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2010年版药典一部附录XIII

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目录

1 拼音

2010 nián bǎn yào diǎn yī bù fù lù XIII

中华人民共和国药典》2010年版一部 附录XIII

2 附录XIII A热原检查法

本法系将一定剂量的供试品,静脉注入家兔体内,在规定时间内,观察家兔体温升高的情况,以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。

2.1 供试用家兔

供试用的家兔应健康合格,体重1.7kg以上,雌兔应无孕。预测体温前7日即应用同一饲料饲养,在此期间内,体重应不减轻,精神、食欲、排泄等不得有异常现象。未曾使用于热原检查的家兔;或供试品判定为符合规定,但组内升温达0.6℃的家兔;或3周内未曾使用的家兔,均应在检查供试品前3~7日内预测体温,进行挑选。挑选试验的条件与检查供试品时相同,仅不注射药液,每隔30分钟测量体温1次,共测8次,8次体温均在38.0~39.6℃的范围内,且最高与最低体温相差不超过0.4℃的家兔,方可供热原检查用。用于热原检查后的家兔,如供试品判定为符合规定,至少应休息48小时方可再供热原检查用,其中升温达0.6℃的家兔应休息2周以上。如供试品判定为不符合规定,则组内全部家兔不再使用。

2.2 试验前的准备

在做热原检查前1~2日,供试用家兔应尽可能处于同一温度的环境中,实验室和饲养室的温度相差不得大于3℃,且应控制在17~25℃,在试验全部过程中,实验室温度变化不得大于3℃,应防止动物骚动并避免噪声干扰。家兔在试验前至少1小时开始停止给食,并置于宽松适宜的装置中,直至试验完毕。测量家兔体温应使用精密度为±0.1℃的测温装置。测温探头或肛温计插入肛门的深度和时间各兔应相同,深度一般约6cm,时间不得少于1.5分钟,每隔30分钟测量体温1次,一般测量2次,两次体温之差不得超过0.2℃,以此两次体温的平均值作为该兔的正常体温。当日使用的家兔,正常体温应在38.0~39.6℃的范围内,且同组各兔间正常体温之差不得超过1℃。

与供试品接触的试验用器皿应无菌无热原。去除热原通常采用于热灭菌法(250℃加热30分钟),也可用其他适宜的方法

2.3 检查法

取适用的家兔3只,测定其正常体温后15分钟以内,自耳静脉缓缓注入规定剂量并温热至约38℃的供试品溶液然后每隔30分钟按前法测量其体温1次,共测6次,以6次体温中最高的一次减去正常体温,即为该兔体温的升高温度(℃)。如3只家兔中有1只体温升高0.6℃或高于0.6℃,或3只家兔体温升高的总和达1.3℃或高于1.3℃,应另取5只家兔复试,检查方法同上。

2.4 结果判断

在初试的3只家兔中,体温升高均低于0.6℃,并且3只家兔体温升高总和低于1.3℃;或在复试的5只家兔中,体温升高0.6℃或高于0.6℃的家兔不超过1只,并且初试、复试合并8只家兔的体温升高总和为3.5℃或低于3.5℃,均判定供试品的热原检查符合规定。

在初试的3只家兔中,体温升高0.6℃或高于0.6℃的家兔超过1只;或在复试的5只家兔中,体温升高0.6℃或高于0.6℃的家兔超过1只;或在初试、复试合并8只家兔的体温升高总和超过3.5℃,均判定供试品的热原检查不符合规定。

当家兔升温为负值时,均以0℃计。

3 附录XIII B无菌检查法

无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染

无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行,其全过程应严格遵守无菌操作,防止微生物污染,防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进行验证,其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验还需对试验环境进行监控。

无菌检查人员必须具备微生物专业知识,并经过无菌技术的培训。

3.1 培养基培养基的制备及培养条件

培养基可按以下处方制备,也可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在2~25℃、避光的环境,若保存于非密闭容器中,一般在3周内使用;若保存于密闭容器中,一般可在1年内使用。

