1 拼音
GB/T 33417—2016 guò yǎng huà qīng qì tǐ miè jūn shēng wù zhǐ shì wù jiǎn yàn fāng fǎ
2 英文参考
Test method of biological indicator for hydrogen peroxide vapour sterilization processes
3 基本信息
ICS 11.080
C 50
中华人民共和国国家标准 GB/T 33417—2016《过氧化氢气体灭菌生物指示物检验方法》（Test method of biological indicator for hydrogen peroxide vapour sterilization processes）由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局、中国国家标准化管理委员会于2016年12月30日发布，自2017年07月01日起实施。
4 前言
本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。
本标准由中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会提出并归口。
本标准起草单位：中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所、中国人民解放军疾病预防控制所、中国医学科学院协和医院。
本标准主要起草人：张流波、张剑、姚楚水、张青、王立飞、张玮、王香、王洪敏、史绍毅、王妍彦、邱侠、马玲、朱亭亭。
5 标准正文
过氧化氢气体灭菌生物指示物检验方法
5.1 1 范围
本标准规定了过氧化氢气体灭菌生物指示物的检验方法。
本标准适用于过氧化氢气体灭菌生物指示物的检验。
5.2 2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB 18281.1 医疗保健产品灭菌 生物指示物 第1部分：通则
GB/T 24628 医疗保健产品灭菌 生物与化学指示物 测试设备
消毒技术规范（2002年版） 卫生部
5.3 3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
生物指示物 biological indicator；BI
对指定条件下的特定灭菌程序具有一定抗力，并装在内层包装中可供使用的染菌载体。
3.2
过氧化氢气体灭菌 hydrogen peroxide vapour sterilization
以汽化的过氧化氢作为主要杀灭微生物因子的灭菌方式。
3.3
载体 carrier
试验微生物的支持物。
3.4
存活时间 survival time；ST
测定生物指示物抗力时，受试样本经杀菌因子作用后，全部有菌生长的最长作用时间。
3.5
杀灭时间 killing time；KT
测定生物指示物抗力时，受试样本经杀菌因子作用后，全部无菌生长的最短作用时间。
3.6
D值 D value
杀灭微生物数量达到900/所需要的时间。
3.7
自含式生物指示物 self-contained biological indicator
含有微生物复苏生长所需培养基的生物指示物。
3.8
生物指示物抗力测试仪 biological indicator evaluator resistometer
产生限定条件下灭菌过程中物理变化规定组合，以测量抗力的专用设备。
5.4 4 检验指标与方法
5.4.1 4.1 抗力
5.4.1.1 4.1.1 菌种
用于制作过氧化氢气体灭菌生物指示物的菌株为嗜热脂肪杆菌芽孢（Geobacillusstearothermo philus
ATCC 7953或SSI K31）或被证明具有本标准所要求的同等性能的微生物。
5.4.1.2 4.1.2 菌量
回收菌量大于或等于1×106CFU/片，对于成品的指示物，载体回收的菌量与说明书上的菌量误差在-50%～+300%之间。测定菌量时，应最少测试4个样本，具体检测方法参见附录A。
5.4.1.3 4.1.3 D值
测试时应使用生物指示物抗力测试仪，生物指示物抗力测试仪要求见GB/T 24628。在使用浓度为59%±2%过氧化氢，灭菌舱内作用浓度为2.3 mg/L±0.4 mg/L，作用温度50℃±0.5℃的条件下， D值的要求为0.75 s～8 s。对于成品的生物指示物，测试的D值应在说明书上的D值±20%范围内。应使用下列2种方法进行测试：
a）部分阴性法测试D值，参见附录B；
b）验证法测试D值，将a）测试出的D值和4.1.2的回收菌量的平均数带入式（1）和式（2），计算出ST值和KT值。参见附录C。
ST≥（logN0-2）×D值 ………（1）
KT≤（logN0+4）×D值 ………（2）
式中：
N0——每批生物指示物的同收菌量的平均数。
5.4.2 4.2 载体
