 扩增水平可达109-1010。扩增产物的量还与扩增效率有关,扩增产物的量可用下列公式表示:C=Co(1+P)n 。其中:C 为扩增产物量,C0 为起始DNA 量, P 为增效率, n 为循环次数。在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增,达到较高水平。因此,应适当调节循环次数,在平台期前结束反应,减少非特异性产物。

四、提高PCR 扩增特异性

1. 递减PCR(TouchDown PCR) 递减PCR 通过在PCR 的前几个循环使用严紧的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm 高大约5℃的退火温度下开始,然后每个循环降低1℃到2℃(当然,也可以每几个循环降1-2℃),直到退火温度低于Tm 5℃。特异性最高的目的模板会被优先扩增,这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。递减PCR 对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用,如AFLP® DNA 指纹分析。

2. 热启动 热启动PCR 是除了好的引物设计之外,提高PCR 特异性最重要的方法之一。尽管TaqDNA 聚合酶的最佳延伸温度在72℃,聚合酶在室温仍然有活性。因此,在进行PCR 反应配制过程中,以及在热循环刚开始,保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成,就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时,如定点突变、表达克隆或用于DNA 工程的遗传元件的构建和操作,热启动PCR 尤为有效。并且,热启动在很大程度上防止引物二聚的发生。限制Taq DNA 聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR 反应液,并将其置于预热的PCR 仪。这种方法简单便宜,但并不能完成抑制酶的活性,因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA 合成,直到PCR 仪达到变性温度。包括延缓加入Taq DNA 聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐,尤其是对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分,入镁离子或酶,包裹起来,或者将反应成分,如模板和缓冲液,物理地隔离开。在热循环时,因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样,蜡防护层法比较烦琐,易于污染,不适用于于高通量应用。

3. 促进PCR 的添加剂 退火温度,引物设计和镁离子浓度的优化足以对大多数模板进行高特异性的扩增,但是,某些模板,包括高GC 含量的模板,需要其他的措施。影响DNA 熔解温度的添加剂提供了提高产物特异性和产量的另外一种方法。为获得最好的结果需要模板的完全变性。另外,二级结构会阻止引物结合和酶的延伸。PCR 添加剂,包括甲酰胺,DMSO,甘油甜菜碱以及PCRx Enhancer Solution 可以增强扩增。它们可能的机理是降低熔解温度,从而有助于引物退火并辅助DNA 聚合酶延伸通过二级结构区。PCRx Solution 还有其他优点。在同PlatinumTaq DNA 聚合酶和Platinum Pfx DNA 聚合酶一起使用时,仅需很少的镁离子优化。这样,将Platinum 技术同添加剂结合,增强了特异性,同时减少了第三种方法-镁离子优化的依赖。为获得最佳结果,应优化添加剂的浓度,尤其是会抑制Taq DNA 聚合酶的DMSO,甲酰胺和甘油。

4. 巢式PCR 使用巢式引物进行连续多轮扩增可以提高特异性和灵敏度。第一轮是15 到20 个循环的标准扩增。将一小部分起始扩增产物稀释100 到1000 倍加入到第二轮扩增中进行15 到20个循环。或者,也可以通过凝胶纯化将起始扩增产物进行大小选择。在第二轮扩增中使用一套巢式引物,其可以同第一套引物内侧的靶序列结合。巢式PCR 的使用降低了扩增多个靶位点的可能性,因为同两套引物都互补的靶序列很少。而使用同样的引物对进行总数相同的循环(30 到40)会扩增非特异性靶位点。巢式PCR 可以增加有限量靶序列(如稀有mRNA)的灵敏度,并且提高了困难PCR(如5' RACE)的特异性。

五、PCR 产物测序

对于PCR 产物的测序有两个方式:

1. DNA 直接测序: 指直接分析不经分离的PCR 扩增产物,如果各个位点上碱基序列都是一致的,则所得信号是确定的,否则,在那些有相异碱基的位点出现模糊信号, 如果模板在多数情况下被正确扩增,则少数的突变将被掩盖,这是结果显示的是模板的序列.但是,当扩增的前几轮即出现错误扩增并被后续的循环积累,这时就不再反映模板的状况.

2. PCR 产物经克隆后测序: 这是对单克隆测序,其结果是反映单一扩增产物的序列,结果是确定的.

六、PCR 污染与对策

PCR 反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性,但令人头痛的问题是易污染,极其微量的污染即可造成假阳性的产生.

1、污染原因 (一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染,或标本放置时,由于密封不严溢于容器外,或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中,由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散,导致彼此间的污染. (二)PCR 试剂的污染:主要是由于在PCR 试剂配制过程中,由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR 核酸模板污染. (三)PCR 扩增产物污染.这是PCR 反应中最主要最常见的污染问题.因为PCR 产物拷贝量大(一般为1013 拷贝/ml),远远高于PCR 检测数个拷贝的极限,所以极微量的PCR 产物污染,就可造成假阳就可形成假阳性. 还有一种容易忽视,最可能造成PCR 产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000 拷贝,因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题. (四)实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室,这个问题也比较常见.因为克隆质粒在单位容积内含量相当高,另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂,而且在活细胞内的质粒,由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力.其污染可能性也很大.

