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2010年版药典一部附录XVIII

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目录

1 拼音

2010 nián bǎn yào diǎn yī bù fù lù XVIII

中华人民共和国药典》2010年版一部附录XVIII

2 附录XVIII A 中药质量标准分析方法

2.1 验证指导原则

中药质量标准分析方法验证的目的是证明采用的方法是否适合于相应检测要求。在建立中药质量标准时,分析方法需经验证;在处方、工艺等变更或改变原分析方法时,也需对分析方法进行验证。方法验证过程和结果均应记载在药品质量标准起草说明或修订说明中。

需验证的分析项目有:鉴别试验、限量检查和含量测定,以及其他需控制成分(如残留物、添加剂等)的测定。中药制剂溶出度释放度等检查中,其溶出量等检测方法也应作必要验证。验证内容有:准确度精密度(包括重复性、中间精密度和重现性)、专属性、检测限、定量限线性、范围和耐用性。应视具体方法拟订验证的内容。附表中列出的分析项目和相应的验证内容可供参考。

方法验证内容如下:

2.1.1 一、准确度

准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度,一般用回收率(%)表示。准确度应在规定的范围内测试。用于定量测定的分析方法均需做准确度验证。

2.1.1.1 1.测定方法的准确度

可用已知纯度的对照品做加样回收测定,即于已知被测成分含量的供试品中再精密加入一定量的已知纯度的被测成分对照品,依法测定。用实测值与供试品中含有量之差,除以加入对照品量计算回收率。

在加样回收试验中须注意对照品的加入量与供试品中被测成分含有量之和必须在标准曲线线性范围之内;加入的对照品的量要适当,过小则引起较大的相对误差,过大则干扰成分相对减少,真实性差。

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式中 A为供试品所含被测成分量;B为加入对照品量;

C为实测值。

2.1.1.2 2.数据要求

在规定范围内,取同一浓度的供试品,用6个测定结果进行评价;或设计3个不同浓度,每个浓度各分别制备3份供试品溶液进行测定,用9个测定结果进行评价,一般中间浓度加入量与所取供试品含量之比控制在1:1左右。应报告供试品取样量、供试品中含有量、对照品加入量、测定结果和回收率(%)计算值,以及回收率(%)的相对标准偏差(RSD%)或可信限。

2.1.2 二、精密度

精密度系指在规定的测试条件下,同一个均匀供试品,经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。

精密度包含重复性、中间精密度和重现性。

在相同操作条件下,由同一个分析人员在较短的间隔时间内测定所得结果的精密度称为重复性;在同一个实验室,不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度称为中间精密度;在不同实验室由不同分析人员测定结果之间的精密度称为重现性。

用于定量测定的分析方法均应考察方法的精密度。

2.1.2.1 1.重复性

在规定范围内,取同一浓度的供试品,用6个测定结果进行评价;或设计3个不同浓度,每个浓度各分别制备3份供试品溶液进行测定,用9个测定结果进行评价。

2.1.2.2 2.中间精密度

为考察随机变动因素对精密度的影响,应进行中间精密度试验。变动因素为不同日期、不同分析人员、不同设备等。

2.1.2.3 3.重现性

当分析方法将被法定标准采用时,应进行重现性试验。例如建立药典分析方法时通过不同实验室的复核检验得出重现性结果。复核检验的目的、过程和重现性结果均应记载在起草说明中。应注意重现性试验用的样品本身的质量均匀性和贮存运输中的环境影响因素,以免影响重现性结果。

2.1.2.4 4.数据要求

均应报告标准偏差、相对标准偏差或可信限。

2.1.3 三、专属性

专属性系指在其他成分可能存在下,采用的方法能正确测定出被测成分的特性。鉴别试验、限量检查、含量测定等方法均应考察其专属性。

2.1.3.1 1.鉴别试验

应能与可能共存的物质或结构相似化合物区分。不含被测成分的供试品,以及结构相似或组分中的有关化合物,均不得干扰测定。显微鉴别、色谱及光谱鉴别等应附相应的代表性图像或图谱。

2.1.3.2 2.含量测定和限量检查

以不含被测成分的供试品(除去含待测成分药材或不含待测成分的模拟复方)试验说明方法的专属性。色谱法、光谱法等应附代表性图谱,并标明相关成分在图中的位置,色谱法中的分离度应符合要求。必要时可采用二极管阵列检测和质谱检测,进行峰纯度检查。

2.1.4 四、检测限

检测限系指供试品中被测物能被检测出的最低量。确定检测限常用的方法如下。

2.1.4.1 1.直观

用一系列已知浓度的供试品进行分析,试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。

可用于非仪器分析方法,也可用于仪器分析方法。

2.1.4.2 2.信噪比法

仅适用于能显示基线噪声的分析方法,即把已知低浓度供试品测出的信号与空白样品测出的信号进行比较,算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般以信噪比为3:1或2:1时相应浓度或注入仪器的量确定检测限。

2.1.4.3 3.数据要求

应附测试图谱,说明测试过程和检测限结果。

2.1.5 五、定量限

定量限系指供试品中被测成分能被定量测定的最低量,其测定结果应具一定准确度和精密度。用于限量检查的定量测定的分析方法应确定定量限。

常用信噪比法确定定量限。一般以信噪比为10:1时相应浓度或注入仪器的量进行确定。

2.1.6 六、线性

线性系指在设计的范围内,测试结果与供试品中被测物浓度直接呈正比关系的程度。

应在规定的范围内测定线性关系。可用一贮备液经精密稀释,或分别精密称样,制备一系列供试品的方法进行测定,至少制备5个浓度的供试品。以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作图,观察是否呈线性,再用最小二乘法进行线性回归。必要时,响应信号可经数学转换,再进行线性回归计算。数据要求:应列出回归方程、相关系数和线性图。

2.1.7 七、范围

范围系指能达到一定精密度、准确度和线性,测试方法适用的高低限浓度或量的区间。

范围应根据分析方法的具体应用和线性、准确度、精密度结果及要求确定。对于有毒的、具特殊功效或药理作用的成分,其范围应大于被限定含量的区间。溶出度或释放度中的溶出量测定,范围应为限度的±20%。

2.1.8 八、耐用性

耐用性系指在测定条件有小的变动时,测定结果不受影响的承受程度,为使方法用于常规检验提供依据。开始研究分析方法时,就应考虑其耐用性。如果测试条件要求苛刻,则应在方法中写明。典型的变动因素有:被测溶液的稳定性,样品提取次数、时间等。液相色谱法中典型的变动因素有:流动相的组成比例或pH值,不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱,柱温,流速及检测波长等。气相色谱法变动因素有:不同厂牌或批号的色谱柱、固定相,不同类型的担体,柱温,进样口和检测器温度等。薄层色谱的变动因素有:不同厂牌的薄层板,点样方式及薄层展开时温度及相对湿度的变化等。

经试验,应说明小的变动能否通过设计的系统适用性试验,以确保方法有效。

附表检验项目和验证内容

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①已有重现性验证,不需验证中间精密度。

③重现性只有在该分析方法将被法定标准采用时做。③如一种方法不够专属,可用其他分析方法予以补充。上表中列举了在不同类型的分析方法验证中被认为是最

重要的项目,“-”表示通常不需要验证的项目,“+”表示通常需要验证的项目,如遇特殊情况,仍应根据具体分析对象和情况而定。

3 附录XVIII B 中药注射剂安全性检查法应用指导原则

本指导原则为中药注射剂临床使用的安全性和制剂质量可控性而定。

中药注射剂安全性检查包括热原(或细菌内毒素)、异常毒性、降压物质、过敏反应物质、溶血与凝聚等项。根据处方、工艺、用法及用量等设定相应的检查项目并进行适用性研究。

3.1 一、中药安全性检查项目的设定

静脉注射剂 应设热原(或细菌内毒素)、异常毒性、过敏反应、溶血与凝聚等安全性检查项,除功能主治中具有与降血压相关内容的注射剂外,还应考虑设降压物质检查项。

由于中药注射剂中致人体发热成分和干扰细菌内毒素检查法的因素复杂多变,一般首选热原检查项,但若该药本身的药理作用或对家兔的毒性反应影响热原检测,可选择细菌内毒素检查项。

肌内注射用注射剂 应设异常毒性、过敏反应等检查项。

3.2 二、安全性检查方法和检查限值确定

检查方法和检查限值可按以下各项目内容要求进行研究。研究确定限值后,至少应进行3批以上供试品的检查验证。

3.2.1 1.热原或细菌内毒素检查

本法系利用家兔(或鲎试剂)测定供试品所含的热原(或细菌内毒素)的限量是否符合规定。不合格供试品在临床应用时可产生热原反应而造成严重的不良后果。

3.2.1.1 检查方法

参照热原检查法2010年版药典一部附录XIII A)或细菌内毒素检查法(2010年版药典一部附录XIII D)。

3.2.1.2 设定限值前研究

热原检查应做适用性研究,求得对家兔无毒反应、不影响正常体温和无解热作用剂量;细菌内毒素检查应进行干扰试验,求得最大无干扰浓度。

3.2.1.3 设定限值

热原和细菌内毒素检查的限值根据临床1小时内最大用药剂量计算。热原检查限值可参照临床剂量计算,一般为人用每千克体重每小时最大供试品剂量的3~5倍,供试品注射体积每千克体重一般不少于0.5ml,不超过10ml。细菌内毒素检查限值按规定要求计算,根据药品和适应症(如抗感染、抗肿瘤心血管药等急重病症用药、儿童老人用药、复合用药、大输液等)的不同,限值可适当严格,至计算值的1/3~1/2,以保证安全用药。

热原限值剂量应不影响正常体温,细菌内毒素测定浓度应无干扰反应。如有干扰或影响,可在品种项下增加稀释浓度、调节pH和渗透压或缓慢注射等排除干扰或影响的特殊规定。

3.2.2 2.异常毒性检查

本法系将一定量的供试品溶液注入小鼠体内,规定时间内观察小鼠出现的死亡情况,以判定供试品是否符合规定。供试品的不合格表明药品中混有超过药物本身毒性的毒性杂质,临床用药将可能增加急性不良反应

3.2.2.1 检查方法

参照异常毒性检查法(2010年版药典一部附录XIII E)。

3.2.2.2 设定限值前研究

参考文献数据并经单次静脉注射给药确定该注射剂的急性毒性数据(LD50LD、及其可信限)。有条件时,由多个实验室或多种来源动物试验求得LD50和LD1数据。注射速度0.1ml/s,观察时间为72小时。如其他给药途径或延长观察时间,应进行相应途径或相应观察时间的急性毒性试验。

