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H7N9禽流感病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)

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1 拼音

H7N9qín liú gǎn bìng dú hé suān jiǎn cè shì jì hé (PCR-yíng guāng tàn zhēn fǎ )

2 英文参考

Detection Kit for Avian Influenza Virus Subtype H7N9 RNA (PCR-Fluorescence Probing)

3 产品名称

通用名称:H7N9禽流感病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)

英文名称:Detection Kit for Avian Influenza Virus Subtype H7N9 RNA (PCR-Fluorescence Probing)

4 包装规格

大包装,48反应/盒

5 预期用途

流感病毒可分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。其中,甲型流感依据流感病毒血凝素蛋白(HA)的不同可分为1-16种亚型,根据病毒神经氨酸酶蛋白(NA)的不同可分为1-9种亚型,HA不同亚型可以与NA的不同亚型相互组合形成不同的流感病毒。而禽类特别是水禽是所有这些流感病毒的自然宿主,H7N9禽流感病毒是其中的一种。H7N9流感病毒既可以感染禽类,也可以感染人。人感染H7N9禽流感会出现严重肺炎症状包括发烧咳嗽呼吸困难等。

本试剂盒适用于检测呼吸样本血清、肺组织等样本中H7N9禽流感病毒RNA,可用于该病毒感染的实验室诊断和宿主动物的监控。检测结果仅供研究,不用于临床诊断。

6 检验原理

本试剂盒基于实时荧光PCR技术,分别选取H7N9禽流感病毒的HA基因和NA基因保守区作为扩增靶区域,设计特异性引物探针,通过一步法实时荧光PCR体系扩增对H7N9禽流感病毒进行定性检测。反应体系中除特异性引物和特异性荧光探针外,还配以对应的PCR反应Buffer、逆转录酶、Hot-StartTaq酶、核苷酸单体(dNTPs)、Mg2+等成分,可实现对H7N9禽流感病毒核酸灵敏特异地检测。

7 主要组成成分

组分名称

规格

数量

PCR检测试剂

AIV H7 PCR反应液A

816µl/管

1

AIV N9 PCR反应液A

816µl/管

1

AIV H7N9 PCR反应液B

288µl/管

1

AIV H7N9内标溶液

240µl/管

1

质控品

阴性质控品

200µl/管

1

AIV H7N9阳性质控品

200µl/管

1

8 储存条件及有效期

保存于-20±5℃,反复冻融次数<5次,有效期9个月。

9 适用仪器

ABI 7500、ABI 7300、LightCycler480等荧光定量PCR仪。

10 样本要求

1 适用样本类型:呼吸道样本、血清、肺组织。

2 样品采集、保存与运送。

标本采集、保存、运送请遵循《人感染H7N9禽流感病毒标本采集及实验室检测策略》。

11 检验方法

1.核酸提取

建议取200µl液态样本进行核酸提取;组织样本可以研磨液进行提取操作。可采用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取试剂盒,请按照试剂盒说明书进行操作;也可选择其他合适的商业化产品。本试剂盒中的内标溶液参与提取过程,若提取试剂盒中未说明内标的使用方法可在每200µl样本中加入4µl内标溶液后进行核酸提取。

本试剂盒中的阴性质控品参与提取,用于对环境进行监控;AIV H7N9阳性质控品不参与提取,用于PCR检测试剂的质控。

2.PCR扩增(ABI 7500仪器操作为例,ABI 7300、LC480等仪器参照此操作及仪器操作手册)

2.1分别配制AIV H7 RT-PCR反应体系和AIV N9 RT-PCR反应体系

2.1.1AIV H7 RT-PCR反应体系配制

取适量PCR反应管(按AIV H7反应体系计算);每管加入AIV H7 PCR反应液A 17µl、AIV H7N9 PCR反应液B 3µl(也可按照单个反应的用量,计算PCR反应液A、B各自所需总量,两者混匀后分装20µl于单个PCR反应管中)。

2.1.2AIV N9 RT-PCR反应体系配制

取适量PCR反应管(按AIV N9反应体系计算);每管加入AIV N9 PCR反应液A 17µl、AIV H7N9 PCR反应液B 3µl(也可按照单个反应的用量,计算PCR反应液A、B各自所需总量,两者混匀后分装20µl于单个PCR反应管中)。