2、污染的监测 一个好的实验室,要时刻注意污染的监测,考虑有无污染是什么原因造成的污染,以便采取措施,防止和消除污染. 对照试验: 1)阳性对照:在建立PCR 反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR 阳性对照,它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志.阳性对照要选择扩增度中等、重复性好,经各种鉴定是该产物的标本,如以重组质粒为阳性对照,其含量宜低不宜高(100 个拷贝以下).但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本,其对检测或扩增样品污染的可能性很大.因而当某一PCR 试剂经自己使用稳定,检验人员心中有数时,在以后的实验中可免设阳性对照. 2)阴性对照:每次PCR 实验务必做阴性对照.它包括①标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照.②试剂对照:在PCR 试剂中不加模板DNA 或RNA,进行PCR 扩增,以监测试剂是否污染. 3)重复性试验 4)选择不同区域的引物进行PCR 扩增

3、防止污染的方法 (一)合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR 反应液、PCR 循环扩增及PCR 产物的鉴定等步骤分区或分室进行,特别注意样本处理及PCR 产物的鉴定应与其它步骤严格分开.最好能划分①标本处理区;②PCR 反应液制备区;③PCR 循环扩增区;④PCR 产物鉴定区. 其实验用品及吸样枪应专用.实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA 或RNA. (二)吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题.由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源,因而加样或吸取模板核酸时要十分小心,吸样要慢,吸样时尽量一次性完成,忌多次抽吸,以免交叉污染或产生气溶胶污染. (三)预混和分装PCR 试剂:所有的PCR 试剂都应小量分装,如有可能,PCR 反应液应预先配制好,然后小量分装,-20℃保存.以减少重复加样次数,避免污染机会.另外,PCR 试剂,PCR 反应液应与样品及PCR 产物分开保存,不应放于同一冰盒或同一冰箱. (四)防止操作人员污染,使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用. (五)设立适当的阳性对照和阴性对照,阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜,并注意交叉污染的可能性,每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照. (六)减少PCR 循环次数,只要PCR 产物达到检测水平就适可而止. (七)选择质量好的Eppendorf 管,以避免样本外溢及外来核酸的进入,打开离心管前应先离心,将管壁及管盖上的液体甩至管底部.开管动作要轻,以防管内液体溅出.