3.2.2.3 设定限值

异常毒性检查的限值应低于该注射剂本身毒性的最低致死剂量,考虑到实验室间差异、动物反应差异和制剂的差异,建议限值至少应小于LD1可信限下限的1/3(建议采用1/3~1/6),如难以计算得最低致死量,可采用小于LD50。可信限下限的1/4(建议采用1/4~1/8)。如半数致死量与临床体重剂量之比小于20可采用LD50可信限下限的1/4或LD1可信限下限的1/3。静脉注射最大剂量0.8ml/20g仍未见毒性反应或死亡,可以此作为检查限值。

如对动物、给药途径和给药次数、观察指标和时间等方法和限值有特殊要求时应在品种项下另作规定。

3.2.3 3.降压物质检查

本法系通过静脉注射限值剂量供试品,观察对麻醉猫的血压反应,以判定供试品中所含降压物质的限值是否符合规定。供试品的不合格表明药品中含有限值以上的影响血压反应的物质,临床用药时可能引起急性降压不良反应。

3.2.3.1 检查方法

参照降压物质检查法(2010年版药典一部附录XIII F)。

3.2.3.2 设定限值前研究

供试品按一定注射速度静脉注射不同剂量后(供试品溶液与组胺对照品溶液的注射体积一般应相同,通常为0.2~1ml/kg),观察供试品对猫血压反应的剂量反应关系,求得供试品降压物质检查符合规定的最大剂量(最大无降压反应剂量)。

3.2.3.3 设定限值

一般以临床单次用药剂量的1/5~5倍作为降压反应物质检查剂量限值,急重病症用药尽可能采用高限。

特殊情况下,如供试品有一定降压作用,则可按最大无降压反应剂量的1/2~1/4作为限值剂量;供试品原液静脉注射1ml/kg剂量未见降压反应,该剂量可作为给药限值。

3.2.4 4.过敏反应检查

本法系将一定量的供试品皮下或腹腔注射入豚鼠体内致敏,间隔一定时间后静脉注射供试品进行激发,观察豚鼠出现过敏反应的情况,以此判定供试品是否符合规定。供试品不合格表明注射剂含有过敏反应物质,临床用药时可能使患者致敏或产生过敏反应,引起严重不良反应。

3.2.4.1 检查方法

参照过敏反应检查法(附录XIII G)。

3.2.4.2 设定限值前研究

测定供试品对豚鼠腹腔(或皮下)和静脉给药的无毒性反应剂量。必要时,可采用注射剂的半成品辅料进行致敏和激发研究,确定致敏方式和次数,在首次给药后14、21、28天中选择最佳激发时间。

3.2.4.3 设定限值

致敏和激发剂量应小于该途径的急性毒性反应剂量,适当参考临床剂量。一般激发剂量大于致敏剂量。常用腹腔或鼠鼷部皮下注射途径致敏,每次每只0.5ml,每只1ml静脉注射激发。如致敏剂量较小,可适当增加致敏次数,方法和限值的特殊要求应在品种项下规定。

3.2.5 5.溶血与凝聚检查

本法系将一定量供试品与2%兔红细胞混悬液混合,温育一定时间后,观察其对红细胞的溶血与凝聚反应以判定供试品是否符合规定。

3.2.5.1 检查方法

参照溶血与凝聚检查法(2010年版药典一部附录XIII H)。

3.2.5.2 设定限值前研究

对注射剂原液和稀释液进行溶血与凝聚实验研究,指标除目测外可增加比色法显微镜下观察的方法,同时观察溶血和凝聚,确定无溶血和凝聚的最大浓度。

3.2.5.3 设定限值

以无溶血和凝聚的最大浓度的1/2作为限值浓度,一般应高于临床最大使用浓度。

4 附录XVIII C 中药生物活性测定指导原则

生物活性测定法是以药物的生物效应为基础,以生物统计为工具,运用特定的实验设计,测定药物有效性的一种方法,从而达到控制药品质量的作用。其测定方法包括生物效价测定法和生物活性限值测定法。

中药的药材来源广泛、多变,制备工艺复杂,使得中药制剂的质量控制相对困难,此外,中药含有多种活性成分和具有多种药理作用,因此,仅控制少数成分不能完全控制其质量和反映临床疗效。为了使中药的质量标准能更好地保证每批药品的临床使用安全有效,有必要在现有含量测定的基础上增加生物活性测定,以综合评价其质量。

本指导原则的目的是规范中药生物活性测定研究,为该类研究的实验设计、方法学建立等过程和测定方法的适用范围提供指导性的原则要求。

4.1 基本原则

4.1.1 符合药理学研究基本原则

建立的生物活性测定方法应符合药理学研究的随机、对照、重复的基本原则;具备简单、精确的特点;应有明确的判断标准。

4.1.2 体现中医药特点

鼓励应用生物活性测定方法探索中药质量控制,拟建立的方法的测定指标应与该中药的“功能与主治”相关。

4.1.3 品种选择合理

拟开展生物活性测定研究的中药材、饮片、提取物或中成药应功能主治明确,其中,优先考虑适应症明确的品种,对中药注射剂、急重症用药等应重点进行研究。

4.1.4 方法科学可靠

优先选用生物效价测定法,不能建立生物效价测定的品种可考虑采用生物活性限值测定法,待条件成熟后可进一步研究采用生物效价测定法。

4.2 基本内容

4.2.1 1.实验条件

4.2.1.1 试验系选择

生物活性测定所用的试验系,包括整体动物、离体器官血清微生物组织细胞、亚细胞器受体离子通道和酶等。试验系的选择与试验原理和测定指标密切相关,应选择背景资料清楚、影响因素少、检测指标灵敏和成本低廉的试验系统。应尽可能研究各种因素对试验系的影响,采取必要的措施对影响因素进行控制。

如采用实验动物,尽可能使用小鼠和大鼠等来源多,成本低的实验动物,并说明其种属、品系、性别和年龄。实验动物的使用,应遵循“优化、减少、替代”的“3R”原则。

4.2.1.2 供试品选择

应选择工艺稳定,质量合格的供试品。若为饮片,应基源清楚。应至少使用3批供试品。

4.2.1.3 标准品或对照品选择

如采用生物效价测定法,应有基本同质的标准品以测定供试品的相对效价,标准品的选择应首选中药标准品,也可以考虑化学药作为标准品。如采用生物活性限值测定法,可采用中药成分或化学药品作为方法可靠性验证用对照品。采用标准品或对照品均应有理论依据和/或实验依据。国家标准中采用的标准品或对照品的使用应符合国家有关规定要求。

4.2.2 2.实验设计

4.2.2.1 设计原理

所选实验方法的原理应明确,所选择的检测指标应客观、专属性强,能够体现供试品的功能与主治或药理作用。

4.2.2.2 设计类型

如采用生物效价测定法,应按中国药典二部附录生物检定统计法(2010年版药典一部附录Ⅺ V)的要求进行实验设计研究;如采用生物活性限值测定法,试验设计可考虑设供试品组、阴性对照组或阳性对照组,测定方法使用动物模型时,应考虑设置模型对照组。重现性好的试验,也可以不设或_仅在复试时设阳性对照组。

4.2.2.3 剂量设计

如采用生物效价测定法,供试品和标准品均采用多剂量组试验,并按生物检定的要求进行合理的剂量设计,使不同剂量之间的生物效应有显著性差异。如采用生物活性限值测定法,建议只设一个限值剂量,限值剂量应以产生生物效应为宜;但在方法学研究时,应采用多剂量试验,充分说明标准中设定限值剂量的依据。

4.2.2.4 给药途径

一般应与临床用药途径一致。如采用不同的给药途径,应说明理由。

4.2.2.5 给药次数

根据药效学研究合理设计给药次数,可采用多次或单次给药。

4.2.2.6 指标选择

应客观、明确、专属,与“功能主治”相关。

4.2.3 3.结果与统计

试验结果评价应符合生物统计要求。生物效价测定法应符合中国药典二部附录生物检定统计法(2010年版药典二部附录Ⅺ V)的要求,根据样品测定结果的变异性决定效价范围和可信限率(FL%)限值;生物活性限值测定法,应对误差控制进行说明,明确试验成立的判定依据,对结果进行统计学分析,并说明具体的统计方法和选择依据。

4.2.4 4.判断标准

生物效价测定,应按品种的效价范围和可信限率(FL%)限值进行结果判断。生物活性限值测定,应在规定的限值剂量下判定结果,初试结果有统计学意义者,可判定为符合规定;初试结果没有统计学意义者,可增加样本数进行一次复试,复试时应增设阳性对照组,复试结果有统计学意义,判定为符合规定,否则为不符合规定。

4.3 方法学验证

4.3.1 1.测定方法影响因素考察

应考察测定方法的各种影响因素,通过考察确定最佳的试验条件,以保证试验方法的专属性和准确性。根据对影响因素考察结果,规定方法的误差控制限值或对统计有效性进行说明。

4.3.2 2.精密度考察

应进行重复性、中间精密度、重现性考察。

4.3.2.1 重复性

按确定的测定方法,至少用3批供试品、每批3次或同批供试品进行6次测定试验后对结果进行评价。生物活性测定试验结果判断应基本一致。

4.3.2.2 中间精密度

考察实验室内部条件改变(如不同人员、不同仪器、不同工作日和实验时间)对测定结果的影响,至少应对同实验室改变人员进行考察。

4.3.2.3 重现性

生物活性测定试验结果必须在3家以上实验室能够重现。

4.3.3 3.方法适用性考察

按拟采用的生物活性测定方法和剂量对10批以上该产品进行测定,以积累数据,考察质量标准中该测定项目的适用性。

5 附录XVIII D 抑菌剂效力检查法指导原则

抑菌剂效力检查法系用于测定灭菌、非灭菌制剂中抑菌剂的活性,以评价最终产品的抑菌效力,同时也可用于指导生产企业在研发阶段制剂中抑菌剂浓度的确定。

如果药物本身不具有充分的抗菌活性,那么应根据制剂特性(如水溶液制剂)添加适宜的抑菌剂,以防止制剂在正常贮藏和使用过程中可能发生的微生物污染和繁殖使药物发生变质而对使用者造成危害,尤其是多剂量包装的制剂。

在药品生产过程中,抑菌剂不能用于替代药品生产的GMP管理,不能作为非灭菌制剂降低微生物污染的唯一途径,也不能作为控制多剂量包装制剂灭菌前的生物负载的手段。

所有抑菌剂都具有一定的毒性,制剂中抑菌剂的量应为最低有效量。同时,为保证用药安全,最终包装容器中的抑菌剂有效浓度应低于对人体有害的浓度。

在制剂通则中要求具有抗菌活性的制剂,不管是添加的抑菌剂,还是药物本身具有抗菌活性,在药物研发阶段,均应确认抗菌效力。抑菌剂的抗菌效力在贮存过程中有可能因药物的成分或包装容器等因素影响而提高或降低,因此,应验证最终容器中的抑菌剂效力在效期内不因贮藏条件而降低。本试验方法和抑菌剂抑菌效力判断标准用于包装未启开的成品制剂。

