1 拼音
GBZ/T 240.21—2011 huà xué pǐn dú lǐ xué píng jià chéng xù hé shì yàn fāng fǎ dì 21bù fēn :zhì jī shì yàn
2 英文参考
Procedures and tests for toxicological evaluations of chemicals—Part 21:Teratogenicity test
ICS 13.100
C 52
中华人民共和国国家职业卫生标准 GBZ/T 240.21—2011《化学品毒理学评价程序和试验方法 第21部分:致畸试验》(Procedures and tests for toxicological evaluations of chemicals—Part 21:Teratogenicity test)由中华人民共和国卫生部于2011年08月19日发布,自2012年03月01日起实施。
3 前言
根据《中华人民共和国职业病防治法》制定本部分。GBZ/T 240《化学品毒理学评价程序和试验方法》现分为以下四十四部分:
——第1部分:总则;
——第2部分:急性经口毒性试验;
——第3部分:急性经皮毒性试验;
——第4部分:急性吸入毒性试验;
——第5部分:急性眼刺激性/腐蚀性试验;
——第6部分:急性皮肤刺激性/腐蚀性试验;
——第7部分:皮肤致敏试验;
——第8部分:鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验;
——第9部分:体外哺乳动物细胞染色体畸变试验;
——第10部分:体外哺乳动物细胞基因突变试验;
——第11部分:体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验;
——第12部分:体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验;
——第13部分:哺乳动物精原细胞/初级精母细胞染色体畸变试验;
——第14部分:啮齿类动物显性致死试验;
——第15部分:亚急性经口毒性试验;
——第16部分:亚急性经皮毒性试验;
——第17部分:亚急性吸入毒性试验;
——第18部分:亚慢性经口毒性试验;
——第19部分:亚慢性经皮毒性试验;
——第20部分:亚慢性吸入毒性试验;
——第21部分:致畸试验;
——第22部分:两代繁殖毒性试验;
——第23部分:迟发性神经毒性试验;
——第24部分:慢性经口毒性试验;
——第25部分:慢性经皮毒性试验;
——第26部分:慢性吸入毒性试验;
——第27部分:致癌试验;
——第28部分:慢性毒性/致癌性联合试验;
——第29部分:毒物代谢动力学试验;
——第30部分:皮肤变态反应试验-局部淋巴结法;
——第31部分:大肠杆菌回复突变试验;
——第32部分:酵母菌基因突变试验;
——第33部分:果蝇伴性隐性致死试验;
——第34部分:枯草杆菌基因重组试验;
——第35部分:体外哺乳动物细胞程序外DNA合成(UDS)试验;
——第36部分:体内哺乳动物外周血细胞微核试验;
——第37部分:体外哺乳动物细胞姊妹染色单体交换;
——第38部分:体内哺乳动物骨髓细胞姊妹染色体交换;
——第39部分:精子畸形试验;
——第40部分:繁殖/生长发育毒性筛选试验;
——第41部分:亚急性毒性合并繁殖/发育毒性筛选试验;
——第42部分:一代繁殖试验;
——第43部分:神经毒性筛选组合试验;
——第44部分:免疫毒性试验。
本部分为GBZ/T 240的第21部分。
本部分由卫生部职业卫生标准专业委员会提出。本部分由中华人民共和国卫生部批准。