4、PCR 污染解决对策(这是从另一篇文章总结而来,与前面的部分略有重复,大家随便看看吧)PCR 检测微量感染因子时,一定要注意产物残留污染的问题。   一. 污染的预防 进行PCR 操作时,操作人员应该严格遵守一些操作规程,最大程度地降低可能出现的 PCR 污染或杜绝污染的出现。 (一)划分操作区:目前,普通PCR 尚不能做到单人单管,实现完全闭管操作,但无论是否能够达到单人单管,均要求实验操作在三个不同的区域内进行,PCR 的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行: 1. 标本处理区,包括扩增摸板的制备; 2. PCR 扩增区,包括反应液的配制和PCR 扩增; 3. 产物分析区,凝胶电泳分析,产物拍照及重组克隆的制备。 各工作区要有一定的隔离,操作器材专用,要有一定的方向性。如:标本制备→PCR扩增? 产物分析? 产物处理。 切记:产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。 (二)分装试剂:PCR 扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中,不能用来吸取扩增后的DNA 和其他来源 的DNA: 1.PCR 用水应为高压的双蒸水; 2.引物和dNTP 用高压的双蒸水在无PCR 扩增产物区配制; 3.引物和dNTP 应分装储存,分装时应标明时间,以备发生污染时查找原因。    (三) 实验操作注意事项尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因,样品间的交叉污染也是原因之一。因此,不仅要在进行扩增反应是谨慎认真,在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意: 1. 戴一次性手套,若不小心溅上反应液,立即更换手套; 2. 使用一次性吸头,严禁与PCR 产物分析室的吸头混用,吸头不要长时间暴露于空气中,避免气溶胶的污染; 3. 避免反应液飞溅,打开反应管时为避免此种情况,开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上,应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面; 4. 操作多份样品时,制备反应混合液,先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,然后分装,这样即可以减少操作,避免污染,又可以增加反应的精确度; 5. 最后加入反应模板,加入后盖紧反应管; 6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照,即可验证PCR 反应的可靠性,又可以协助判断扩增系统的可信性; 7. 尽可能用可替换或可高压处理的加样器,由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA 的污染,最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器,至少PCR操作过程中加样器应该专用,不能交叉使用,尤其是PCR 产物分析所用加样器不能拿到其它两个区; 8. 重复实验,验证结果,慎下结论。   二. 追踪污染源 如果不慎发生污染情况,应从下面几条出发,逐一分析,排除污染。 (一)设立阴阳性对照:有利于监测反应体系各成分的污染情况。选择阳性对照时,应选择扩增弱,且重复性好的样品,因强阳性对照可产生大量不必要的扩增序列,反而可能成为潜在的污染源。如果以含靶序列的重组质粒为对照,100 个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增。阴性对照的选择亦要慎重,因为PCR 敏感性极高,可以从其它方法(Sourthern 印迹或点杂交等)检测阴性的标本中检测出极微量的靶分子。此外,每次扩增均应包括PCR 体系中各试剂的时机对照,即包括PCR 反应所需的全部成分,而不加模板DNA,这对监测试剂中PCR 产物残留污染是非常有益的。如果扩增结果中试剂对照为阳性结果,就是某一种或数种试剂被污染了。此时,要全部更换一批新的试剂进行扩增,扩增时设立不同的反应管,每一管含有一种被检测试剂,在检出污染试剂后,应马上处理。 (二)环境污染:在排除试剂污染的可能性外,更换试剂后,若不久又发现试剂被污染了,如果预防措施比较严密,则考虑可能为环境污染。 环境污染中常见的污染源主要有: 1. 模板提取时真空抽干装置; 2. 凝胶电泳加样器; 3. 电泳装置; 4. 紫外分析仪; 5. 切胶用刀或手术刀片; 6. 离心机; 7. 冰箱门把手,冷冻架,门把手或实验台面等;此时可用擦拭实验来查找可疑污染源。1)用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源;2)0.1ml 去离子水浸泡;3)取5ml 做PCR 实验;4)电泳检测结果。 8. 气溶胶。如果经过上述追踪实验,仍不能查找到确切污染源,则污染可能是由空气中PCR 产物的气溶胶造成的,此时就应该更换实验场所,若条件不允许,则重新设计新的引物(与原引物无相关性)。   三.污染处理 (一)环境污染 1. 稀酸处理法:对可疑器具用1mol/L 盐酸擦拭或浸泡,使残余DNA 脱嘌呤; 2. 紫外照射(UV)法:紫外波长(nm)一般选择254/300nm,照射30min 即可。需要注意的是,选择UV 作为消除残留PCR 产物污染时,要考虑PCR 产物的长度与产物序列中碱基的分布,UV 照射仅对500bp 以上长片段有效,对短片段效果不大。UV 照射时,PCR产物中嘧啶碱基会形成二聚体,这些二聚体可使延伸终止,但并不是DNA 链中所有嘧啶均能形成二聚体,且UV 照射还可使二聚体断裂。形成二聚体的程度取决于UV 波长,嘧啶二聚体的类型及与二聚体位点相邻核苷酸的序列。在受照射的长DNA 链上,形成二聚体缺陷的数量少于0.065/碱基,其他非二聚体的光照损伤(如环丁烷型嘧啶复合体,胸腺嘧啶乙二醇,DNA 链间与链内的交联和DNA 断裂等)均可终止Taq DNA 聚合酶的延伸。这些位点的数量与二聚体位点相当。如果这些位点( 0.13/碱基)在DNA 分子上随机分布,一个500bp片段的DNA 分子链上将有32 处损伤位点,那么,105个这样的分子中每个分子中会至少有一处损伤。相反,如果100bp 的片段,每条链上仅有6 处损伤,105个拷贝分子中将有许多分子没有任何损伤。这就是UV 照射有一定的片段长度限制的原因。   (二)反应液污染 可采用下列方法之一处理: 1. DNase I 法:PCR 混合液(未加模板和Taq 聚合酶)加入0.5U DNase I,室温反应30min 后加热灭活,然后加入模板和Taq 聚合酶进行正常PCR 扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA 的序列; 2. 内切酶法:选择识别4 个碱基的内切酶(如Msp I 和Taq I 等),可同时选择几种,以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷,室温作用1h 后加热灭活进行PCR; 3. 紫外照射法:未加模板和Taq 聚合酶的PCR 混合液进行紫外照射,注意事项与方法同上述UV 照射法; 4. g 射线辐射法:1.5kGy 的辐射可完全破坏0.1ng 基因组DNA,2.0 kGy 可破坏104 拷贝的质粒分子,4.0 kGy 仍不影响PCR,但高于此限度会使PCR 扩增效率下降。引物可受照射而不影响PCR,g 射线是通过水的离子化产生自由基来破坏DNA 的。   (三)尿嘧啶糖苷酶(UNG)法 由于UV 照射的去污染作用对500bp 以下的片段效果不好,而临床用于检测的PCR 扩增片段通常为300bp 左右,因此UNG 的预防作用日益受到重视和肯定。 1. 原理:在PCR 产物或引物中用dU 代替dT。这种dU 化的PCR 产物与UNG 一起孵育,因UDG 可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键,可除去dU 而阻止TaqDNA 聚合酶的延伸,从而失去被再扩增的能力。UNG 对不含dU 的模板无任何影响。UNG 可从单或双链DNA 中消除尿嘧啶,而对RNA 中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。  2. dUTP 法:用dUTP 代替dTTP,使产物中掺入大量dU。在再次进行PCR 扩增前,用UNG 处理PCR 混合液即可消除PCR 产物的残留污染。由于UNG 在PCR 循环中的变性一步便可被灭活,因此不会影响含dU 的新的PCR 产物。 3. dU 引物法:合成引物时以dU 代dT,这样PCR 产物中仅5ˊ端带dU。UNG 处理后,引物失去了结合位点而不能扩增。对长片段(1-2kb 以上)的扩增用dUTP 法效率较用dTTP低,而用dU 法就可克服这一缺点。dU 引物最好将dU 设计在3ˊ端或近ˊ端。该法仅能用于引物以外试剂的处理。 4. 优点:可以去除任何来源的污染;UNG 处理可以和PCR 扩增在同一个反应管内进行;由于扩增产物中有大量dU 存在,可彻底消除污染源。 5. 需注意的是掺入dUTP 的DNA不应对产物的任何操作有影响,在进行PCR 产物克隆时,应该转化UNG-(UNG 缺陷)大肠杆菌受体菌,否则转化产物会被受体菌UNG 消化掉。   (四) 固相捕获法 用于去除标本中污染的核酸和杂质,原理如下:1)用一生物素标记的单链RNA 探针与待扩核酸杂交,杂交区域是非扩增区;2)用包被链霉亲和素的固相载体来捕获带有生物素探针的杂交核酸,通过漂洗可去除污染的扩增产物和杂质;3)洗脱靶分子后用特异引物扩增非RNA 探针杂交区域。第2)步的漂洗后可用PCR 检测以确定标本是否被扩增产物或重组质粒污染。   (五)RS-PCR 法(RNA-specific PCR) 也称为链特异性PCR,主要指用于RNA 模板的特异性PCR 法,该法可明显降低假阳性而不影响PCR 的敏感性。其关键在于设计引物,逆转录引物的3ˊ端(A 区)有2 0 个核苷酸左右为模板的特异性互不序列,5ˊ端2 0 个核苷酸(C 区)为附加修饰碱基。与mRNA逆转录后,经超速离心使cDNA 与多余引物分开,再用和第二引物(C)以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA,以后的PCR 循环中用逆转录引物的B 区和引物C 进行扩增加尾cDNA,而污染的DNA 或质粒DNA 才不会被扩增。   (六)抗污染引物法 该对引物扩增时通过病毒DNA克隆如入质粒的位点。这一区域只存在完整的原病毒中,在重组质粒中,这一区域分成两个区域与克隆位点被。如果重组质粒污染了标本,也不能扩增出任何条带,即使出现了扩增带,其大小也与预期的不同。只有原病毒DNA 才能被引物扩增,因此只要出现预期大小的扩增带就可以证明标本是阳性的,该法试用于环状靶分子系列。