5.1 产品分类

进行本试验的药品分为四类(见表1),以便标准的制定和执行。

表1产品分类

类别

药   品

1类

注射剂、其他非肠道制剂,包括乳剂耳用制剂无菌鼻用制剂眼用制剂

2类

局部给药制剂、非灭菌鼻用制剂及用于黏膜的乳剂

3类

口服非固体制剂(非抗酸制剂)

4类

非固体抗酸制剂

5.2 培养基

5.2.1 培养基的制备

5.2.1.1 1.胰酪胨大豆肉汤培养基(TSB)

酪蛋白胨17.0g  磷酸二氢钾2.5g大豆木瓜蛋白酶消化物3.0g  氯化钠5.0g葡萄糖2.5g 水1000ml除葡萄糖外,取上述成分混合,微温溶解,调pH值约7.0,煮沸,加入葡萄糖溶解后,摇匀,滤清,调节pH值使灭菌后为7.3±0.2,分装,灭菌。

5.2.1.2 2.胰酪胨大豆琼脂培养基(TSA)

胰酪胨15.0g、氯化钠5.0g、大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g、琼脂15.0g、纯化水1000ml

除琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后在25℃的pH值为7.3±0.2,加入琼脂,加热溶化后,摇匀,分装,灭菌。[1]

5.2.1.3 3.沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基

微生物限度检查法(附录XIII C)制备。

5.2.2 培养基的适用性检查

5.2.2.1 抑菌剂效力测定

用培养基应进行培养基的适用性检查,包括成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。菌种 试验所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代),并采用适宜的菌种保藏技术进行保存,以保证试验菌株的生物学特性。

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10 104]

大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B) 44 102]

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26 003]

白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98 001]

黑曲霉(Aspergillus niger)CCMCC(F) 98 003]

5.2.2.2 菌液制备

接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至胰酪胨大豆肉汤培养基中,30~35℃培养18~24小时;接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中,20~25℃培养24~48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50~100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基中,20~25℃培养5~7天,加入3~5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱然后,用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内,用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50~100cfu的孢子悬液。

菌液制备后若在室温下放置,应在2小时内使用;若保存在2~8℃,可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2~8℃,在验证过的贮存期内使用。

5.2.2.3 适用性检查

取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌各50~100cfu,分别注入无菌平皿中,立即倾注胰酪胨大豆琼脂培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,混匀,凝固,置30~35℃培养48小时,计数;取白色念珠菌、黑曲霉各50~100cfu,分别注入无菌平皿中,立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,混匀,凝固,置20~25℃培养72小时,计数;同时,用对应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。

5.2.2.4 结果判定

若被检培养基上的菌落均数不小于对照培养基上菌落平均数的70%,且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致,判该培养基的适用性检查符合规定。

5.3 抑菌剂效力测定

5.3.1 菌种

同培养基的适用性检查,若需要,制剂中常见的污染微生物也可作为试验菌株。

5.3.2 菌液制备

接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的新鲜培养物至胰酪胨大豆肉汤培养基或胰酪胨大豆琼脂培养基中,30~35℃培养18~24小时;接种白色念珠菌于沙氏葡萄糖液体培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基中,20~25℃培养24~48小时。若为琼脂培养物,加入适量的0.9%无菌氯化钠溶液将琼脂表面的培养物洗脱,然后,用适宜方法吸出菌悬液至无菌试管内,加入适量的0.9%无菌氯化钠溶液并采用比浊法制成每1ml含菌数约为108cfu的菌悬液。若为液体培养物,用离心法收集菌体,并用0.9%无菌氯化钠溶液冲洗,采用比浊法制成每1ml含菌数约为108cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基中,23~28℃培养5~7天,加入3~5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱,然后,用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内,加入适量的含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液并采用比浊法制成每1ml含孢子数108cfu的孢子悬液。同时采用平皿法测定1ml菌悬液的菌数。

菌液制备后若在室温下放置,应在2小时内使用;若保存在2~8℃,可在24小时内使用。黑曲霉的孢子悬液可保存在2~8℃,在1周内使用。

5.3.3 供试品接种

抑菌剂效力可能受试验用容器特征的影响,如容器的材质、形状、体积及封口的方式等。因此,只要供试品每个包装容器的装量足够试验用,同时容器便于按无菌操作技术接入试验菌液、混合及取样等,一般应将试验菌直接接种于供试品原包装容器中进行贮存。若因供试品的性状或每个容器装量等因素需将供试品转移至无菌容器时,该容器的材质不得影响供试品的特性(如吸附作用),特别应注意不得影响供试品的pH,pH对抑菌剂的活性影响很大,同时容器的口径大小应便于供试品的进出及混匀。

取包装完整的供试品至少5份,直接接种试验菌,或取适量供试品分别转移至5个适宜的无菌容器中(若试验菌株数超过5株,应增加相应的供试品份数),每一容器接种一种试验菌,1、2、3类供试品中1g或1ml接种菌量为105~106cfu,4类供试品中1g或1ml接种菌量为103~104cfu,接种菌液的体积不得超过供试品体积的0.5%~1%,充分混合,使供试品中的试验菌均匀分布。然后将接种的供试品在试验期间置20~25℃,避光贮存,贮存温度的变化应尽可能控制在最小范围,并防止被污染。

5.3.4 存活菌数测定

根据产品类型,在供试品刚接种(0时)及表2规定的间隔时间,分别从上述每个容器中取供试品1ml(g),用pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液稀释成1: 10、1:102、1: 103等稀释级。采用平皿法或薄膜过滤法(照2010年版药典一部附录XIII C微生物限度检查法,其中测定细菌用胰酪胨大豆琼脂培养基,测定真菌用沙氏葡萄糖琼脂培养基)测定每份供试品中所含的菌数。菌数测定方法应进行验证,验证方法按微生物限度检查法(2010年版药典一部附录XIII C)中的“计数方法的验证”进行,其中测定细菌用胰酪胨大豆琼脂培养基,测定真菌用沙氏葡萄糖琼脂培养基。

根据菌数测定结果,计算1ml(g)供试品各试验菌所加的菌数及各间隔时间的菌数,并换算成lg值。

5.3.5 结果判断

抑菌剂效力根据各间隔时间的菌数lg值相对于初始值(0时菌数lg值)减少程度进行评价(表2),试验结果按有效数字的修约规则进舍,保留小数点后1位有效数字。结果符合表2要求可判定该产品抑菌效力符合规定。

表2抑菌剂抑菌效力判断标准

1类供试品

细菌

7天菌数下降不少于1.0 lg,14天菌数下降不少于3.0 lg,14天到28天菌数不增加

真菌

与初始值比,7、14、28天菌数均不增加

2类供试品

细菌

14天菌数下降不少于2.0 lg,14天到28天菌数不增加

真菌

与初始值比,14、28天菌数均不增加

3类供试品

细菌

14天菌数下降不少于1.0 lg,14天到28天菌数不增加

真菌

与初始值比,14、28天菌数均不增加

4类供试品

细菌,真菌

与初始值比,14、28天菌数均不增加

注:表中“不增加”是指对前一个测定时间,试验菌增加的数量不超过0.5 lg。

6 附录XVIII E 药品微生物检验替代方法验证指导原则

本指导原则是为所采用的试验方法能否替代药典规定的方法用于药品微生物的检验提供指导。

随着微生物学的迅速发展,制药领域不断引入了一些新的微生物检验技术,大体可分为三类:(1)基于微生物生长信息的检验技术,如生物发光技术、电化学技术、比浊法等;(2)直接测定被测介质中活微生物的检验技术,如固相细胞技术法、流式细胞计数法等;(3)基于微生物细胞所含有特定组成成分的分析技术,如脂肪酸测定技术、核酸扩增技术、基因指纹分析技术等。这些方法与传统检查方法比较,或简便快速,或具有实时或近实时监控的潜力,使生产早期采取纠正措施及监控和指导优良生产成为可能,同时新技术的使用也促进了生产成本降低及检验水平的提高。

在控制中药微生物质量中,微生物实验室出于各种原因如成本、生产量、快速简便及提高药品质量等需要而采用非药典规定的检验方法(即替代方法)时,应进行替代方法的验证,确认其应用效果优于或等同于药典的方法。

6.1 微生物检验的类型及验证参数

药品微生物检验方法主要分两种类型:定性试验和定量试验。定性试验就是测定样品中是否存在活的微生物,如无菌检查及控制菌检查。定量试验就是测定样品中存在的微生物数量,如菌落计数试验。

由于生物试验的特殊性,如微生物检验方法中的抽样误差、稀释误差、操作误差、培养误差和计数误差都会对检验结果造成影响,因此,中药质量标准分析方法验证指导原则(2010年版药典一部附录XVIII A)不完全适宜于微生物替代方法的验证。药品微生物检验替代方法的验证参数见表1。

表1 不同微生物检验类型验证参数

捕获.JPG

注:+表示需要验证的参数;-表示不需要验证的参数。

尽管替代方法的验证参数与中药质量标准分析方法验证参数有相似之处,但是其具体的内容是依据微生物检验特点而设立的。替代方法验证的实验结果需进行统计分析,当替代方法属于定性检验时,一般采用非参数的统计技术;当替代方法属于定量检验时,需要采用参数统计技术。

进行微生物替代方法的验证时,若替代方法只是针对药典方法中的某一环节进行技术修改,此时,需要验证的对象仅是该项替代技术而不是整个检验方法。如无菌试验若改为使用含培养基的过滤器,然后通过适宜的技术确认活的微生物存在,那么,验证时仅需验证所用的微生物回收系统而不是整个无菌试验方法。

6.2 替代方法验证的一般要求

在开展替代方法对样品检验的适用性验证前,有必要对替代方法有一个全面的了解。首先,所选用的替代方法应具备必要的方法适用性证据,表明在不合样品的情况下,替代方法在不同类型的微生物检验中所具有的专属性、精密度和检测限等参数。这些证据或由替代方法的研发者提供,或南方法使用者完成。

使用者在基本确认替代方法的适用性后,应采用样品按表l规定的参数逐一进行验证,以确认替代方法可否用于该样品的检验。验证至少使用2个批号的样品,每批样品应平行进行至少3次独立实验。

在开展各参数验证时,涉及的菌种除应包括微生物限度检查法(2010年版药典一部附录XIII C)和无菌检查法(2010年版药典一部附录XIII B)中培养基适用性检查规定的菌株外,还应根据替代方法及样品的特点增加相应的菌株。各菌种应分别进行验证。

6.3 样品中微生物定性检验方法的验证

6.3.1 1.专属性

微生物定性检验的专属性是指检测样品中可能存在的特定微生物种类的能力。当替代方法以微生物生长作为判断微生物是否存在时,其专属性验证时应确认所用培养基的促生长试验,还应考虑样品的存在对检验结果的影响。当替代方法不是以微生物生长作为判断指标时,其专属性验证应确认检测系统中的外来成分不得干扰试验而影响结果,如确认样品的存在不会对检验结果造成影响。采用替代方法进行控制菌的检验,还应选择与控制菌具有类似特性的菌株作为验证对象。