3.1.1 1.硫乙醇酸盐流体培养基

酪胨(胰酶水解)

15.0g

氯化钠

2.5g

葡萄糖

5.0g

新配制的0.1%刃天青溶液

1.0ml

L一胱氨酸

0.5g

琼脂

0.75g

硫乙醇酸钠

0.5g

1000ml

(或硫乙醇酸)

(0.3ml)

酵母浸出粉

5.0g

除葡萄糖和刃天青溶液外,取上述成分混合,微温溶解,调节pH为弱碱性,煮沸,滤清,加入葡萄糖和刃天青溶液,摇匀,调节pH值使灭菌后为7.1±0.2。分装至适宜的容器中,其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层(粉红色)不超过培养基深度的1/2。灭菌。在供试品接种前,培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5,否则,须经100℃水浴加热至粉红色消失(不超过20分钟),迅速冷却,只限加热一次,并防止被污染。

硫乙醇酸盐流体培养基置30~35℃培养。

3.1.2 2.改良马丁培养基

5.0g

磷酸氢二钾

1.0g

酵母浸出粉

2.0g

硫酸镁

0.5g

葡萄糖

20.0g

1000ml

除葡萄糖外,取上述成分混合,微温溶解,调节pH值约为6.8,煮沸,加入葡萄糖溶解后,摇匀,滤清,调节pH值使灭菌后为6.4±0.2.分装,灭菌。

改良马丁培养基置23~28℃培养。

3.1.3 3.选择性培养基

按上述硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基的处方及制法,在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂灭活剂或表面活性剂,其用量同方法验证试验。

3.1.4 4.营养肉汤培养基

10.0g

氯化钠

5.0g

牛肉浸出粉

3.0g

1000ml

取上述成分混合,微温溶解,调节pH为弱碱性,煮沸,滤清,调节pH值使灭菌后为7.2±0.2,分装,灭菌。

3.1.5 5.营养琼脂培养基

按上述营养肉汤培养基的处方及制法,加入14.0g琼脂,调节pH值使灭菌后为7.2±0.2,分装,灭菌。

3.1.6 6.改良马丁琼脂培养基

按改良马丁培养基的处方及制法,加入14.0g琼脂,调节pH值使灭菌后为6.4±0.2,分装,灭菌。

3.2 培养基的适用性检查

无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。无菌性检查 每批培养基随机取不少于5支(瓶),培养14天,应无菌生长

3.3 灵敏度检查

3.3.1 菌种

培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代),并采用适宜的菌种保藏技术,以保证试验菌株的生物学特性。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26 003]

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10 104]

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B) 63 501]

生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B) 64 941]

白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98 001]

黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F) 98 003]

3.3.2 菌液制备

接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上,接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中,30~35℃培养18~24小时;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上,23~28℃培养24~48小时,上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu(菌落形成单位)的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上,23~28℃培养5~7天,加入3~5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱。然后,采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内,用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。

菌液制备后若在室温下放置,应在2小时内使用;若保存在2~8℃,可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2~8℃,在验证过的贮存期内使用。

3.3.3 培养基接种

取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支,分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支,另1支不接种作为空白对照,培养3天;取每管装量为9ml的改良马丁培养基5支,分别接种小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支,另1支不接种作为空白对照,培养5天。逐日观察结果。

3.3.4 结果判断

空白对照管应无菌生长,若加菌的培养基管均生长良好,判该培养基的灵敏度检查符合规定。

3.4 稀释液、冲洗液及其制备方法

稀释液、冲洗液配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

3.4.1 1. 0.1%蛋白胨水溶液

取蛋白胨1.0g,加水1000ml,微温溶解,滤清,调节pH值至7.1±0.2,分装,灭菌。

3.4.2 2.pH7.0氯化钠一蛋白胨缓冲液

磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g,加水1000ml,微温溶解,滤清,分装,灭菌。

根据供试品的特性,可选用其他经验证过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液。

需要,可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。

3.5 方法验证试验

当建立产品的无菌检查法时,应进行方法的验证,以证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查。若该产品的组分或原检验条件发生改变时,检查方法应重新验证。