附录: 各种碱基符号

在设计简并引物或测序时你可能会碰到这样的符号来表示碱基,到时候不要不知道哦: B = C or G or T D = A or G or T H = A or C or T K = G or T M = A or C N = A or C or G or T R = A or G S = C or G V = A or C or G W = A or T Y = C or T

4 结果检测与分析

4.1 PCR扩增产物的检测分析

PCR扩增反应完成之后,必须通过严格的鉴定,才能确定是否真正得到了准确可靠的预期特定扩增产物。凝胶电泳是检测PCR产物常用和最简便的方法,能判断产物的大小,有助于产物的鉴定。凝胶电泳常用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳,前者主要用于DNA片段大于100bp者,后者主要用来检测小片段DNA。

1.琼脂糖凝胶电泳

这是实验室最常用的方法,简便易行,只需少量DNA即可进行实验。其原理是不同大小的DNA分子通过琼脂糖凝胶时,由于泳动速度不同而被分离,经溴化乙锭(EB)染色,在紫外光照射下DNA分子发出荧光而判定其分子的大小。

用于电泳检测PCR产物的琼脂糖浓度常为1%—2%,应该使用纯度高的电泳纯级琼脂糖,这种琼脂糖已除去了荧光抑制剂及核酸酶等杂质。

(1)制胶

琼脂糖凝胶厚度约为3~5mm。过薄则加样孔样品会溢出来,过厚观察时荧光穿透不强以至有些小片段DNA带型不易分辨。如配制2%凝胶100ml,称取琼脂糖2g于三角瓶中,加入100ml 0.5×TBE液,微波炉加热2-5min,使琼脂糖完全溶解(注意不要暴沸),置室温等温度下降至60℃时,加入终浓度0.5μg/ml的EB液,充分混匀后倒板(注意排除气体)。

(2)加样和电泳

上样时一般取PCR反应液5~10μl,加入3μl溴酚兰液,充分混匀,加入凝胶加样孔中。电泳仪可用一般稳压可调中压电泳仪,电泳工作液为0.5×TBE液,接通电源,使样品由负极向正极移动。60-100V恒压电泳约30-60分钟。

(3)检测

将凝胶板放在紫外透射仪的石英玻璃台上进行检测,DNA产物与荧光染料EB形成橙黄色荧光复合物。观察各泳道是否有橙黄色荧光带出现,并与扩增时所设的阳性对照比较,判断阳性或阴性结果。也可在电泳时以标准分子量作对照,判断其扩增片段是否与设计的大小相一致。

2、聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶电泳繁琐,但在引物纯化、PCR扩增指纹图、多重PCR扩增、PCR扩增产物的酶切限制性长度多态性分析时常用到。

它与琼脂糖凝胶电泳比较具有如下优点:

分辨率很强,可达1bp;

②能装载的DNA量大,达每孔10μgDNA;

③回收的DNA纯度高;

④其银染法的灵敏度较琼脂糖中EB染色法高2~5倍;

⑤避免了EB迅速退色的弱点,银染的凝胶干燥后可长期保存。

聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨DNA片段的有效范围:

(1)制胶

在两块制胶玻璃板中间放上垫片,放上制胶架,拧紧制胶螺丝夹紧玻璃板。

制备适量合适浓度的凝胶,使之略多于胶板。制备100μl体积凝胶的配制方法见下表。

不同浓度(%)聚丙酰胺凝胶的制法:

试剂

3.5%

5%

8%

12%

20%

30%丙烯酰胺溶液(ml)

11.6

16.6

26.6

40

66.6

水(ml)

67.7

62.7

26.6

40

66.6

5×TBE(ml)

20

20

20

20

20

10%过硫酸铵(ml)

0.7

0.7

0.7

0.7

0.7

TEMED(ml)

0.035

0.035

0.035

0.035

0.035

在加入TEMED和10%过硫酸铵后,立即混匀,倒入放置45℃角的玻璃板内,完全注满(注意不要有气泡),迅速将玻璃板放置水平位置。立即放成型梳子于腔顶并夹紧,待30-60分钟胶聚合后,取下胶板,放入电泳槽中固定。

(2)加样和电泳

上下槽中加入1×TBE电泳缓冲液,溢过加样孔,拔出梳子,排出加样孔中的气泡,将PCR产物或限制性内切酶消化产物2与1上样缓冲液混匀,用微量注射器加入加样孔底部,使样品在孔底成一层,两侧孔中加入标准分子量的DNA Marker。

以2-10V/cm电压电泳,电泳时间足够长,使片断足以分开,待指示剂走到适宜位置时关闭电源,将胶片取出。

(3)银染

分开两块玻璃板,将凝胶片放入100ml银染固定液中振荡15min,双蒸水洗3次,每次2min,然后将凝胶片转入100ml 0.2%的AgNO3中于摇床上染色约10min,吸去AgNO3液,用双蒸水洗3次,每次30s,加入100ml显色液约7-10min,待DNA带显示清除时,吸去显色液,加入固定液Na2CO3,静置2-3min,取出凝胶观察。