6.3.2 2.检测限

微生物定性检验的检测限是指在替代方法设定的检验条件下,样品中能被检出的微生物的最低数量。由于微生物所具有的特殊性质,检测限是指在稀释或培养之前初始样品所含有的微生物数量,而不是指检验过程中某一环节的供试液中所含有的微生物数量。例如,微生物限度检查中规定不得检出沙门菌,对检测限而言,是指每10g样品中能被检出的沙门菌的最低数量。

检测限确定的方法是在样品中接种较低浓度的试验菌(每单位不超过5cfu),然后分别采用药典方法和替代方法对该试验菌进行检验,以检出与否来比较两种方法的差异。试验菌的接种量须根据试验而定,以接种后采用药典方法50%的样品可检出该试验菌为宜。检测限验证至少应重复进行5次。对于同一种试验菌可采用卡方检验(γ2)来评价两种方法的检测限是否存在差异。

6.3.3 3.重现性

微生物定性检验的重现性是指相同的样品在正常的实验条件(如实验地点、实验人员、仪器、试剂的批次等)发生变化时,所得检验结果的精密度。重现性可视为微生物检验方法在检验结果上抵抗操作和环境变化的能力。方法使用者应优先测定该验证参数。在样品中接种一定数量的试验菌(接种量应在检测限以上),采用药典方法和替代方法,分别由不同人员,在不同时间,使用不同的试剂(或仪器)进行检验,采用卡方检验(γ2)来评价两种方法的重现性是否存在差异。验证过程中,应关注样品的一致性。

6.3.4 4.耐用性

微生物定性检验的耐用性是指当方法参数有小的刻意变化时,检验结果不受影响的能力,为方法正常使用时的可靠性提供依据。方法使用者应优先测定该验证参数。与药典方法比较,若替代方法检验条件较为苛刻,则应在方法中加以说明。替代方法与药典方法的耐用性比较不是必须的,但应单独对替代方法的耐用性进行评价,以便使用者了解方法的关键操作点。

6.4 样品中微生物定量检验方法的验证

微生物定量检验一般都涉及菌落计数。对计数结果进行数据处理时通常需要使用统计的方法。由于菌落计数服从泊松分布,因此采用泊松分布的统计方法对计数结果进行数据处理优于采用正态分布的统计方法。检验者往往习惯采用正态分布的统计方法,因此也可以通过对数转换或平方根加1的方法将原始数据转换为正态分布数据后再进行统计分析。两种统计方法都适用于微生物数据的统计分析。

6.4.1 1.准确度

微生物定量检验的准确度是指替代方法的检验结果与药典方法检验结果一致的程度。准确度的确认应在检测的范围内,通常用微生物的回收率(%)来表示。

检测范围内的准确度都应符合要求,准确度验证的方法是:制备试验菌的菌悬液,菌悬液的浓度应选择为能够准确计数的最高浓度,然后系列稀释至较低浓度(如小于10cfu/ml)。例如,菌落计数平皿法的替代方法,在制备高浓度菌悬液时,其浓度可以是103cfu/ml,并系列稀释至100cfu/ml。每个试验菌应至少选择5个菌浓度进行准确度确认,替代方法的检验结果不得少于药典方法检验结果的70%,也可以采用合适的统计学方法表明替代方法的回收率至少与药典方法一致。当替代方法的回收率高于药典方法时,有必要结合专属性项下的有关内容对准确度进行评价。

6.4.2 2.精密度

微生物定量检验的精密度是指在检验范围内,对同一个均匀的样品多次重复取样测定,其检验结果的一致程度,通常采用标准偏差或相对标准偏差来表示,也可以采用其他适宜的方式。

精密度验证的方法是:制备试验菌的菌悬液,菌悬液的浓度应选择为能够准确读数的最高浓度,然后系列稀释至较低浓度(如小于10cfu/ml)。每个试验菌选择其中至少5个浓度的菌悬液进行检验。每一个浓度至少应进行10次重复检验,以便能够采用统计分析方法得到标准偏差或相对标准偏差。一般情况下,可以接受的相对标准偏差(RSD)应不大于35%。不考虑特殊的检验结果,替代方法的相对标准偏差(RSD)应不大于药典方法。例如,药典菌落计数平皿法其可接受的相对标准偏差(RSD)与含菌浓度的关系见表2。

表2 不同含茵浓度下预期的相对标准偏差

cfu/皿

预期RSD

<10

<35%

10~30

<25%

30~300

<15%

6.4.3 3.专属性

微生物定量检验的专属性是指通过检测适宜的试验菌,以证明检验方法与其设定目的相适应的能力。例如,菌落计数平皿法其设定目的在于检出一定数量的微生物,则其专属性验证应证明当样品中存在一定数量的试验菌时,通过平皿法检验,能够检出试验菌,而样品的存在不会对结果造成影响。专属性验证时,应能够设计出可能使替代方法出现假阳性的实验模型来挑战替代方法,从而确认替代方法的适用性。当替代方法不依赖微生物生长出菌落或出现混浊就可以定量时(如不需要增菌或在1~50cfu范围内就可直接测定菌数的定量方法),以上验证方式就显得更为重要。

6.4.4 4.定量限

微生物定量检验的定量限是指样品中能被准确定量测定的微生物最低数量。由于无法得到含有已知微生物数量的实验样品,因此,在定量限验证时,应选择在检验范围内至少5个菌浓度,每个浓度重复取样测定不少于5次,替代方法的定量限不得大于药典方法。需要注意的是,由于细菌计数和菌落数服从泊松分布,可能存在计数结果的误差,因此替代方法的定量限仅需证实在相近的低限度下其灵敏度至少相当于药典方法。

定量限验证的方法是:在检验范围的低限制备5份不同含菌浓度的菌悬液,每份菌悬液分别用药典方法和替代方法进行不少于5次检验,采用统计方法比较替代方法的检验结果与药典方法结果的差异,从而评价替代方法的定量限。

6.4.5 5.线性

微生物定量检验的线性是指在一定范围内,检验结果与样品中微生物数量成比例关系的程度。线性验证时必须覆盖能够准确测定的所有浓度范围。每株试验菌应选择至少5个浓度,每个浓度至少测定5次。根据以上实验数据,以检验结果为因变量,以样品中微生物的预期数量为自变量进行线性回归分析,计算相关系数r。当相关系数不能准确评估线性时,只能确定简单大约的关系值。替代方法的相关系数不得低于0.95。

6.4.6 6.范围

微生物定量检验的范围是指能够达到一定的准确度、精密度和线性,检验方法适用的高低限浓度或数量的区间。

6.4.7 7.重现性

微生物定量检验的重现性是指相同的样品在正常的实验条件(如实验地点、实验人员、仪器、试剂的批次等)发生变化时,所得检验结果的精密度。重现性可视为微生物检验方法在检验结果上抵抗操作和环境变化的能力。方法使用者应优先测定该验证参数。在样品中接种一定数量的试验菌(接种量应在定量限以上),采用药典方法和替代方法,分别由不同人员,在不同时间,使用不同的试剂(或仪器)进行检验,对检验结果进行统计分析,以相对标准偏差(RSD)来评价两种方法的重现性差异。验证过程中,应关注样品的一致性。

6.4.8 8.耐用性

微生物定量检验的耐用性是指当方法参数有小的刻意变化时,检验结果不受影响的能力,为方法正常使用时的可靠性提供依据。方法使用者应优先测定该验证参数。与药典方法比较,若替代方法检验条件较为苛刻,则应在方法中加以说明。替代方法与药典方法的耐用性比较不是必须的,但应单独对替代方法的耐用性进行评价,以便使用者了解方法的关键操作点。

7 附录XVIII F 微生物限度检查法应用指导原则

为更好应用微生物限度检查法(2010年版药典一部附录XIII C),特制定本指导原则。

微生物限度检查法可用于判断非规定灭菌制剂及原料、辅料是否符合药典的规定,也可用于指导制剂、原料、辅料的微生物质量标准的制定,及指导生产过程中间产品微生物质量的监控。本指导原则将对标准和方法中的特定内容及标准的应用做进一步的说明。

1.微生物限度检查过程中,如需要使用表面活性剂灭活剂及中和剂,在确定其能否适用于所检样品及其用量时,除应证明该试剂对所检样品的处理有效外,还须确认该试剂不影响样品中可能污染的微生物的检出(即无毒性),因此无毒性确认试验的菌株不能仅局限于验证试验菌株,而应当包括产品中可能污染的微生物。

2.供试液制备方法、抑菌成分的消除方法及细菌、霉菌酵母菌计数方法应尽量选择微生物限度检查法中操作简便、快速的方法,同时,所选用的方法应避免损伤供试品中污染的微生物。对于抑菌作用较强的供试品,在供试品溶液性状允许的情况下,应尽量选用薄膜过滤法进行试验。

3.微生物限度检查法(2010年版药典一部附录XIII C)收载的离心沉淀法仅适用于制备细菌计数或控制菌(细菌)检查用的供试液,规定的500转/分钟、不超过3分钟只用于去除供试液中的沉淀物。采用该方法时,供试液中的样品颗粒大小、黏稠度及污染的微生物大小、转速等直接影响着样品中微生物的回收,易造成检验结果不能真实反映供试品的污染情况。因此,供试液制备时尽量避免使用该方法,更不宜采用高速离心沉降集菌。

4.对照培养基系指按培养基处方特别制备、质量优良的培养基,用于培养基适用性检查。由中国药品生物制品检定所研制及分发。

5.进行验证试验时,若因没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物回收的失败,应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液进行方法验证试验。此时更高稀释级供试液的确认要从低往高的稀释级进行,但最高稀释级供试液选择应根据供试品应符合的微生物限度标准和菌数报告规则,如供试品应符合的微生物限度标准是1g细菌数不得过1000cfu,那么最高稀释级是1: 10-3

若采用允许的最高稀释级供试液进行验证试验还存在1株或多株试验菌的回收率达不到要求,那么应选择回收情况最接近要求的方法进行供试品的检测。如某种产品对某试验菌有较强的抑菌性能,采用薄膜过滤法的回收率为40%,而采用培养基稀释法的回收率为30%,那么应选择薄膜过滤法进行该供试品的检测。在此情况下,生产单位或研制单位应根据原辅料的微生物质量、生产工艺及产品特性进行产品的风险评估,以保证检验方法的可靠性,从而保证产品质量。

6.微生物限度检查法中控制菌检查法没有规定进一步确证疑似致病菌的方法。若供试品检出疑似致病菌,确证的方法应选择已被认可的菌种鉴定方法,如细菌鉴定一般依据《伯杰氏细菌鉴定手册》。