本部分起草单位:上海市疾病预防控制中心、中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所。本部分主要起草人:肖萍、孙金秀、薛春霄、林铮。
化学品毒理学评价程序和试验方法
第21部分:致畸试验
4 1 范围
GBZ/T 240的本部分规定了动物致畸试验的目的、试验概述、试验方法、数据处理与结果评价、评价报告和结果解释。
本部分适用于检测化学品的致畸性。
5 2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GBZ/T 224 职业卫生名词术语
GBZ/T 240.1 化学品毒理学评价程序和试验方法 第1部分:总则
6 3 术语和定义
GBZ/T 240.1界定的术语和定义适用于本文件。
3.1
母体毒性 maternal toxicity
引起亲代雌性妊娠动物直接或间接的健康损害效应。
7 4 试验目的
检测妊娠动物接触化学品后引起胎仔畸形的可能性。
8 5 试验概述
试验应设多个剂量组。选择处于胚胎发育器官形成期的妊娠动物进行染毒,并在胎仔出生前将妊娠动物处死,取出子宫,检查其吸收胎、死胎、活胎及胎仔的骨骼和内脏畸形的情况。
9 6 试验方法
9.1 6.1 实验动物
首选健康、刚进入性成熟期、未经交配的雌性大鼠或家兔,按雌雄动物比例2:1或1:1交配。试验前的适应期至少为3d。
为了获得足够的胎仔数,正确地评价受试样品致畸的可能性,对于大鼠,每个剂量组和对照组至少应有15只妊娠动物,家兔至少为12只。
9.2 6.2 剂量设计
试验至少设3个剂量组、1个阴性对照组,必要时可设1个阳性对照组。阳性对照物可选用环磷酰胺、阿司匹林或维生素A。对照组动物除了不给予受试样品外,其他处理应与剂量组完全相同。试验可以先采用预试验,了解受试样品引起胚胎或胎仔死亡的剂量。在受试样品理化和生物特性允许的条件下,高剂量组剂量应使母体出现明显的毒性反应,如轻微的体重下降,但不能引起超过10%的母体死亡;低剂量应不引起动物任何可观察到的毒性反应;在低剂量和高剂量之间可按几何级数设置中间剂量。如果受试样品的毒性较低,1000 mg/kg体重的剂量对胚胎无明显毒性或致畸作用,则可以采用限量试验,即试验不需要设其他剂量组。若高剂量的预试验对母体确有一定的毒性作用,但对胚胎无不良影响,也可以采用限量试验。
9.3 6.3 试验步骤
9.3.1 6.3.1 染毒途径
通常为经口灌胃,也可以采用其他与人的接触方式相同的给样方式。每天的染毒应在同一时间进行。如果受试样品是通过灌胃染毒的,应按每只母体动物的体重来确定每日的染毒量。
9.3.2 6.3.2 交配及染毒期限
雄性和雌性动物按1:1或1:2的比例合笼交配。每天早晨应对雌性动物进行检查,查看阴道中是否有精子或阴栓。将检查到精子或阴栓的当天计为雌性动物妊娠的第0天。将妊娠动物随机分组后,于胚胎器官的形成期开始染毒(大鼠为孕后6 d~15 d,家兔为孕后6 d~18 d),每天一次。
9.3.3 6.3.3 观察期限及指标
6.3.3.1 每日至少对妊娠动物进行一次仔细的临床观察。发现虚弱或濒死的动物,应进行隔离或人道处死,对死亡的动物应进行尸检。如母体有流产、早产症状者也应处死并作大体检查。
6.3.3.2 每日称取妊娠动物体重,每周记录摄食量,并观察其临床症状,包括皮肤、毛、眼睛、黏膜、呼吸系统、循环系统、神经系统、四肢活动和行为方式的改变。
6.3.3.3 及时记录任何毒性反应,包括出现的时间、程度和持续的时间。
9.3.4 6.3.4 观察指标
分娩前一天处死妊娠动物(大鼠为妊娠第20天,小鼠为妊娠第18天,家兔为妊娠后第29天),立即进行解剖检查。