4.2 PCR产物测序

PCR技术代替了为测序而反复进行的分子克隆和模板制备步骤。PCR技术与自动测 序技术相结合后,它将成为一种最快、最有效的测定核苷权序列的方法。本章主要综 述各种测模板的制备以及如何完成PCR产物的直接测序。与传统的将PCR片段克隆入质 粒或病毒基因组相比,直接序列分析有两个主要的优点:1)由于它是一个不依赖于生 物体(如细菌、病毒等)的体外系统,因而它更容易标准化(即例于自化2);对于每个待 测样品,只需测定一个单链序列,因而它也就更快和更准确。相比之下,间接测序为 了区别在PCR反应过程中由DNA聚合酶引入的随机错朽核苷酸所引起的原始基因组序列 中的突变,以及由体外重组而产生的人工扩增产物,如产生镶嵌等位基因(混合克隆) 等,每个样品不得不测定几个PCR产物克隆的序列。

不需借助在细菌中克隆就可直接获得清蜥和准确的序列结果,其难易程度取决 于:1)只扩增靶序列的PCR引物的扩增能力(通常称为PCR特异性);2用以获笪测序模板 的方法。与引物物异性及模板制备有关的问题将在下面谈到。虽然DNA测序的化学法 (Maxam-Gilbrt)可以用来直接测序,但我们这里仅讨论Sanger的末端终止法。

最佳的PCR条件

PCR反应的特异性在很大程度上是由寡聚核苷酸引物的序列所决定的。对于特定 的引物组,PCR的特异性可以由于采用最佳的反应条件、退火温度和PCR缓冲液中的 MgCl2浓度而发生明显的变化。如果用标准的1.5mM的MgCl2浓度不能得到所需的特异 性PCR产物,我们建议MgCl2的终浓度为1.4∽2.5mM之间,以0.2mM增长率来改变MgCl2 浓度,以选择最佳Mg++浓度。一个较常遇见的问题是,使PCR特异性达到最高的MgCl2 浓度导致PCR扩增失败(dropouts)。这可能是由于模板DNA溶液中有较高的EDTA,它隆 低了提供给Taq DNA聚合酶MgCl2量。因此,对于扩增溶解在TE(1mM EDTA)中的DNA, 我们建议用含2.0mM的MgCl2的PCR缓冲液。

PCR反应的温度范围包含有三个不同的恒定期:变性期、退火期和延伸期,还有它 们之间的过渡期。为了获得用于序列分析的模板或杂交探针的单链DNA,通常并不需 要改变参数。

凝胶纯化PCR扩增的靶序列

如果最佳PCR反应条件不能产生所需的特异性产物,可采用新的寡核苷酸重新进 行扩增,或用凝胶电泳来分离不同的PCR产物,而后再各自重新扩增进行序列分析。 长度不同的片段可以用琼脂糖凝胶电泳来分离:

1.片段大小在80-100bp时,可采用3%NuSieve1%普通琼脂糖或用聚丙烯酰胺胶来 分离。

2.从胶上切下含所南非PCR片段的薄片

3.加入50∽100μlTE浸泡胶片,可反复冻融或放置几个小时使DNA从胶中扩散出 来。

4.取少量(1-5%)进行第二次扩增,为得到纯净单一的产物,用于第二次PCR扩增 的凝胶抽提物的量必须少于1ng。

5.现已发现琼脂糖含有抑制Tab聚合酶活的物质。因而,如需重新扩增供Tab聚合 酶测序用的片段,最好用丙烯酰胺电泳分离。

当用PCR引物扩增几个同样长度的相关序列时,如来自几个新近复制的基因,或 重复序列或保守的信号序列(conserved signal sequences)的同样显子,可以通过下 列两种不同方法来改进电泳分离。1).先用只切割某一模板的内切酶进行酶切,而后 电泳纯化完整的PCR产物。2).用可使核苷酸序列不同的扩增产物分开的电泳系统。下 一个部份将讨论此类系统中的变性甲酰胺梯度凝胶系统。采用方法一时,必须事先了 解在不同PCR产物中的内切酶位点。

杂合体的直接测序

当两个等位基因由于单一位点突变而产生差异时,用一个PCR引物直接进行测 序,能找出杂合位点。但是,带有几个点突变或短片段的插入/缺失的等位模板用PC R引物之一来直接测序,将产生复合序列带(compound sequencing ladders)。有四种 方法可以确定几种点突在型并从杂合体中获得单个等位基因的序列:1).克隆分离不同 的模板;2).在测序之前,利用模板之间核苷酸序列的差异,用电泳技术分离不同的模 板;3).在测序反应中只启动一个等位基因;4).只扩增一个等位基因。

测序模板的制备

与PCR产物的直接测序有关的一些问题是变性后由于扩增片段的两条链可以迅速 结合起来,从而阻止了测序引物与它的互补序列退火,或阻止了引物──模板复合物 的延伸。在测序反应中,模板链重新结合使一小部份模析骖与测序从而弱化最终的测 序条带。为减少此问题,可用改进的标准双链DNA测序法或用PCR制备单链模板。

双链DNA模板

有两种不同方法用来制备测序用的模板,目前都已用来测定共价闭环双链质粒模 板的序列。用这些方法来进行PCR产物的测序通常是较困骓的,因为短的线性模板比 团环质粒的双链更易于重新结合。在这两种方法中,PCR片段可以由凝胶电胶或在电 泳前先进行旋转透析(Spin-dialysis)纯化。