7.在药品的生产、贮存、销售及新药标准制订、进口药品标准复核、考察药品质量、仲裁中,除在品种项下及制剂通则项下另有规定外,其微生物限度均以药典的“药品微生物限度标准”(2010年版药典一部附录XIII C)为依据。

8.用于手术、烧伤及严重创伤的局部给药制剂应符合无菌检查法要求。对用于创伤程度难以判断的局部给药制剂,若没有证据证明药品不存在安全性风险,那么该药品应符合无菌检查法要求。

9.含动物类原药材粉的口服中药制剂要求不得检出沙门菌。其中的动物类原药材粉是指除蜂蜜王浆、动物角、阿胶外的所有动物类原药材粉,如牡蛎珍珠等贝类,海蜇冬虫夏草人工牛黄等。

10.制定药品的微生物限度标准时,除了依据“药品微生物限度标准”(2010年版药典一部附录XIII C)外,还应综合考虑原料来源、性质、生产工艺条件、给药途径及微生物污染对患者的潜在危险等因素,提出合理安全的微生物限度标准,因此,必要时,特殊品种为保证其疗效、稳定性及避免对患者的潜在危害性,应制定更严格的微生物限度标准,并在品种项下规定,如吸入粉雾剂,从使用者的安全性考虑,应按无菌产品的要求进行控制。制定辅料、中药提取物的微生物限度标准时,除参照相应制剂的微生物限度标准外,还应综合考虑相应制剂及其生产工艺的特性。

8 附录XVIII G 药品微生物实验室质量管理指导原则

药品微生物实验室质量管理[2]指导原则用于指导药品微生物检验实验室的质量控制。

药品微生物的检验结果受很多因素的影响,如样品中微生物可能分布不均匀、微生物检验方法的误差较大等。因此,在药品微生物检验中,为保证检验结果的可靠性,必须使用经验证的检测方法并严格按照药品微生物实验室质量管理指导原则要求进行试验。

药品微生物实验室规范包括以下几个方面:人员、培养基试剂、菌种、环境、设备、样品、检验方法、污染废弃物处理、检测结果质量保证和检测过程质量控制、实验记录、结果的判断、检测报告、文件[2]等。

8.1 人员

从事药品微生物试验工作的人员应具备微生物学或相近专业知识的教育背景。

实验人员应依据所在岗位和职责接受相应的培训,在确认他们可以承担某一试验前,他们不能独立从事该项微生物试验。应保证所有人员在上岗前接受胜任工作所必需的设备操作、微生物检验技术等方面的培训,如无菌操作、培养基制备、消毒、灭菌、注平板、菌落计数、菌种的转种、传代和保藏、微生物检查方法及鉴定基本技术等,经考核合格后方可上岗。

实验人员应经过实验室生物安全方面的培训,保证自身安全,防止微生物在实验室内部污染。

实验室应制定所有级别实验人员的继续教育计划,保证知识与技能不断的更新。[2]

检验人员必须熟悉相关检测方法、程序、检测目的和结果评价。微生物实验室的管理者其专业技能和经验水平应与他们的职责范围相符。如;管理技能、实验室安全、试验安排、预算、实验研究、实验结果的评估和数据偏差的调查、技术报告书写等。

实验室应通过参加内部质量控制、能力验证或使用标准菌株等方法客观评估检验人员的能力,必要时对其进行再培训并重新评估。当使用一种非经常使用的方法或技术时,有必要在检测前确认微生物检测人员的操作技能

所有人员的培训、考核内容和结果均应记录归档。

8.2 培养基

培养基是微生物试验的基础,直接影响微生物试验结果。适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制试验是提供优质培养基的保证。

8.2.1 1.培养基的制备

微生物实验室使用的[2]培养基可按处方配制,也可使用按处方生产的符合规定的脱水培养基。

在制备培养基时,应选择质量符合要求的脱水培养基或单独配方组分进行配制。脱水培养基应附有处方和使用说明,配制时应按使用说明上的要求操作以确保培养基的质量符合要求,不得使用结块或颜色发生改变的脱水培养基。脱水培养基或单独配方组分应在适当的条件下贮藏,如低温、干燥和避光,所有的容器应密封,尤其是盛放脱水培养基的容器。商品化的成品培养基除了应附有处方和使用说明外,还应注明有效期、贮藏条件、适用性检查试验的质控菌和用途。为保证培养基质量的稳定可靠,各脱水培养基或各配方组分应准确称量,并要求有一定的精确度。配制培养基最常用的溶剂是纯化水,特殊情况下,可能需要用去离子水蒸馏水。应记录各称量物的重量和水的使用量。

配制培养基所用容器不得影响培养基质量,一般为玻璃容器。[2]培养基配置所用容器和配套器具应洁净,可用纯化水冲洗玻璃器皿以消除清洁剂和外来物质的残留。对热敏感的培养基如糖发酵培养基其分装容器一般应预先进行灭菌,以保证培养基的无菌性。

脱水培养基应完全溶解于水中,再行分装与灭菌。配制时若需要加热助溶,应注意不要过度加热,以避免培养基颜色变深。如需要添加其他组分时,加入后应充分混匀。

应按照生产商提供或使用者验证的参数进行培养基的灭菌。商品化的成品培养基必须附有所用灭菌方法的资料。培养基灭菌一般采用湿热灭菌技术,特殊培养基可采用薄膜过滤除菌。

培养基若采用不适当的加热和灭菌条件,有可能引起颜色变化、透明度降低、琼脂凝固力或pH的改变。因此,培养基应采用验证的灭菌程序灭菌,培养基灭菌方法和条件,应通过无菌性试验和促生长试验进行验证。此外,对高压灭菌器的蒸汽循环系统也要加以验证,以保证在一定装载方式下的正常热分布。温度缓慢上升的高压灭菌器可能导致培养基的过热,过度灭菌可能会破坏绝大多数的细菌和真菌培养基促生长的质量。灭菌器中培养基的容积和装载方式也将影响加热的速度。因此,应根据灭菌培养基的特性,进行全面的灭菌程序验证。

应确定每批培养基灭菌后的pH值(冷却至室温25℃测定)。若培养基处方中未列出pH值的范围,除非经验证表明培养基的pH值允许的变化范围很宽,否则,pH值的范围不能超过规定值土0.2。

制成平板或分装于试管的培养基应进行下列检查:容器和盖子不得破裂,装量应相同,尽量避免形成气泡,固体培养基表面不得产生裂缝或涟漪,在冷藏温度下不得形成结晶,不得污染微生物等。应检查和记录批数量、有效期及培养基的无菌检查。

8.2.2 2.培养基的贮藏

自配的培养基应标记名称、批号、配制日期、制备人[2]等信息,并在已验证的条件下贮藏。商品化的成品培养基标签上应标有名称、批号、生产日期、失效期及培养基的有关特性,生产商和使用者应根据培养基使用说明书上的要求进行贮藏,所采用的贮藏和运输条件应使成品培养基最低限度的失去水分并提供机械保护。

培养基灭菌后若贮藏在高压灭菌器中,质量可能会受影响,一般不提倡这种存放法。琼脂培养基不得在0℃或0℃以下存放,因为冷冻可能破坏凝胶特性。培养基应避光保存,若要长期保存,应置于密闭容器中以防止水分流失。琼脂平板最好现配现用,如置冰箱保存,一般不超过1周,且应密闭包装,若延长保存期限,保存期需经验证确定。

固体培养基灭菌后的再融化只允许1次,以避免因过度受热造成培养基质量下降或微生物污染。培养基的再融化一般采用水浴或流通蒸汽加热。若采用其他溶解方法,应对其进行评估,确认该溶解方法不影响培养基质量。[2]融化的培养基应置于45~50℃的水浴中,不得超过8小时。倾注培养基时,应擦干培养基容器外表面的水分,避免容器外壁的水滴进入培养基中造成污染。

使用过的培养基(包括失效的培养基)应按照国家污染废物处理相关规定进行。

8.2.3 3.质量控制试验

实验室应对试验用培养基建立质量控制程序,以确保所用培养基质量符合相关检测的需要。

实验室配制或商品化的成品培养基的质量依赖于其制备过程,采用不适宜方法制备的培养基将影响微生物的生长或复苏,从而影响试验结果的可靠性。

所有配制好的培养基均应进行质量控制试验。实验室配制的培养基的常规监控项目是pH、适用性检查试验,定期的稳定性检查以确定有效期。培养基在有效期内应依据适用性检查试验确定培养基质量是否符合要求。有效期的长短将取决于在一定存放条件下(包括容器特性及密封性)的培养基其组成成分的稳定性。

除药典附录另有规定外,在实验室中,若采用已验证的配制和灭菌程序制备培养基且过程受控,那么同一批脱水培养基的适用性检查试验可只进行一次。如果培养基的制备过程未经验证,那么每一批培养基均要进行适用性检查试验,试验的菌种可根据培养基的用途从相关附录中进行选择,也可增加从生产环境及产品中常见的污染菌株。

培养基的质量控制试验若不符合规定,应寻找不合格的原因,以防止问题重复出现。任何不符合要求的培养基均不能使用。

用于环境监控的培养基须特别防护,最好要双层包装和终端灭菌,如果不能采用终端灭菌的培养基,那么在使用前应进行100%的预培养以防止外来的污染物带到环境中及避免出现假阳性结果。

8.3 试剂

微生物实验室应有试剂接收、检查和贮藏的程序,以确保所用试剂质量符合相关检查要求。

实验用的关键试剂,在开启和贮藏过程中,应对每批试剂的适用性进行验证。实验室应对试剂进行管理控制,保存和记录相关资料。

实验室应标明所有试剂、试液及溶液的名称、制备依据、适用性、浓度、效价、贮藏条件、制备日期、有效期及制备人。[2]

8.4 菌种

试验过程中,生物样本可能是最敏感的,因为它们的活性和特性依赖于合适的试验操作和贮藏条件。实验室菌种的处理和保藏的程序应标准化,使尽可能减少菌种污染和生长特性的改变。按统一操作程序制备的菌株是微生物试验结果一致性的重要保证。

药品微生物检验用的试验菌应来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株,或使用与标准菌株所有相关特性等效的可以溯源的[2]商业派生菌株。

标准菌株的复活或培养物的制备应按供应商提供的说明或按已验证的方法进行。从国内或国外菌种保藏机构获得的标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后,即为标准储备菌株。标准储备菌株应进行纯度和特性确认。标准储备菌株保存时,可将培养物等份悬浮于抗冷冻的培养基中,并分装于小瓶中,建议采用低温冷冻干燥、液氮贮存、超低温冷冻(低于-30℃)等方法保存。低于-70℃或低温冷冻干燥方法可以延长菌种保存时间。标准储备菌株可用于制备每月或每周1次转种的工作菌株。冷冻菌种一旦解冻转种制备工作菌株后,不得重新冷冻和再次使用。