验证时,按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。

3.5.1 菌种及菌液制备

大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44 102]外,金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同培养基灵敏度检查。大肠埃希菌的菌液制备同金黄色葡萄球菌。

3.5.2 薄膜过滤

取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤,冲洗,在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu的试验菌,过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基中,或将培养基加至滤筒内。另取一装有同体积培养基的容器,加入等量试验菌,作为对照。置规定温度培养3~5天。各试验菌同法操作。

3.5.3 直接接种法

取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8管,分别接入小于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管;取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管,分别接入小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入每支培养基规定的供试品接种量,另1管作为对照,置规定的温度培养3~5天。

3.5.4 结果判断

与对照管比较,如含供试品各容器中的试验菌均生长良好,则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计,照此检查方法和检验条件进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长,则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用,应采用增加冲洗量、增加培养基的用量、使用中和剂、更换滤膜品种等方法,消除供试品的抑菌作用,并重新进行方法验证试验。

方法验证试验也可与供试品的无菌检查同时进行。

3.6 供试品的无菌检查

3.6.1 检验数量

检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。除另有规定外,出厂产品按表1规定;上市产品监督检验按表2、表3规定。表1、表2、表3中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量。一般情况下,供试品无菌检查若采用薄膜过滤法,应增加1/2的最小检验数量作阳性对照用;若采用直接接种法,应增加供试品无菌检查时每个培养基容器接种的样品量作阳性对照用。

3.6.2 检验量

是指一次试验所用的供试品总量(g或ml)。除另有规定外,每份培养基接种的供试品量按表2、表3规定。若每支(瓶)供试品的装量按规定足够接种两份培养基,则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基。采用薄膜过滤法时,检验量应不少于直接接种法的供试品总接种量,只要供试品特性允许,应将所有容器内的全部内容物过滤。阳性对照 应根据供试品特性选择阳性对照菌:无抑菌作用及抗细菌的供试品,以金黄色葡萄球菌为对照菌;抗厌氧菌的供试品,以生孢梭菌为对照菌;抗真菌的供试品,以白色念珠菌为对照菌。阳性对照试验的菌液制备同方法验证试验,加菌量小于100cfu,供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养48~72小时应生长良好。

3.6.3 阴性对照

供试品无菌检查时,应取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作,作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。无菌试验过程中,若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂,应证明其有效性,且对微生物无毒性。

无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。只要供试品性状允许,应采用薄膜过滤法。供试品无菌检查所采用的检验方法和检验条件应与验证的方法相同。

操作时,用适宜的消毒液对供试品容器表面进行彻底消毒。如果容器内有一定的真空度,可用适宜的无菌器材(如带有除菌过滤器的针头),向容器内导入无菌空气,再按无菌操作启开容器取出内容物。

3.7 供试品处理及接种培养基

除另有规定外,按下列方法进行。

3.7.1 1.薄膜过滤法

薄膜过滤法应优先采用封闭式薄膜过滤器,也可使用一般薄膜过滤器。无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45μm,直径约为50mm。根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时,应保证滤膜在过滤前后的完整性。

水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品,其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率,应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后,若需要用冲洗液冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗量一般为100ml,且总冲洗量不得超过1000ml,以避免滤膜上的微生物受损伤

3.7.1.1 水溶液供试品

取规定量,直接过滤,或混合至含适量稀释液的无菌容器内,混匀,立即过滤。如供试品具有抑菌作用或含防腐剂,须用冲洗液冲洗滤膜,冲洗次数一般不少于3次。所用的冲洗量、冲洗方法同方法验证试验。冲洗后,如用封闭式薄膜过滤器,分别将100ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基加入相应的滤筒内。如采用一般薄膜过滤器,取出滤膜,将其分成3等份,分别置于含50ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中,其中一份作阳性对照用。