1.在室温下,模板先在0.2M NaOH中变性5分钟,冰冻,加入0.4倍的5M醋酸铵 (pH7.5)来中和反应。立即用四体积的无水乙醇沉淀DNA。在合适的退火温度下,加入 测序缓冲引物。

2.在95℃下保温5分钟来变性模板,冰浴(或在干冰乙醇中)快速冷却离心管,以 减少链的重新结合。加入测序引物并使反应达到合适的温度。测序引物在变性前或后 加入都合适。

单链DNA模板

使用单链模板可以避免测序中链的重新结合。单链模板可以从双链DNA模板经链 分离凝胶中制备,或用PCR反应制备。大于500bp的单链DNA片段,可从琼脂糖凝胶中 分离笪到,但它不适合于更短的单链。制备单链DNA的另一种不同方法是在PCR反应中 使用一个生物素标记的引物,变性后的PCR产物经过一个亲合素柱而使两条链得到分 离,只有生物素标记的链才可结合到柱上。然而,最简单的方法是用改进的PCR方 法,用此方法制备既定的单链DNA。在这个反应中(不对称PCR,asymmetric PCR),在 开始的20-25个循环中,两个比率不对称的扩增引物产生出双链DNA,当限量的那个引 物耗光后,随后的5-10个循环就产生出ssDNA。单链DNA在约在25个循环后开始出现, 这时限量的引物也几乎耗尽。经过一个短暂快速上升后,ssDNA就开始如预期的那样 呈线性积累,这时反应中仅有一个引物存在。各种比率的引物都以这种形式产生 ssDNA。一般对100μlPCR反应体系而言,引物比率为50pmo:0.5pmol,经过30个循环 后,大约可产生1-3pmol的ssDNA。ssDNA的产量可用下列几种方法来估计:a)。在PCR 反应中,除了加入正常数量的dDNA外,还加入32P-dNTP。取10%的反应产物在薄的3% NuSieve+1%普通琼脂糖凝胶中电泳,干燥并与胶片一起曝光。b).取5%的反应物来走 胶,转移到膜上,并用与ssDNA互补的寡核苷酸为探针杂交。ssDNA不能用EB染色来定 量,因为ssDNA有形成二级结构的趋势且染料的插入在模板中是随机的。使用不对称 引物比例的扩增效率比两种引物均过量80-90%)的扩增效率低(70%)。在实验中,这可 通过增加PCR循环的次数来弥补。若不对称的PCR反应不能产生足够数量的ssDNA,可 以试一试不同的引物比率;b).再加5-10个PCR循环;c).在最后五个循环中多加Tab聚合 酶(2U);d).试一下相反的不对称引物比率。有时,相反的不对称引物比率可能给出不 同产量的ssDNA。制备出的单链DNA用限量的那个PCR引物或用一个内引物来测序,并 应用常规方法进行掺入测序(incorporation sequencing)或标记引物测序。制备出的 ssDNA链可能有一个不连续的5'-末端,但可能在靠近3'-末端不同位点处被切去,这 是由于延伸过程中终止过早所产生的。然而,对于测序反应中所使用的任何一种引 物,只有完整的ssDNA可以用作测序模板。

最近还报道了另一种方法制备单链核酸模板进行直接测序。这种方法包括在一个 PCR引物上加入噬菌体的启动子,转录出该PCR产物的RNA拷贝,再用反转录酶不测 序。但由于扩增反应后附加了一个酶促反应步骤和限于用反转录酶作为测序酶,这种 方法的应用受到很大的限制。

用不耐热DNA聚合酶进行PCR产物的测序

一些不耐热DNA聚合酶已经用来直接测序体外扩增的DNA。使用Klenow聚合酶,修 饰T7DNA聚合酶(测序酶)及反转录酶来测序。

用Taq聚合酶进行PCR产物的测序

Tab聚合酶除了用作PCR扩增外,它还是DNA测序的理想的酶。Tab聚合酶具有高度 的延伸能力(processivity),较高的掺入速率,并可用一些核酶类似物如7-Deaza-2' -脱氧鸟苷-5'-三磷酸来解决DNA测序中的压缩问题。除了这些与T7DNA聚合酶相同的 性质外,它有较高的热稳定性,使反应温度可达55-70℃,这可使大量的二级结构解 体。可是,对于dNTPs而言,它有一个相对高的Km值(≈10-20μM)并缺乏3'-外切酶活 性。当dNTP浓度低于1μM时,它将产生错配和不正确的终止。琼脂和琼脂糖中都有 Tab聚合酶的抑制物,但这些可通过增加测序反应中Tab聚合酶的量(2U-10U)得到部分 解决。当测定克隆插入子的PCR产物序列时时,由噬菌体液裂解制备的靶基因中并不 含有从平板溶解出来的抑制物。

对带有强二级结构的DNA进行测序

带有强二级结构的DNA测序可能产生两个问题:1).由于Tab聚合酶不能完全延伸的 模板频率很高,因而降低了PCR的效率,2.).在测序反应中,压缩被测DNA序列的长 度。

研究结果表明:在PCR中使用Tab聚合酶(50-70℃)的高反应温度足够解决大部份短 的二级结构。但强的二级结构会产生强烈的抑制作用。这些只能通过加入与dGTP比例 事适的碱基类似物c7dGTP后,才可解决。同样的碱基类似物也可用在测序反应中,来 解决压缩问题(compression problem)。Tab聚合酶可以有效地掺入c7dGTP,但不能用 次黄嘌吟核苷作为碱基类似物。同样的碱基类似物也可用在测序反应中,来解决压缩 问题(COMPRESSION)。Tab聚合酶可以有效地掺入c7dGTP,但不能用次黄嘌呤核苷作 为碱基类似物。