2.2于上述PCR反应管中分别加入处理后的阴性质控品、AIV H7N9阳性质控品、待测标本核酸各5µl,8,000rpm离心数秒,放入PCR扩增仪。

2.3探针检测模式设置为:Reporter Dye1:FAM,QuencherDye:NONE,Reporter Dye2:Vic,Quencher Dye2:NONE, Passive Reference:NONE。反应条件设置为:50℃ 15min,1个循环;95℃ 15分钟,1个循环;94℃ 15秒→58℃ 45秒(收集荧光),45个循环。保存文件,运行。

3.结果分析

3.1 反应结束后保存检测数据文件。

3.2 分析条件设置:根据分析后图像调节Baseline的start值、stop值以及Threshold的Value值(用户可根据实际情况自行调整,Start值可以在3~15、End值可设在5~20,调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线),点击Analysis自动获得分析结果,在Report界面察看结果。

12 质量控制

阴性质控品:FAM检测通路扩增曲线无对数增长期,VIC检测通路扩增曲线为明显对数增长期;

阳性质控品:FAM检测通路扩增曲线有明显对数增长期,且FAM检测通道扩增曲线 Ct值≤32;

以上要求需在同一次实验中同时满足,否则,本次实验无效,需重新进行。

13 结果判定

1.如果检测样品的AIV H7及N9 RT-PCR反应体系FAM检测通道均无扩增曲线或Ct值>40,且在VIC检测通道均有对数增长期,可判样品为H7N9禽流感病毒阴性;

2.如果检测样品的AIV H7及N9 RT-PCR反应体系扩增曲线在FAM,VIC检测通道均有对数增长期且FAM检测通道Ct值≤40;可判样品为H7N9禽流感病毒阳性;

3.如果检测样品的AIV H7或N9 RT-PCR反应体系仅其中之一的扩增曲线满足判为阳性的要求,则需重复检测;若重复检测结果为H7及N9均阳性,则判H7N9禽流感病毒阳性;若重复检测结果仍为H7(或N9)阳性,则只能判禽流感病毒H7(或N9)亚型阳性,并建议以其他方法做进一步确认

14 检测方法的局限性

1.样本检测结果与样本收集、处理、运送及保存质量有关。

2.样本处理时没有控制好交叉污染,可能出现假阳性结果。

3.病毒在流行过程中的基因突变则也可能导致假阴性结果。

4.由于不同提取方法的原理不同,采用不同核酸提取试剂进行样本处理时核酸提取效率存在一定差异,本试剂盒推荐使用本公司生产的核酸提取试剂盒(离心柱法),用户可根据具体要求进行选择确认。

5.本检测结果仅供临床参考,如需确诊病例请结合临床症状及其他检测手段.

15 产品性能指标

根据产品分析性能评估结果,本试剂盒的分析灵敏度为1.0×103copies/ml。与感染部位相同或感染症状相似的其他病原体甲型流感病毒H3亚型、甲型流感病毒H1亚型、乙型流感病毒、副流感病毒、禽流感H5亚型病毒、禽流感H9亚型病毒等)无交叉反应。

16 注意事项

1.实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范,实验人员必须进行专业培训,实验过程严格分区进行(试剂准备区、标本制备区、扩增和产物分析区),所用消耗品应灭菌后一次性使用,实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备,各区各阶段用品不能交叉使用;

2.为试剂和标本准备阶段提供生物安全柜,实验过程中穿工作服,带一次性手套,使用自卸管移液器;

3.试剂使用前要完全解冻,8,000rpm离心数秒后使用;

4.标本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒剂的容器,并与废弃物一起灭菌后方可丢弃;

5.实验完毕用10%次氯酸或75%酒精紫外线灯处理工作台和移液器;

6.本试剂盒内阳性质控品应视为具有传染性物质,操作和处理均需符合相关法规要求:卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》。

17 生产企业

企业名称:中山大学达安基因股份有限公司

生产地址:广州市高新技术产业开发区香山路19号;广州市高新技术产业开发区荔枝山路6号

邮   编:510665

电   话:020-32290789、8008304008

传   真:020-32068820

网   址:http://www.daangene.com

18 医疗器械生产企业许可证编号

粤食药监械生产许20040999号

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开放分类:医疗器械
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  • 评论总管
    2020/11/27 2:30:44 | #0
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本页最后修订于 2013年5月23日 星期四 14:28:50 (GMT+08:00)
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