3.7.1.2 可溶于水的固体制剂供试品

取规定量,加适宜的稀释液溶解或按标签说明复溶,然后照水溶液供试品项下的方法操作。非水溶性制剂供试品 取规定量,直接过滤;或混合溶于含聚山梨酯80或其他适宜乳化剂的稀释液中,充分混合,立即过滤。用含0.1%~1%聚山梨酯80的冲洗液冲洗滤膜至少3次。滤膜于含或不含聚山梨酯80的培养基中培养。接种培养基照水溶液供试品项下的方法操作。

3.7.1.3 可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油剂供试品

取规定量,混合至适量的无菌十四烷酸异丙酯(无菌十四烷酸异丙酯的制备:采用薄膜过滤法过滤除菌。选用孔径为0.22μm的脂溶性滤膜,在140℃于热灭菌2小时)中,剧烈振摇,使供试品充分溶解,如果需要可适当加热,但温度不得超过44℃,趁热迅速过滤。对仍然无法过滤的供试品,于含有适量的无菌十四烷酸异丙酯的供试液中加入不少于100ml的稀释液,充分振摇萃取,静置,取下层水相作为供试液过滤。过滤后滤膜冲洗及接种培养基照非水溶性制剂供试品项下的方法操作。

3.7.1.4 无菌气(喷)雾剂供试品

取规定量,将各容器置至少-20℃的冰室冷冻约1小时。以无菌操作迅速在容器上端钻一小孔,释放抛射剂后再无菌开启容器,并将供试液转移至无菌容器中,然后照水溶液或非水溶性制剂供试品项下的方法操作。装有药物注射器供试品 取规定量,排出注射器中的内容物至无菌容器中,若需要可吸入稀释液或用标签所示的溶剂溶解,然后照水溶液或非水溶性制剂供试品项下的方法操作。同时,应采用直接接种法进行包装中所配带的无菌针头的无菌检查。

3.7.2 2.直接接种法

直接接种法即取规定量的供试品分别接种至各含硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基的容器中。除另有规定外,每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%,同时,硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml,改良马丁培养基每管装量不少于10ml。若供试品具有抑菌作用,可加入适量的无菌中和剂或灭活剂,或加大每个容器的培养基用量。供试品检查时,培养基的用量和高度同方法验证试验。

混悬液等非澄清水溶液供试品 取规定量,接种至各管培养基中。

3.7.2.1 固体制剂供试品

取规定量,直接接种至各管培养基中,或加入适宜的溶剂溶解,或按标签说明复溶后,取规定量接种至各管培养基中。

3.7.2.2 非水溶性制剂供试品

取规定量,混合,加入适量的聚山梨酯80或其他适宜的乳化剂及稀释剂使其乳化,接种至各管培养基中。或直接接种至含聚山梨酯80或其他适宜乳化剂的各管培养基中。

3.7.2.3 培养及观察

上述含培养基的容器按规定的温度培养14天。培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后或在培养过程中,培养基出现浑浊,培养14天后,不能从外观上判断有无微生物生长,可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中,细菌培养2天、真菌培养3天,观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊;或取培养液涂片,染色,镜检,判断是否有菌。

3.7.2.4 结果判断

阳性对照管应生长良好,阴性对照管不得有菌生长。否则,试验无效。

若供试品管均澄清,或虽显浑浊但经确证无菌生长,判供试品符合规定;若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长,判供试品不符合规定,除非能充分证明试验结果无效,即生长的微生物非供试品所含。当符合下列至少一个条件时,方可判试验结果无效:

(1)无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求;

(2)回顾无菌试验过程,发现有可能引起微生物污染的因素;

(3)供试品管中生长的微生物经鉴定后,确证是因无菌试验中所使用的物品和(或)无菌操作技术不当引起的。

试验若经确认无效,应重试。重试时,重新取同量供试品,依法检查,若无菌生长,判供试品符合规定;若有菌生长,判供试品不符合规定。

表1 批出厂产品最少检验数量

供试品

批产量N(个)

接种每种培养基所需的最少检验数量

注射剂

大体积注射剂(>100ml)