工作菌株的传代次数应严格控制,不得超过5代(从菌种保藏机构获得的标准菌株为第0代),以防止过度的传代增加菌种变异的风险。1代是指将活的培养物接种到微生物生长的新鲜培养基中培养,任何亚培养的形式均被认为是转种或传代一次。必要时,实验室应对工作菌株的特性和纯度进行确认。

工作菌株不可替代标准菌株,标准菌株的商业衍生物仅可用作工作菌株。标准菌株如果经过确认试验证明已经老化、退化、变异、污染等或该菌株已无使用需要时,应及时灭菌销毁。[2]

实验室必须建立和保存其所有菌种的进出、收集、贮藏、确认试验以及销毁的记录,应有菌种管理的程序文件(从标准菌株到工作菌株),该程序包括:标准菌种的申购记录;从标准菌株到工作菌株操作及记录;菌种必须定期转种传代,并做纯度、特性等实验室所需关键指标的确认,并记录;每支菌种都应注明其名称、标准号、接种日期、传代数;菌种生长的培养基和培养条件;菌种保藏的位置和条件;其他需要的程序。

{

8.5 环境

微生物实验室应具有进行微生物检测所需的适宜、充分的设施条件。实验环境应保证不影响检验结果的准确性。工作区域与办公区域应分开。

微生物实验室应专用,并与其他领域分开尤其是生产领域。

8.5.1 1.实验室的布局和运行

微生物实验室的布局与设计应充分考虑到试验设备安装、良好微生物实验室操作规范和实验室安全的要求。实验室布局设计的基本原则是既要最大可能防止微生物的污染,又要防止检验过程对环境和人员造成危害,同时还应考虑活动区域的合理规划及区分,避免混乱和污染,以提高微生物实验室操作的可靠性。

微生物实验室的设计和建筑材料应考虑其适用性,以利清洁、消毒、灭菌并减少污染的风险。洁净或无菌室应配备独立的空气机组或空气净化系统,以满足相应的检验要求,包括温度和湿度的控制,压力、照度和噪声等都应符合工作要求。空气过滤系统应定期维护和更换,并保存相关记录。微生物实验室应划分成相应的洁净区域和活菌操作区域,同时应根据试验目的,在时间或空间上有效分隔不相容的试验活动,将交叉污染的风险降低到最低。

活菌操作区应该配备生物安全柜,以避免危害性的生物因子对实验人员和实验环境造成的危害。一般情况下,药品微生物检验的实验室应有符合无菌检查法(2010年版药典三部附录XIII B)和微生物限度检查法(2010年版药典三部附录XIII C)要求的、用于具有开展无菌检查、微生物限度检查、无菌采样等检测活动的、独立设置的洁净室(区)或隔离系统,并为上述检验配备相应的阳性菌实验室、培养室、试验结果观察区、培养基及实验用具准备(包括灭菌)区、样品接收和贮藏区、标准菌株贮藏区、污染物处理区和文档处理区等辅助区域,同时,应对上述区域明确标识。

微生物实验的各项工作应在专属的区域进行,以降低交叉污染、假阳性结果和假阴性结果出现的风险。一些样品若需要证明微生物的生长或进一步分析培养物的特性,如再培养、染色、微生物鉴定或其他确定试验均应在实验室的活菌操作区进行。任何出现微生物生长的培养物不得在实验室无菌区域内打开。对染菌的样品及培养物应有效隔离以减少假阳性结果的出现。病原微生物的分离鉴定工作应在二级生物安全实验室进行。}[2]

{实验室应对进出洁净区域的人和物建立控制程序和标准操作规程,对可能影响检验结果的工作(如洁净度验证及监测、消毒、清洁维护等)能够有效地控制、监测并记录。微生物实验室使用权限应限于经授权的工作人员,实验人员应了解洁净区域的正确进出的程序,包括更衣流程;该洁净区域的预期用途、使用时的限制及限制原因;适当的洁净级别。

8.5.2 2.环境监测

微生物实验室应按相关国家标准制定完整的洁净室(区)和隔离系统的验证和环境监测标准操作规程,环境监测项目和监测频率及对超标结果处理应有书面程序。监测项目应涵盖到位,包括对空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物及物理参数(温度、相对湿度、换气次数气流速度、压差、噪声等)的有效地控制和监测。

8.5.3 3.清洁、消毒和卫生

微生物实验室应有制定清洁、消毒和卫生的标准操作规程,规程中应涉及环境监测结果。

实验室在使用前和使用后应进行消毒,并定期监测消毒效果,要有足够洗手和手消毒设施。应有对有害微生物发生污染的处理规程。

所用的消毒剂种类应满足洁净实验室相关要求并定期更换。理想的消毒剂既能杀死广泛的微生物、对人体无毒害、不会腐蚀或污染设备,又应有清洁剂的作用、性能稳定、作用快、残留少、价格合理。所用消毒剂和清洁剂的微生物污染状况应进行监测,并在规定的有效期内使用,A级和B级洁净区应当使用无菌的或经无菌处理的消毒剂和清洁剂。}[2]

8.6 设备

微生物实验室应配备与检验能力和工作量相适应的仪器设备,其类型、测量范围和准确度等级应满足检验所采用标准的要求,设备的安装和布局应便于操作,易于维护、清洁和校准,并保持清洁和良好的工作状态。用于试验的每台仪器、设备应该有唯一标识。

仪器设备应有合格证书[2],实验室在仪器设备完成相应的检定、校准、验证、确认其性能,并形成相应的操作、维护和保养的标准操作规程后方可正式使用,仪器设备使用和日常监控要有记录。

8.6.1 1.设备的维护

为保证仪器设备处于良好工作状态,应定期对其进行维护和性能验证,并保存相关记录。仪器设备若脱离实验室或被检修,恢复使用前应对其检查或校准,以保证性能符合要求。[2]

微生物实验室所用的仪器应根据日常使用的情况进行定期的校准,并记录。校准的周期和校验的内容根据仪器的类型和设备在实验室产生的数据的重要性的不同而不同。重要的仪器设备,如培养箱、冰箱等,应由专人负责,保证其运行状态正常和受控,同时应有相应的备用设备以保证试验菌株和微生物培养的连续性,特殊设备如高压灭菌器、隔离器、生物安全柜等实验人员应经培训后持证上岗。[2]对于培养箱、冰箱、高压灭菌锅等影响实验准确性的关键设备应在其运行过程中对关键参数(如温度、压力)进行连续观测和记录,有条件的情况下尽量使用自动记录装置。如果发生偏差,应评估对以前的检测结果造成的影响并采取必要的纠正措施。对于一些容易污染微生物的仪器设备如水浴锅、培养箱、冰箱和生物安全柜等应定期进行清洁和消毒。

对试验需用的无菌器具应实施正确的清洗、灭菌措施,并形成相应的标准操作规程,无菌器具应有明确标识并与非无菌器具加以区别。

{实验室的某些设备(例如培养箱、高压灭菌器和玻璃器皿等)应专用,除非有特定预防措施,以防止交叉污染。

8.6.2 2.校准、性能验证和使用监测

微生物实验室所用的仪器应根据日常使用的情况进行定期的校准,并记录。校准的周期和校验的内容根据仪器的类型和设备在实验室产生的数据重要性不同而不同。仪器上应有标签说明校准日期、维修日期和重新校准日期。

8.6.2.1 温度测量装置

温度不但对实验结果有直接的影响,而且还对仪器设备的正常运转和正确操作起关键因素。相关的温度测量装置如培养箱和高压灭菌器中的温度计、热电耦和铂电阻温度计,应

具有可靠的质量并进行校准以确保所需的精确度,温度设备的校准应遵循国家或国际标准。

温度测量装置可以用来监控冰箱、超低温冰箱、培养箱、水浴锅等设备的温度,应在使用前验证此类装置的性能。

8.6.2.2 称量设备

天平和标准砝码应定期进行校准,天平使用过程应采用标准砝码进行校准。每次使用完后应及时清洁,必要时用非腐蚀消毒剂进行消毒。

8.6.2.3 容量测定设备

微生物实验室对容量测定设备如自动分配仪、移液枪、移液管等应进行检定,以确保仪器准确度。对于已经校准或检定证明符合使用要求的玻璃器具可以不进行检定。标有各种使用体积的仪器需要对使用时的体积进行精密度的检查,并且还要测定其重现性。

对于一次性使用的容量设备,实验室应该从公认的和具有相关质量保证系统的公司购买。对仪器适用性进行初次验证后,要对其精密度随时进行检查。必要时应该对每批定容设备进行适用性检查。

8.6.2.4 生物安全柜、层流超净工作台、高效过滤器

应由有资质的人员进行生物安全柜、层流超净工作台及高效过滤器的安装与更换,要按照确认的方法进行现场生物和物理的检测,并定期进行再验证。

实验室生物安全柜和层流超净工作台的通风应符合微生物风险级别及符合安全要求。应定期对生物安全柜、层流超净工作台进行监测以确保其性能符合相关要求。实验室应保存检查记录和性能测试结果。

8.6.2.5 其他设备

悬浮粒子计数器、浮游菌采样器应定期进行校准;pH计、传导计和其他类似仪器的性能应定期或在每次使用前确认;若湿度对实验结果有影响,湿度计应按国家或国际标准进行校准;当所测定的时间对检测结果有影响时,应使用校准过的计时仪或定时器;使用离心机时,应评估离心机每分钟的转数,若离心是关键因素,离心机应该进行校准。}[2]

{

8.7 样品

8.7.1 1.样品采集

试验样品的采集,应遵循随机抽样的原则,并在受控条件下进行抽样,如有可能,抽样应在具有无菌条件的特定抽样区域中进行。抽样时,须采用无菌操作技术进行取样,防止样品受到微生物的污染而导致假阳性的结果。抽样的任何消毒过程(如抽样点的消毒)不能影响样品中微生物的检出。

抽样的容器应贴有唯一性的标识,注明样品名称、批号、抽样日期、采样容器、抽样人等。抽样应由经过培训的人员使用无菌设备在无菌条件下进行无菌操作。抽样环境状况应监测并记录,同时还需记录采样时间。}[2]

{

8.7.2 2.样品储存和运输

待检样品应在合适的条件下贮藏并保证其完整性,尽量减少污染的微生物发生变化。样品在运输过程中,应保持原有(规定)的储存条件或采取必要的措施(如冷藏或冷冻)。应明确规定和记录样品的贮藏和运输条件。

8.7.3 3.样品的确认和处理

实验室应有被检样品的传递、接收、储存和识别管理程序。

实验室在收到样品后应根据有关规定尽快对样品进行检查,并记录被检样品所有相关信息,如:接收日期及时间、接收时样品的状况、采样操作的特征(包括采样日期和采样条件等)、贮藏条件。