PCR扩增DNA测序中涉及到的错误

在原始靶基因序列和由它扩增出的PCR产物之间可能有两种不一致情况:1).由点 突变引起的差异;2).由体外重组的等位基因引起的差异。点突变引起的差异是由于 每”个循环中每个核苷酸大约有2×10-4几率发生错误掺入。经过30个循环扩增后,每 个PCR产物平均在每400-4000个碱基对内存有差异。这个错误掺入的几率有时比 Klenow聚合酶(8×10-5)更高。体外重组产生的等位基因(shuffle clone)j是镶嵌PCR 产物,这可能是在以后的循环中由部分延伸的PCR产物造成的,因为它可作为另一个 等位基因模板的引物。由于酶量不足以用来延伸所有的模板,使得在以后的反应循环 中主要积累这些等位基因。除非杂合体中的两个等位基因在其PCR引物上有几个不同 位点的差异,这些人工产物进不能检测出来的。

当用PCR产物来克隆、测序并从一组相同克隆子序列(consensus sequence)推断 出各个等位基因的序列时,就必须考虑到这两种不同类型的错误。相比之下,当PCR 产物用来直接测序时,由错误掺入或镶嵌而产生的错误PCR产物并不影响PCR测序。在 各个PCR产物中由点突变引起的差异与相同序列比是检测不出的。既使这个突变(如错 误掺入)在以一个DNA分子为模板的如单个精子DNA扩增反应的第一个循环中产生,它 也仅占该位点正常核苷酸的25%。对起始DNA模板不止一个的扩增反应,在任一位点上 含有一个错配核苷酸的PCR产物的频率低到检测不出的程度。虽然目前并不很了解镶 嵌基因形成的条件,但相信这些等位基因是在反应最后几个循环中积累起来的,因为 这时酶量可能不足以用来延伸所有的模板。除非序列中有非常强烈的二级结构,在某 一特定位点上使链延伸终止,结果产生一个单一的人工基因。镶嵌基因不会影响正常 序列的测定。

测序反应的自动化

DNA测序的可重复性使它适合于完全或部分自动化。已有用常规的放射性标记引 物,或荧光终止标记或测序引物进行自动化测序的一系列仪器。但是,这些仪器仅使 分析的前半部分自动化,凝胶电泳、读带和将序列输到计算机中用后半部分自动化来 补足。前半部有两个阶段:模板的制备测序模反应,可很容易地进行自动化反应。用 Tab酶进行PCR扩增和直接测序是制备测序模板和测序反应终产物的最有效方法。一旦 使用自动进样器,就可进行自动化反应,仅电泳分析由人工进行。这对许多一直使用 人工电泳测序反应的实验室来说,都将从中受益。

4.3 PCR产物克隆方法

平端连接

通常情况下,PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接,但其连接效 率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性,能 在两6条DNA链的3'末端加上一个多余的碱基,使合成的PCR产物成为 3'突出一个碱基的DNA分子。这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR 产物的效率通过较高,。在采用大量T4DNA连接酶并配以5—10u T4 RNA连接酶时,可显著提高其连接效率。对于较短PCR产物,用PUS19 的HincⅡ位点进行克隆,以X-gal和IPTG筛选,常可得到足量重组 子。另一种提高克隆效率的途径是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶 消去3'末端突出碱基将PCR产物变成平端DNA,然后再用平端连接法 克隆PCR产物。

粘端连接

引物中设计入限制酶位点:由于PCR引物的5'末端可以增加一些非 互补碱基,因此可以在两引物的5'末端设计单限制酶或双限制酶切 位点。这样得到的PCR产物用限制酶消化产生粘性末端,即可与有互 补粘端的载体DNA重组。这种克隆方法效率较高,且当两引物中设计 不同酶切位点时,可有效地定向克隆PCR产物。其缺点是需要加长 PCR引物,除限制酶识别序列外,还需要在其5'端多合成3—4个碱基 以利于限制性内切酶与PCR产物末端的稳定结合。即使如此,其酶切 效率也不够高。其中尤以NotI、XhoI和XbaI等较为难切。采用突变 PCR方法可克服上述缺点。该方法是通过在两PCR引物序列中改变1至 数个核苷酸创造出一个限制性内切酶位点。鉴于PCR引物的3'末端序 列的互补性是PCR成功的关键,在PCR引物的中部或近5'端改变1个或 几个碱基对PCR扩增效果影响不大。这种方法不需要增加PCR引物的 长度,而且酶切效果优于5'加端法。对于特定DNA片段的克隆,此方 法较为经济、实用。但对于基因诊断PCR产物的克隆,似乎5'加端法 更为适宜。

T4DNA聚合回切产生粘端

如PCR两引物的5'末端是A或T,则可在 其5'端分别加上CG和CCGG。用此二引物扩增的PCR产物在dATP和dTTP 存在的情况下,用T4DNA聚合酶进行处理,则T4DNA聚合酶因具有3'→ 5'外切酶活性而消去3'末端的G和C,产生AccI和XmaI粘性末端(图1)。 此DNA片段直接与用AccI和XmaI切开的载体进行连接。这种方法只需 在PCR引物的5'端加2—4个碱基,但其可选择的限制酶类有限。