≤100

100<N≤500

>500

10%或4个(取较多者)

10个

2%或20个(取较少者)

2%或10个(取较少者)

眼用及其他非注射产品

≤200

>200

5%或2个(取较多者)

10个

桶装固体原料

≤4

4<N≤50

>50

每个容器

20%或4个容器(取较多者)

2%或10个容器(取较多者)

注:若供试品每个容器中的装量不够接种两种培养基,那么表中的最少检验数量加倍。

表2 液体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量

供试品装量V

(ml)

每支供试品接入每种培

养基的最少量

供试品最少检验

数量(瓶或支)

≤1

1<V<5

5≤V<20

20≤V<50

50≤v<100

50≤V<100(静脉给药)

100≤v≤500

v>500

全量

半量

2ml

5ml

10ml

半量

半量

500ml

10①

10

10

10

10

10

6

60①

注:①若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基,那么表中的最少检验数量加倍。

表3 固体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量

供试品装量M

每支供试品接入每种

培养基的最少量

供试品最少检验

数量(瓶或支)

M<50mg

50mg≤M<300mg

300mg≤M<5g

M≥5g

全量

半量

150mg

500mg

10①

10

10

10②

注:①若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基,那么表中的最少检验数量加倍。

②桶装固体原料的最少检验数量为4个包装

4 附录XIII C微生物限度检查法

微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。

微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作,防止再污染,防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。

供试品检查时,如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂,应证明其有效性及对微生物无毒性。

除另有规定外,本检查法中细菌及控制菌培养温度为30~35℃;霉菌、酵母菌培养温度为23~28℃。

检验结果以1g、1ml、10g、10ml或10cm2为单位报告,特殊品种可以最小包装单位报告。

4.1 检验量

检验量即一次试验所用的供试品量(g、ml或cm2)。

除另有规定外,一般供试品的检验量为10g或10ml;膜剂为100cm2;贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品,其检验量应增加20g或20ml(其中10g或10ml用于阳性对照试验)。

检验时,应从2个以上最小包装单位中抽取供试品,大蜜丸还不得少于4丸,膜剂还不得少于4片。

一般应随机抽取不少于检验用量(两个以上最小包装单位)的3倍量供试品。

4.2 供试液的制备

根据供试品的理化特性与生物学特性,采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时,应均匀加热,且温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基,不得超过1小时。除另有规定外,常用的供试液制备方法如下。

4.2.1 1.液体供试品

取供试品10ml,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,混匀,作为1:10的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。

4.2.2 2.固体、半固体或黏稠性供试品

取供试品10g,加pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml,用匀浆仪或其他适宜的方法,混匀,作为1: 10的供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80,并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。

4.2.3 3.需用特殊方法制备供试液的供试品

4.2.3.1 (1)非水溶性供试品

方法1 取供试品5g(或5ml),加至含溶化的(温度不超过45℃)5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中,用无菌玻棒搅拌成团后,慢慢加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,边加边搅拌,使供试品充分乳化,作为1: 20的供试液。

方法2 取供试品10g,加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯(制法见2010年版药典一部附录XIII B无菌检查法中供试品的无菌检查项下)和无菌玻璃珠的适宜容器中,必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量,充分振摇,使供试品溶解。然后加入45℃的pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液100ml,振摇5~10分钟,萃取,静置使油水明显分层,取其水层作为1: 10的供试液。

4.2.3.2 (2)膜剂供试品

取供试品100cm2,剪碎,加100ml的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(必要时可增加稀释液),浸泡,振摇,作为1: 10的供试液。

4.2.3.3 (3)肠溶及结肠溶制剂供试品

取供试品10g,加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液(用于肠溶制剂)或pH7.6无菌磷酸盐缓冲液(用于结肠溶制剂)至100ml,置45℃水浴中,振摇,使溶解,作为1:10的供试液。