如果样品存在数量不足、包装破损、标签缺失、温度不适等,实验室应在决定是否检测或拒绝接受样品之前与相关人员沟通。样品的包装和标签有可能被严重污染,因此搬运和储存样品时应小心以避免污染的扩散,容器外部的消毒应不影响样品的完整性。样品的任何状况在检验报告中应有说明。

选择具有代表性的样品,根据有关的国家或国际标准,或者使用经验证的实验方法,尽快进行检验。

实验室应按照书面管理程序对样品进行保留和处置。如果实验用的是已知被污染的样品,应该在丢弃前进行灭菌。

8.8 检验方法

8.8.1 检验方法选择

药品微生物检验时,应根据检验目的选择适宜的方法进行样品检验。

8.8.2 检验方法的验证

药典方法或标准中规定的方法是经过验证的,当进行样品检验时,应进行方法适用性确认。

如果检验方法不是药典或标准中规定的方法,使用前应进行替代方法的验证,确认其应用效果优于或等同于药典方法。替代方法的验证按药品微生物检验替代方法验证指导原则(2010年版药典三部附录XVIII E)进行。

实验室对所用商业检测系统如试剂盒等应保留确认数据,这些确认数据可由制造者提供或由第三方机构评估,必要时,实验室应对商业检测系统进行确认。}[2]

{

8.9 污染废弃物处理

实验室应有妥善处理废弃样品、过期(或失效)培养基和有害废弃物的设施和制度,旨在减少检查环境和材料的污染。污染废弃物的最终处理必须符合国家环境和健康安全规定。实验室还应针对类似于带菌培养物溢出的意外事件制定处理规程。如:活的培养物洒出必须就地处理,不得使培养物污染扩散。}[2]

{

8.10 检测结果的质量保证和检测过程的质量控制

8.10.1 1.内部质量控制

为保证实验室在每个工作日检测结果的连贯性和与检测

标准的一致性,实验室应制定对所承担的工作进行连续评估的程序。

实验室应定期对实验环境的洁净度、培养基的适用性、灭菌方法、菌株纯度和活性(包括性能)、试剂的质量等进行监控并详细记录。

实验室应定期对检测人员进行技术考核。可以通过加标试样的使用、平行实验和参加能力验证等方法使每个检测人员所检测项目的可变性处于控制之下,以保证检验结果的一致性。

实验室应对重要的检验设备如自动化检验仪器等进行比对

8.10.2 2.外部质量评估

实验室应参加与检测范围相关的国家能力验证或实验室之间的比对实验来评估检测水平,通过参加外部质量评估来评定检测结果的偏差。}[2]

8.11 实验记录

实验结果的可靠性依赖于试验严格按照标准操作规程进行,而标准操作规程应指出如何进行正确的试验操作。实验记录应包含所有关键的实验细节,以便确认数据的完整性。实验室原始记录至少应包括以下内容:实验日期、检品名称、实验人员姓名、标准操作规程编号或方法、实验结果、偏差(存在时)、实验参数(所使用的设备、菌种、培养基和批号以及培养温度等)、主管/复核人签名。

实验记录上还应显示出检验标准的选择,如果使用的是药典标准,必须保证是现行有效的标准。

试验所用的每一个关键的实验设备均应有记录,设备日志或表格应设计合理,[2]以满足试验记录的追踪性,设备温度(水浴、培养箱、灭菌器)必须记录,且具有追溯性。

实验记录写错时,用单线划掉并签字。原来的数据不能抹去或被覆盖。

所有实验室记录应以文件形式保存并防止意外遗失,正规的记录应存放在特定的地方并有登记。

8.12 结果的判断和检测报告

由于微生物试验的特殊性,在实验结果分析时,对结果应进行充分和全面的评价。所有影响结果观察的微生物条件和因素应完全考虑,包括与规定的限度或标准有很大偏差的结果;微生物在原料、辅料或试验环境中存活的可能性;及微生物的生长特性等。特别要了解[2]实验结果与标准的差别是否有统计学意义。

若发现实验结果不符合药典各品种项下要求或另外建立的质量标准,应进行原因调查。引起微生物污染结果不符合标准的原因主要有两个:试验操作错误或产生无效结果的试验环境条件;产品本身的微生物污染总数超过规定的限度或检出控制菌。

异常结果出现时,应进行偏差调查。偏差调查时[2]应考虑实验室环境、抽样区的防护条件、样品在该检验条件下以往检验的情况、样品本身具有使微生物存活或繁殖的特性等情况。此外,回顾试验过程,也可评价该实验结果的可靠性及实验过程是否恰当。如果试验操作被确认是引起实验结果不符合的原因,那么应制定改错方案以解决问题,按照正确的操作方案进行实验,在这种情况下,对试验过程及试验操作应特别认真地进行监控。

如果依据分析调查结果发现试验有错误而判实验结果无效,那么这种情况必须记录。实验室也必须认可复试程序,如果需要,可按相关规定重新抽样,但抽样方法不能影响不符合规定结果的分析调查。

微生物实验室检测报告应该符合检测方法的要求。实验室应准确、清晰、明确和客观地报告每一项或每一份检测的结果。检测报告的信息应该完整。[2]

8.13 文件

文件应当充分表明试验是在实验室里按可控的检查法进行的,一般包括以下方面:人员培训与资格确认;设备验收、验证、检定(或校准期间核查)和维修;设备使用中的运行状态(设备的关键参数);培养基制备、贮藏和质量控制;菌种管理;检验规程中的关键步骤;数据记录与结果计算的确认;质量责任人对试验报告的评估;数据偏离的调查。

9 附录XVIII H 国家药品标准物质制备指导原则

(附录XVIII H 国家药品标准物质制备指导原则 由《中华人民共和国药典》(2010年版 第二增补本)新增)

本指导原则用于规范和指导国家药品标准物质的制备,保证国家药品标准的执行。

9.1 一、国家药品标准物质品种的确定

根据国家药品标准制定及修订的需要,确定药品标准物质的品种。

9.2 二、候选国家药品标准物质原料的选择

1.原料的选择应满足适用性、代表性及可获得性的原则。

2.原料的性质应符合使用要求。

3.原料的均匀性、稳定性及相应特性量值范围应适合该标准物质的用途。

9.3 三、候选国家药品标准物质的制备

1.根据候选药品标准物质的理化性质,选择合理的制备方法和工艺流程,防止相应特性量值的变化,并避免被污染。

2.对不易均匀的候选药品标准物质,在制备过程中除采取必要的均匀措施外,还应进行均匀性初检

3.对相应特性量值不稳定的候选药品标准物质,在制备过程中应考察影响稳定性的因素,采取必要的措施保证其稳定性,并选择合适的储存条件。

4.当候选药品标准物质制备量大时,为便于保存可采取分级分装。

5.候选药品标准物质供应者须具备良好的实验条件和能力,并应提供以下资料。

(1)试验方法、量值、试验重复次数、必要的波谱及色谱等资料;

(2)符合稳定性要求的储存条件(温度、湿度和光照等);

(3)候选药品标准物质引湿性研究结果及说明;

(4)加速稳定性研究结果;

(5)有关物质的鉴别及百分比,国家药品标准中主组分的相对响应因子等具体资料;

(6)涉及危害健康的最新的安全性资料。

9.4 四、候选国家药品标准物质的标定

候选药品标准物质按以下要求进行标定,必要时应与国际标准物质进行比对。

9.4.1 1.化学结构或组分的确证

(1)验证已知结构的化合物需要提供必要的理化参数及波谱数据,并提供相关文献及对比数据。如无文献记载,应提供完整的结构解析过程。

(2)对于不能用现代理化方法确定结构的药品标准物质,应选用适当的方法对其组分进行确证。

9.4.2 2.理化性质检查

应根据药品标准物质的特性和具体情况确定理化性质检验项目,如性状、熔点、比旋度、晶型以及干燥失重、引湿性等。

9.4.3 3.纯度及有关物质检查

应根据药品标准物质的使用要求确定纯度及有关物质的检查项,如反应中间体、副产物及相关杂质等。

9.4.4 4.均匀性检验

凡成批制备并分装成最小包装单元的候选药品标准物质,必须进行均匀性检验。对于分级分装的候选药品标准物质,凡由大包装分装成最小包装单元时,均应进行均匀性检验。

9.4.5 5.定值

符合上述要求后,方可进行定值。

定值的测量方法经方法学考察证明准确可靠。应先研究测量方法、测量过程和样品处理过程所固有的系统误差随机误差,如溶解、分离等过程中被测样品的污染和损失;对测量仪器要定期进行校准,选用具有可溯源的基准物;要有可行的质量保证体系,以保证测量结果的溯源性。

(1)定值原则

在测定一个候选化学标准品/对照品含量时,水分、有机溶剂、无机杂质和有机成分测定结果的总和应为100%。

(2)选用下列方式对候选药品标准物质定值

①采用高准确度的绝对或权威测量方法定值测量时,要求两个以上分析者在不同的实验装置上独立

地进行操作。

②采用两种以上不同原理的已知准确度的可靠方法定值

研究不同原理的测量方法的精密度,对方法的系统误差进行估计,采取必要的手段对方法的准确度进行验证。

③多个实验室协作定值

参加协作标定的实验室应具有候选药品标准物质定值的必备条件及相关实验室资质。每个实验室应采用规定的测量方法。协作实验室的数目或独立定值组数应符合统计学的要求。

9.5 五、候选国家药品标准物质的稳定性考察

1.候选药品标准物质应在规定的储存或使用条件下,定期进行相应特性量值的稳定性考察。

2.稳定性考察的时间间隔可以依据先密后疏的原则。在考察期间内应有多个时间间隔的监测数据。

(1)当候选药品标准物质有多个特性量值时,应选择易变的和有代表性的特性量值进行稳定性考察;

(2)选择不低于定值方法精密度和具有足够灵敏度的测量方法进行稳定性考察;

(3)考察稳定性所用样品应从总样品中随机抽取,抽取的样品数对于总体样品有足够的代表性;

(4)按时间顺序进行的测量结果应在测量方法的随机不确定度范围内波动。

10 附录XVIII J 中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则

(附录XVIII J 中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则由《中华人民共和国药典》(2010年版 第三增补本)新增)

本法用于中药材(包括药材及部分药材饮片)及基原物种的鉴定。

DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术,是传统形态鉴别方法的有效补充。由于不同物种的DNA序列是由腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)四种碱基以不同顺序排列组成,因此对某一特定DNA片段序列进行分析即能够区分不同物种。

中药材DNA条形码分子鉴定通常是以核糖体DNA第二内部转录间隔区(ITS2)注1为主体条形码序列鉴定中药材的方法体系,其中植物类中药材选用ITS2/ITS为主体序列,以叶绿体psbA-trnH注2为辅助序列,动物类中药材采用细胞色素C氧化酶亚基i (COI)注3为主体序列,ITS2为辅助序列。