T-vector法

TaqDNA聚合酶能在平端双链DNA的3'末端加一个碱 基,所加碱基几乎全是腺苷。据此,Marchuk等人采用3'端突出一个 胸苷的质粒DNA来克隆PCR产物,其克隆效率比平端的连接至少高出 100倍。他们用EcoRV将pBluescript切成平端,然后在2mmol/LdTTP 存在下,用TaqDNA聚合酶催化pBluescript的两个3'末端各加一处胸 苷。因为在4种dNTP都存在时,Taq聚合酶选择性参入dATP,而当仅 一种dNTP存在时,它只能参入该种碱基。因此,在只加入ddTTP时, 用TaqDNA聚合酶可使平端载体DNA转变成3'末端突出一个胸苷的T尾 载体,称为T-vector。用这种T-vectorsk可以较有效地直接克隆 PCR产物。Hotton等人也报道了另一种制备T-vector的方法。他们 使用脱氧核苷酸末端转移酶在切成平端的载体DNA的3'末端加上一个 胸苷。由于末端转移酶可以催化多个碱基(ddTTP)作为底物,使平 端载体DNA分子的两个3'末端各加上一个T。用这种方法制备的T-vector 的不同之处在于前者3'末端不能与待克隆PCR产物的5'末端连接,仅 5'末端可与PCR产物的3'末端形成磷酸二脂键。

共环消解法:最近,Jung等人报道了一种有效的PCR产物克隆方 法。用磷酸化的PCR引物扩增得到的PCR产物,先用T4DNA连接酶催化 连接反应,使5'端带有限制酶切位点的扩增DNA片段连接成共环结 构。然后再用相应的限制酶进行消化,产生粘端DNA片段。对于对称 性限制酶位点,只需在引蛾的5'末端加上一关识别序列,因为在串 接成共环后能恢复限制酶切位点难于切开的缺点,且可用于双限制 酶切位点的设计,只不过有PCR产物共环化后,仅约1/4的限制酶切 点得以恢复。故此法较适用于单限制酶位点的克隆。

无连接酶亚克隆法(A)

无连接酶克隆法(ligase-free subcloning,LFS)是利用引物5’ 末端附加碱基修饰法,修饰碱基不是酶切位点,而是与某一质粒两 端分别互补的碱基。两引物的3’端约20—25个核苷酸分别与待扩增 DNA两翼互补,5’端各有约24个核苷酸分别与线性化质粒的3’端相 同的附加序列。由于线性化质粒的3’端序列各不相同,PCR片段可 以通过选择各引物的合适5’附加序列与引物3’端定向杂交。

由此物a和b产生的两端有附加序列的PCR产物与未反应引物分离后, 分别加入两只含有线性化质粒的反应管中进行第二次PCR。第1管中 用引物a和c,引物a即为第一PCR扩增的上游引物a,引物c为下游引 物,与紧邻5’端附加序列内测的质粒(+)链互补。同样,第2管的 引物为b和d,引物b与第一次PCR扩增的下游引物b相同,引物d为上 游引物,与紧邻5’附加序列内侧的质粒(-)链互补。

第二次PCR的第一循环中,PCR产物与质粒均变性与复性。除自身复 性产物(这种复性产物不被扩增)外,PCR产物与质粒可通过各自3’ 端互补序列杂交成部分异源双链,延伸时,重叠的3’端互为此物沿 各自互补链延伸,结果可产生PCR片段与线性质粒的“连接”。然后 两管中PCR扩增各进行15—20个循环。这便可产生大量一端管1)或 另一端连接有PCR插入片段的质粒。

第二次PCR后,将第1管与第2管反应液混合,用碱变性双链,中和后 稀释变性的DNA。反应管中的单链DNA可以复性或几种不同的产物, 除各自本身复性产物外,管1产物ssDNA与管2中ssDNA可形成部分异 源双链DNA,并各自有一较长的5’或3’悬端,这种长的5’或3’悬 端相互互补,在低DNA浓度时可复性产生环化DNA。

尽管这种环化的DNA有两个缺口,但它们可以直接用来转化受体大肠 直杆菌。一旦进入体内,两个缺口便共价连接,修复的质粒即可复 制,下面以从λ噬菌体DNA中扩增-500bp片段,并克隆入pGem4Z载体 中为例说明LFS法。

这种方法同样适于复杂基因组中基因片段的克隆。需注意的是第一 次PCR时两引物的5’附加序列不应太短以免影响第二次PCR时异源双 链的形成,以24个核苷酸较为合适。扩增时若形成,引物二聚体, 一定要去除,否则会严重影响转化率。用LFS法已成功地克隆了长达 1.7kb的基因片段。这种方法的优点是:①可用于常规方法无法进行 亚克隆的片段;②适于任何PCR产物和任何质粒;③可亚克隆特殊目 的(如含点突变、缺失或插入等)片段;④在某些情况下,对已构 建了启动子或增强子等序列的载体,可使待表达片段插入定向合适 位置;⑤较快,可在1d内完成,较常规方法可靠,不需DNA连接酶。

DNA克隆是分子生物学的重要内容。特定基因的克隆常因两端缺乏合 适限制酶切点而受因,cDNA的克隆通常也效率不高、筛选因难。采 用PCR技术行DNA和cDNA的克隆,则可大大缩短克隆时间,比之全基 因合成更为经济和方便,因而愈来愈受重视。用PCR方法进行传染性 疾病和遗传性疾病的诊断常遇到产物的异性问题和分型问题,采用 产物克隆和测序方法,比之寡核苷酸探针杂交方法更为准确。随着 PCR技术的不断发展和推广,新的PCR产物的克隆方法也将不断出现。

5 参考资料

  1. ^ [1] 张新宇,高燕宁. "PCR引物设计及软件使用技巧". 中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所

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  • 猪猪
    2012/7/19 8:32:18 | #1
    丁香通中有PCR专题介绍,链接地址如下http://www.biomart.cn/article/9/26/3_index.htm
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