4.2.3.4 (4)气雾剂喷雾剂供试品

取规定量供试品,置冰冻室冷冻约1小时,取出,迅速消毒供试品开启部位,用无菌钢锥在该部位钻一小孔,放至室温,并轻轻转动容器,使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液,加至适量的pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液(若含非水溶性成分,加适量的无菌聚山梨酯80)中,混匀,取相当于10g或10ml的供试品,再稀释成1:10的供试液。

4.2.3.5 (5)贴膏剂供试品

取规定量供试品,去掉贴膏剂的保护层,放置在无菌玻璃或塑料片上,粘贴面朝上。用适宜的无菌多孔材料(如无菌纱布)覆盖贴剂的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。然后将其置于适宜体积并含有表面活性剂(如聚山梨酯80或卵磷脂)的稀释剂中,用力振荡至少30分钟,制成供试液。贴膏剂也可采用其他适宜的方法制备成供试液。

4.2.3.6 (6)具抑菌活性的供试品

当供试品有抑菌活性时,采用下列方法进行处理,以消除供试液的抑菌活性,再依法检查。常用的方法如下。

①培养基稀释法 取规定量的供试液,至较大量的培养基中,使单位体积内的供试品含量减少,至不含抑菌作用。测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时,取同稀释级的供试液2ml,每1ml供试液可等量分注多个平皿,倾注琼脂培养基,混匀,凝固,培养,计数。每1ml供试液所注的平皿中生长的菌落数之和即为1ml的菌落数,计算每1ml供试液的平均菌落数,按平皿法计数规则报告菌数;控制菌检查时,可加大增菌培养基的用量。②离心沉淀法 取一定量的供试液,500转/分钟离心3分钟,取全部上清液混合。用于细菌检查。

③薄膜过滤法 见细菌、霉菌及酵母菌计数项下的“薄膜过滤法”。

④中和法 凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品,可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。中和剂或灭活剂可加在所用的稀释液或培养基中。

4.3 细菌、霉菌及酵母菌计数

4.3.1 计数培养基的适用性检查

细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适用性检查,成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。

4.3.1.1 菌种

试验用菌株的传代次数不得超过5代(从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代),并采用适宜的菌种保藏技术进行保存,以保证试验菌株的生物学特性。

大肠埃希菌(Fscherichia coli)[CMCC(B) 44 102]

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26 003)]

枯草芽孢杆菌(Bacillus szabtilis)[CMCC(B) 63 501]

白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98 001]

黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F) 98 003]

4.3.1.2 菌液制备

接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上,培养18~24小时;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上,培养24~48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50~100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上,培养5~7天,加入3~5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱。然后,采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内,用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50~100cfu的孢子悬液。

菌液制备后若在室温下放置,应在2小时内使用;若保存在2~8℃,可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2~8℃,在验证过的贮存期内使用。

4.3.1.3 适用性检查

取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各50~100cfu,分别注入无菌平皿中,立即倾注营养琼脂培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,混匀,凝固,置30~35℃培养48小时,计数;取白色念珠菌、黑曲霉各50~100cfu,分别注入无菌平皿中,立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,混匀,凝固,置23~28℃培养72小时,计数;取白色念珠菌50~100cfu,注入无菌平皿中,立即倾注酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基,平行制备2个平皿,混匀,凝固,置23~28℃培养72小时,计数。同时,用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。

4.3.1.4 结果判定

若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%,且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致,判该培养基的适用性检查符合规定。

4.3.2 计数方法的验证

当建立产品的微生物限度检查法时,应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证,以确认所采用的方法适合于该产品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时,计数方法应重新验证。

验证时,按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。

4.3.2.1 菌种及菌液制备

同计数培养基的适用性检查。

4.3.2.2 验证方法

验证试验至少应进行3次独立的平行试验,并分别计算各试验菌每次试验的回收率。

(1)试验组 平皿法计数时,取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50~100cfu试验菌,分别注入平皿中,立即倾注琼脂培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时,取规定量试验可能用的最低稀释级供试液,过滤,冲洗,在最后一次的冲洗液中加入50~100cfu试验菌,过滤,按薄膜过滤法测定其菌数。