9.3.4.1 6.3.4.1 子宫观察
取出子宫,分别称取子宫、胎盘和活胎的重量,记着床数、活胎数、死胎数及吸收胎数。
9.3.4.2 6.3.4.2 外观检查
逐一记录活胎仔的身长和尾长。检查外观有无异常,如头部:无脑、脑膨出、露脑、头盖裂、脑积水、小头、颜面裂、小眼、无眼、眼球突出、无耳、小耳、耳位低、无颚、小颚、下颚、兔唇和下颌裂;躯干部:胸骨裂、胸部裂、脊椎裂、脊椎侧弯、脊椎前弯、脊椎后弯、脐疝、尿道下裂、无肛门、短尾、卷尾、无尾和腹裂;四肢:多肢、无肢、短肢、半肢、多趾、无趾、并趾、短趾和缺趾。胎鼠畸形检查方法见附录A。
9.3.4.3 6.3.4.3 骨骼检查
将每窝1/2的胎仔放入茜素红液(配制方法见附录B的B.1)中染色,进行骨骼检查。测量囟门大小,矢状缝的宽度,头顶间骨及后头骨缺损情况,然后检查脊柱骨的数目、融合、纵裂、部分裂开、骨化中心数、发育不全、缩窄、脱离和形状;骨盆的弓数目、骨化中心数、形状异常、融合、裂开、缩窄和脱离;四肢骨的形状和数目;腕骨的骨化中心数;掌骨、趾骨的形状;肋骨的数目、形状、融合、分叉、缺损和发育不全;胸骨的形状、完全缺失、胸骨节融合、裂开、形状异常和发育不良等情况。
9.3.4.4 6.3.4.4 内脏检查
将每窝另一半的胎仔放人Bouin's液(配制方法见附录B的B.2)中,固定两周后作脏器和软组织检查。检查有无异常,如头部:嗅球发育不良、侧脑室扩张、第三脑室扩张、角膜缺损等;胸部:右心位、房中隔缺损、室间隔缺损、主动脉弓、食道闭锁、气管狭窄、无肺、多肺、肺叶融合、膈疝、气管食管瘘和内脏异位等;腹部:肝分叶异常、肾上腺缺失、多囊肾、膀胱缺失、睾丸缺失、阴睾、卵巢缺失、卵巢异位、子宫缺失、子宫发育不全、肾积水、肾缺失和输尿管积水等。对于家兔每个胎仔都应解剖进行脏器检查和骨骼检查。
10 7 数据处理与结果评价
10.1 7.1 数据处理
数据可以用统一的表格进行统计,表中应显示每组的实验动物数、平均体重、受孕动物数、黄体数、着床数、吸收胎数、活胎数、死胎数及其百分率、胎仔的情况(体重、胎盘重、体长、尾长)、畸胎的类型(包括外观、骨骼和内脏)、数目及百分率。
数据可采用任何一种适当的统计方法进行处理。应将各剂量组的指标相应地与对照组进行显著性检验。其中,以畸胎率最为重要,主要有以下两种:
注:凡每一活胎出现一种以上畸形时,均作一个畸胎计。
当出现的畸胎是以某一种或某几种畸形为主时,就应按畸形种类单独计算该畸形率。
致畸指数=雌性动物LD50/最小致畸剂量
10.2 7.2 结果评价
7.2.1 评价时应结合所用动物品系的历史性的资料进行,包括自发畸变种类和频率。
7.2.2 如果某剂量组的总畸胎率或某单项畸胎率与对照组相比明显增高,且差异有显著性,可表明该剂量有致畸作用。
7.2.3 试验结果应能得出受试样品是否有母体或胚胎毒性、致畸性,最好能得出无致畸剂量和最小致畸剂量。
11 8 评价报告
除GBZ/T 240.1规定的一般项目外,评价报告还应包括以下内容:
a) 给予受试样品的方法和期限;
b) 孕鼠体重增长和妊娠情况;
c) 受孕动物数、黄体数、着床数、吸收胎数、活胎数、死胎数及其百分率;
d) 胎仔的情况(体重、胎盘重、体长、尾长)、畸胎的类型(包括外观、骨骼和内脏)、数目及百分率。
12 9 结果解释
解释致畸试验结果时,应注意种属的差异。试验结果从动物外推到人存在着一定的局限性。
13 附录A(资料性附录)胎鼠畸形检查方法
13.1 A.1 胎鼠外观检查
对每只胎鼠先经肉眼检查,如果肉眼不能确定某种畸形时,将胎鼠放在解剖显微镜下迸一步确定并照相,胎鼠的检查顺序如下。
13.2 A.2 胎鼠的头部检查