10.1 一、仪器的一般要求

所用仪器有电子天平、离心机、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪、电泳仪和测序仪。

DNA序列测定用测序仪,是一台具有自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段中碱基顺序或大小,以及定量用精密仪器。测序方法主要采用双脱氧链终止法,又称Sanger法。4种双脱氧核苷酸(ddNTP)的碱基分别用不同的荧光进行标记,在通过毛细管时,不同长度的DNA片段上的4种荧光基团被激光激发,发出不同颜色的荧光,被电荷藕合元件图像传感器(charge-coupled device,CCD)检测系统识别,并直接翻译成DNA序列,获得供试品的峰图文件和序列文件。

10.2 二、测定步骤

本法主要包括供试品处理、DNA提取、DNA条形码序列PCR扩增、电泳检测和序列测定、序列拼接及结果判定,主要步骤如下。

10.2.1 1.供试品处理

按药材和饮片取样法(附录Ⅱ A)取样。为防止外源微生物污染,药材和饮片一般使用75%乙醇擦拭表面后晾干,或采取其他有效去除微生物污染的方法。称取10~100mg备用。供试品具体取样部位根据不同药材特性作出相应规定。

10.2.2 2.DNA提取

DNA的提取包括使用研钵或研磨仪破碎细胞,粉碎成细粉,用试剂盒法进行DNA的分离和纯化等步骤,目前常用试剂盒包括植物基因组DNA提取试剂盒和动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒,实验选用的试剂盒须能够提取到满足后续实验要求的模板DNA。

由于植物类中药材种类繁多,可根据所鉴定的中药材的具体情况对提取方法加以改进。例如:植物细胞内含有大量多糖、多酚等次生代谢产物,这些物质在提取DNA的过程中与DNA共沉淀,形成黏稠的胶状物,难以溶解或氧化产生褐变,严重影响DNA提取的产量与质量,以及后续的PCR扩增实验。但如在提取DNA过程中加入抗氧化剂β-巯基乙醇,则可抑制氧化反应,避免其褐化。再如:PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA提取过程中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖。因此若将PVP和β-巯基乙醇配合使用,能够有效地防止DNA提取过程中多酚及多糖的污染。此外,乙二胺四乙酸(EDTA)能螫合Mg2+或Mn2+,从而抑制DNA酶(DNase)活性,防止DNA被其降解;在天然状态下,DNA与蛋白质以DNA蛋白质复合物(DNP)的形式存在,十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,并与DNA形成复合物,使细胞中的DNP释放出来,该复合物在高盐溶液(>0.7mol/L NaCl)中能充分溶解,存在于液相中,通过有机溶剂抽提,去除蛋白质、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使DNA分离出来。三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)(pH值8.0)溶液可提供一个缓冲环境,防止DNA被降解。

根、根茎、茎木类、皮类 通常根和根茎组织中多酚、多糖含量高,在研磨时多酚极易氧化成醌类,使DNA带有一定颜色,在纯化过程中很难去除,影响后续的PCR反应,所以在提取根及根茎类药材DNA时一定要注意多糖、多酚的去除。提取此类药材DNA时水浴时间一般为90分钟,对于质地坚硬的根、根茎类和茎木类药材,可以延长水浴时间并降低水浴温度,如56℃水浴8~12小时,使得DNA充分释放到缓冲溶液中。此外,根茎类药材由于富含纤维淀粉等贮藏物质,需加大样品量才能提取到足量DNA,可用大体积离心管(5ml或15ml)抽提。皮类中药材组织中富含薄壁组织和纤维等,加液氮不易研磨成细粉,需适当增加样品量,同时应增加β-巯基乙醇和PVP的使用量。

叶、花、全草类 该类药材采用试剂盒法一般都能成功提取其DNA,对于保存时间较久的叶、花、全草类药材可适当增加水浴时间,同时适当降低水浴温度,如56℃水浴8~12小时。

果实、种子类 果实及种子类中药材中多富含油脂,研磨时易被氧化,且易黏着在研钵壁上,损失较大,提取时需增加样品量。另外,对研磨后的材料可用丙酮浸提,去除脂溶性酚类化合物

动物药材 肌肉类动物药材如海龙、蛇类、蛤蚧等,需使用75%乙醇擦拭表面消除外源性污染,待乙醇挥发后进行充分磨碎。含有脂类较多的动物内脏器官如蛤蟆油,首先用不含蛋白酶K和十二烷基硫酸钠SDS)的缓冲液浸泡药材,SDS是一种阴离子表面活性剂,在55~65℃条件下能裂解细胞,释放出核酸;然后在试剂盒消化缓冲液中增加SDS含量,有利于脱去脂类。角甲类药材如龟甲鳖甲鹿茸等,由于DNA含量较低,样品量要适当增大,也可用大体积离心管抽提。壳类药材如石决明瓦楞子蛤壳等,由于存在共生或寄生生物,提取前需进行去除。

10.2.3 3.PCR扩增

植物类中药材及其基原物种扩增ITS2或psbA-trnH序列,动物类中药材及其基原物种扩增COI序列,通用引物及扩增条件如下,特殊规定见各药材项下。

ITS2序列扩增正向引物ITS2F:5'-ATGCGATACTTG-GTGTGAAT-3';反向引物 ITS3R:5'-GACGCTTCTC-CAGACTACAAT-3'。psbA-trnH序列扩增正向引物ps-bAF: 5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3';反向引物trnHR:5'-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3'。COI序列扩增正向引物HC02198: 5'-TAAACTTCAGGGTGAC-CAAAAAATCA-3';反向引物LCO1490:5'-GGTCAA-CAAATCATAAAGATATTGG-3'。

PCR反应体系以25μl为参照,包括:1×PCR缓冲液(不含MgCI2),2.0mmol/L MgCl2,0.2mmol/L dNTPs,0.1μmol/L引物对,模板DNA,1.0 U Taq DNA聚合酶,加灭菌双蒸水至25μl。设置未加模板DNA的PCR反应为阴性对照。

ITS2序列扩增程序:94℃5分钟;94℃30秒,56℃30秒,72℃45秒,35~40个循环;72℃10分钟。psbA-trnH序列扩增程序:94℃5分钟;94℃1分钟,55℃1分钟,72℃1.5分钟,30个循环;72℃7分钟。COI序列扩增程序:94℃1分钟;94℃1分钟,45℃1.5分钟,72℃1.5分钟,5个循环;94℃1分钟,50℃1.5分钟,72℃1分钟,35个循环;72℃5分钟。

10.2.4 4.PCR产物检测

采取琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR产物。电泳后,PCR产物应在相应的DNA条形码序列长度位置(具体见各药材项下)出现一条目的条带,阴性对照应无条带。

在紫外灯下迅速切取目的条带所在位置的凝胶,采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行纯化。

10.2.5 5.测序

使用DNA测序仪对目的条带进行双向测序,PCR扩增引物作为测序引物,测序原理同Sanger测序法。有目的条带的样品在测序仪上进行双向测序。

10.2.6 6.中药材DNA条形码序列获得

(1)序列拼接 对双向测序峰图应用有序列拼接功能的专业软件进行序列拼接,去除引物区。

(2)序列质量与方向 为确保DNA条形码序列的可靠性,需去除测序结果两端信号弱或重叠峰区域,序列方向应与PCR扩增正向引物方向一致,获得相应的DNA序列。

10.2.7 7.结果判定

将获得的序列与国家药品管理部门认可的中药材DNA条形码标准序列比对。

10.3 三、方法学验证

应符合《中国药典》2010年版一部“附录XVIII A中药质量

标准分析方法验证指导原则”相关要求。

10.3.1 1.影响因素考察

考察DNA条形码分子鉴定法的影响因素,包括DNA提取(样品量、水浴温度和水浴时间)、PCR条件(变性时间、退火温度与时间及延伸时间)和产物纯化(考察不同纯化试剂盒),保证实验方法的准确性。

10.3.2 2.方法适用性考察

采用DNA条形码分子鉴定法对20批次以上药材或基原物种进行测定,积累数据,确定种内序列变异大小,保证该测定方法的适用性。

10.3.3 3.基原物种对比验证

分类学家确认的基原物种叶片为对象,采用该方法获得DNA条形码数据,与相应药材产生的DNA条形码数据进行对比,避免内生真菌等污染,保证结果准确性。

10.4 四、注意事项

(1)实验场所应具备分子生物学实验室的基本条件。

(2)本法暂不适用于混合物炮制品的鉴定及硫磺熏蒸等造成不适用的情况。

(3)为防止外源微生物污染,实验前须将实验用具进行高压灭菌,并用75%乙醇擦拭药材表面。有些药材本身含有内生真菌,如果内生真菌存在于药材的外围组织,则选用内部组织进行实验。如果真菌遍布整个药材,植物类药材需选用psbA-trnH条形码(真菌内不含有该基因片段),不能选用ITS2序列。为进一步确保实验结果不被真菌污染,实验者可在GenBank数据库应用BLAST方法对所获ITS2序列进行检验,以确保序列鉴定准确。

(4)本法用于鉴定药材的基原物种,不能确定药用部位。(5)必要时结合其他鉴别方法综合判断。

(6)种内阈值的确定。同一物种的不同样品间存在一定的变异范围,即种内变异阈值。不同物种,不同条形码序列均会影响种内变异范围。各基原物种的种内变异范围(种内遗传距离阈值)应在药材品种项下具体明确。

10.5 【附注】

1. ITS2:ITS(internal transcribed spacer of nuclear ribosomal DNA)为内部转录间隔区,是核糖体RNA(rRNA)基因非转录区的一部分。ITS位于18S rRNA基因和28S rRNA基因之间,中部被5.8S rRNA基因一分为二,即ITS1(thefirst internal transcribed spacer)区和ITS2(the second internal transcribed spacer)区。5.8S、18S和28S进化速率较慢,常用于探讨科级和科级以上等级的系统发育问题。而间隔区ITS(包括ITS1和ITS2)进化速率较快,一般用于研究属间、种间甚至居群间等较低分类等级的系统关系。

2.psbA-trnH:psbA-trnH基因间区是位于叶绿体基因psbA基因和trnH基因之间的一段非编码区,该间区进化速率较快,常用于植物属间、种间的系统发育研究。

3.COI:COI为线粒体基因组的蛋白质编码基因,全称为细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ (cytochrome C oxidase subunit I),由于该基因进化速率较快,常用于分析亲缘关系密切的种、亚种及地理种群之间的系统关系。

11 参考资料

  1. ^ [1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版:第二增补本[M].北京:中国医药科技出版社,2010.
  2. ^ [2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版:第三增补本[M].北京:中国医药科技出版社,2010.

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  • 评论总管
    2020/8/15 2:14:49 | #0
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