按GB 18281.1的要求进行灭菌过程兼容性的测试。
5.4.3 4.3 恢复培养基
4.3.1 恢复培养基应满足下列要求：
a） 有使10 CFU～100 CFU的微生物恢复生长的能力；
b） 有使损伤的微生物恢复生长的能力，并且有中和残留的灭菌因子对微生物抑制生长的能力；
c） 经过过氧化氢气体灭菌后不会产生抑制微生物生长的物质。
4.3.2 恢复培养基按以下方法检验：
每个样本的恢复培养基巾，接种10 CFU～100 CFU的嗜热脂肪杆菌芽孢（ATCC7953），同时设置阴性对照和阳性对照，培养至规定时间后观察有无嗜热脂肪杆菌芽孢生长（一般观察培养基的颜色变化）。如果恢复培养基有菌生长，并且阴性对照无菌生长和阳性对照有菌生长，判断恢复培养液合格。
5.4.4 4.4 稳定性试验
取包装完好的同批次生物指示物放置于制造商建议的保存条件下，存放至标签和说明书规定的有效期限，取出再次进行评价，生物指示物应符合4.1、4.2和4.3的要求。
6 附录
6.1 附录A（资料性附录）活菌培养计数方法
A.1 取含有10mL TPS（0.1%胰蛋白胨的生理盐水溶液）的无菌试管，加入适量无菌玻璃珠，将计数菌片投入试管，用电动混合器混合，到菌片被完全打碎，制成菌悬液。
A.2 将试管按需要数量分组排列于试管架上，每管加入4.5mL TPS。各组由左向右，逐管标上10-1、10-2、10-3……等。
A.3 将菌悬液样本用电动混匀器混合20 s，或在手掌上用力振打80次，随即吸取0.5mL加至10-1管内。
A.4 将10-1管依前法用电动混匀器混合20 s，或在手掌上用力振打80次，混匀，再吸取出0.5 mL加入10-2管内。如此类推，直至最后一管。必要时，还可作某稀释度的1：1或1：4稀释。
A.5 选择适宜稀释度试管（以预计生长菌落数每平板为15 CFU～300 CFU者为宜），吸取其中混合均匀的悬液1.0 mL加于无菌平皿内。每一稀释度接种2个平皿。一般需接种2个～3个不同稀释度。
A.6 将熔化的40℃～45℃嗜热脂肪杆菌芽孢恢复培养基，见《消毒技术规范（2002年版）》，倾注于已加入样液的平皿中，每平皿15 mL～20 mL。
A.7 将平皿盖好，即刻轻轻摇动混匀，平放。待琼脂凝固后，翻转平皿使底向上，置56℃±2℃恒温培养箱内培养。
A.8 培养至72 h，计数菌落数。一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。以每平板菌落数在30 CFU～300 CFU的稀释度为准记录结果。
A.9 根据稀释倍数和接种量计算每毫升菌液中或每一菌片（染菌载体）上的平均菌落数。
6.2 附录B（资料性附录）部分阴性法计算D值
B.1 随机选取120个样本。分成6组，每组20个样本。
B.2 生物指示物抗力测试仪设置如下：
a） 暴露温度：50℃±0.5℃；
b） 暴露剂量：2.3 mg/L±0.4 mg/L；
c） 暴露时间至少为6个时间点，至少1个时间点全部有菌生长，至少2个时间点部分有菌生长，至少2个时间点全部无菌生长。
B.3 对6组样本分别暴露。
B.4 暴露完成后将6组生物指示物在56℃±2℃温度下，按照说明书要求培养到规定时间，记录阴性和阳性结果。当最短暴露时间点全部为阳性，最长的2个暴露时间全部为阴性，并且中间至少2组有部分样本阳性，试验结果有效，带人式（B.1）和式（B.2）计算D值。
B.5 部分阴性法（Limited Spearman-Karber法）D值的计算见式（B.1）、式（B.2）：
式中：
UHSK——达到无菌生长平均时间，单位为秒（s）；
UK——首次显示所有样本无菌生长的暴露时间，单位为秒（s）；
d——暴露时间的固定间隔，单位为秒（s）；
n——每组的样本量，单位为个；
ri——每次暴露无菌样本数量，单位为个；
N0——回收菌落数，单位为CFU。
6.3 附录C（资料性附录）验证法测试D值
6.3.1 C.1 ST值验证
将50个试验样本放人过氧化氢气体生物指示物抗力测试仪中，作用浓度为2.3 mg/L±0.4 mg/L，在50℃±0.5℃时，暴露时间设定为计算出的ST值，暴露完成后，将50个生物指示物样本取出，置于56℃±2℃培养至说明书规定时间。若全部有菌生长，则计算的ST值通过验证；若有样本无菌生长，则计算的ST值没有通过验证。
6.3.2 C.2 KT值验证
将50个试验样本放人过氧化氢气体生物指示物抗力测试仪中，作用浓度为2.3 mg/L±0.4 mg/L，在50℃±0.5℃时，暴露时间设定为计算出的KT值，暴露完成后，将50个生物指示物样本取出，置于56℃±2℃培养至说明书规定时间。若全部无菌生长，则计算的KT值通过验证；若有样本有菌生长，则计算的KT值没有通过验证。
6.3.3 C.3 判定
计算的ST值和KT值都通过验证，则判定测出的D值有效。
7 全文下载
GBT 33417-2016 过氧化氢气体灭菌生物指示物检验方法.pdf