有无露脑(无头盖骨),脑膜膨出,头部大小(大头可能脑积水、小头为头部发育不良)。眼睛的有无,眼所在部位,大小(小眼或大眼),突眼或开眼等。两耳、鼻和嘴外表是否正常和对称,上下颌有无唇裂。
13.3 A.3 四肢的检查
四肢有无多趾(指)、并趾、少趾、无趾、足内外翻、短肢等畸形。
13.4 A.4 躯干的检查
有无脐疝、腹裂(内脏膨出),脊髓膨出、脊柱裂、脊柱侧突等。
13.5 A.5 尾部检查
有无短尾、卷尾、无尾和尾分叉等。
13.6 A.6 标本的制作
将每窝1/2胎鼠放人Bouin's液固定,作为内脏检查,另1/2放入95%酒精中固定作为骨骼检查。
13.7 A.7 骨骼标本的制备
胎鼠放入1% KOH溶液中软化至能很清楚地看见骨骼为止,必要时中间可更换1次KOH溶液。
13.8 A.8 骨骼染色
将骨骼标本放入茜素红应用液中染色16 h,直至全部骨骼染成紫红色为止,中间可更换一次染液。
13.9 A.9 骨骼透明
染好色以后,用自来水冲净标本,倒掉染液,将标本置于50%甘油中脱色3 d~5 d。
13.10 A.10 骨骼检查
A.10.1 头骨检查:颅骨是否完整,有无骨化不全,骨缝的宽窄,枕骨的形状。
胎鼠上枕骨骨化程度的分级标准如下:
——0级:上枕骨成片状或哑铃状,两侧骨化点完全融合,融合处宽度大于两侧的1/3。
——Ⅰ级:上枕骨两侧骨化点相连,相连处宽度小于两侧的1/3。
——Ⅱ级:上枕骨两侧骨化点不相连,但可清楚地见到两个较大的骨化点。
——Ⅲ级:上枕骨两侧的骨化点不相连,仅见小骨化点或仅见一侧骨化点。
——Ⅳ级:无上枕骨骨化点。
A.10.2 胸部骨骼:正常胸骨为6块,畸形时可有骨骼错位及骨化不全,注意观察第2胸骨和第5胸骨。小鼠正常肋骨为13对,观察有无多肋、少肋、肋骨分叉、融合、波状肋等畸形。
A.10.3 四肢骨:检查骨化程度、长短粗细、指趾骨的发育状况。
13.11 A.11 胎鼠内脏徒手切片检查
将胎鼠从Bouin's液中取出,自来水冲净。测量每只胎鼠身长及尾长。
13.12 A.12 头部切片
将胎鼠放在蜡板或木板上,第1刀由嘴开始经两耳切开,暴露舌、腭、上唇和下颌,检查舌有无异常,有无腭、唇裂。将头翻过来前背向上,切剩下的切片。第2刀从眼睛前面切下,暴露鼻中隔、鼻窦,记录鼻腔是否通。第3刀平眼切下,暴露脑鼻叶,鼻中隔后区的大部分及鼻咽腔、眼组织、视网膜、玻璃体、晶状体和角膜,检查这些组织结构有无异常。第4刀从眼后切开,暴露大脑半球和侧脑室,并注意有无畸形和扩张。第5刀横切大脑半球,暴露间脑的第Ⅲ脑室、侧脑室、脉络膜等检查这些部位有无异常。
13.13 A.13 内脏切片检查
沿胸腹壁中线和肋下沿水平线各切一刀,暴露胸腔与腹腔内脏,检查各脏器有无异常。
13.14 A.14 统计
应用适当的统计学软件对数据进行分析处理。各组母鼠平均体重,胎鼠体重、身长、尾长,计量资料以均数±标准差(±s)表示,数据采用F检验进行显著性分析。活胎、死胎、畸形、吸收胎等计数资料用百分率表示,数据采用x2检验进行显著性分析。
——活胎率=活胎数/胎鼠数×100%;
——死胎率=死胎数/胎鼠数×100%;
——吸收胎率=吸收胎数/着床数×100%;
——畸形率=畸形仔鼠数/受检胎鼠数×100%;
——孕鼠体重净增长=解剖前体重-受孕第6天体重-含胎子宫重。
14 附录B(资料性附录)茜素红液和Bouin's液配制方法
14.1 B.1 茜素红液配制方法
冰醋酸 5 mL
纯甘油 10 mL
1%水合氯醛 60 mL
临用时用1% KOH稀释成0.1%的应用液。
14.2 B.2 Bouin's液配制方法
苦味酸饱和液 75 mL
甲醛 25 mL
冰醋酸 5 mL
混合使用。