(2)菌液组 测定所加的试验菌数。

(3)供试品对照组 取规定量供试液,按菌落计数方法测定供试品本底菌数。

(4)稀释剂对照组 若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时,应增加稀释剂对照组,以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时,可用相应的稀释液替代供试品,加入试验菌,使最终菌浓度为每1ml供试液含50~100cfu,按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。

4.3.2.3 结果判断

在3次独立的平行试验中,稀释剂对照组的菌数回收率(稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率)应均不低于70%。若试验组的菌数回收率(试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率)均不低于70%,照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数;若任一次试验中试验组的菌数回收率低于70%,应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法(常见干扰物的中和剂或灭活方法见表1)等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性,并重新进行方法验证。

表1 常见干扰物的中和剂或灭活方法

干扰物

可选用的中和剂或灭活方法

戊二醛

亚硫酸氢钠

酚类、乙醇、吸附

稀释法

醛类

稀释法、甘氨酸、硫代硫酸

季铵类化合物(QACs)、对羟基苯甲酸

卵磷脂、聚山梨酯

汞类制剂

亚硫酸氢钠、巯基乙酸盐、硫代硫酸盐

双胍类化合物

卵磷脂

碘酒、洗必泰

聚山梨酯

卤化

硫代硫酸盐

乙二胺四乙酸(EDTA)

镁或钙离子

磺胺

对氨基苯甲酸

β-内酰胺类抗生素

β-内酰胺酶

若没有适宜的方法消除供试品的抑菌活性,那么验证试验中微生物回收的失败可看成是因供试品的抗菌活性引起的,同时表明该供试品不能被试验菌污染。但是,供试品也可能仅对试验用菌株具有抑制作用,而对其他菌株没有抑制作用。因此,根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则,在不影响检验结果判断的前提下,应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行方法验证试验。若验证试验符合要求,应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检验。

计数方法验证时,采用上述方法若还存在一株或多株试验菌的回收率达不到要求,那么选择回收率最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检验。

验证试验也可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。

4.3.3 供试品检查

计数方法包括平皿法和薄膜过滤法。检查时,按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。按计数方法的验证试验确认的程序进行供试液制备。用稀释液稀释成1: 10、1: 102、1: 103等稀释级的供试液。

4.3.3.1 1.平皿法

根据菌数报告规则取相应稀释级的供试液1ml,置直径90mm的无菌平皿中,注入15~20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基,混匀,凝固,倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。

阴性对照试验 取试验用的稀释液1ml,置无菌平皿中,注入培养基,凝固,倒置培养。每种计数用的培养基各制备2个平板,均不得有菌生长。

4.3.3.1.1 培养和计数

除另有规定外,细菌培养3天,霉菌、酵母菌培养5天,逐日观察菌落生长情况,点计菌落数,必要时,可适当延长培养时间至7天进行菌落计数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后,计算各稀释级供试液的平均菌落数,按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15,则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。

一般营养琼脂培养基用于细菌计数;玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数;酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。在特殊情况下,若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌,则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数,与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较,以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果。

蜂蜜王浆的液体制剂,用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数,用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数,合并计数。

4.3.3.1.2 菌数报告规则

细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于300cfu、霉菌宜选取平均菌落数小于100cfu的稀释级,作为菌数报告(取两位有效数字)的依据。以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、1ml或10cm2供试品中所含的菌数。如各稀释级的平板均无菌落生长,或仅最低稀释级的平板有菌落生长,但平均菌落数小于1时,以<1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。

4.3.3.2 2.薄膜过滤法

采用薄膜过滤法,滤膜孔径应不大于0.45μm,直径一般为50mm,若采用其他直径的滤膜,冲洗量应进行相应的调整。选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时,应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品,其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率,应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后,若需要用冲洗液冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗量为100ml。总冲洗量不得超过1000ml,以避免滤膜上的微生物受损伤。

取相当于每张滤膜含1g、1ml或10cm2供试品的供试液,加至适量的稀释剂中,混匀,过滤。若供试品每1g、1ml或10cm2所含的菌数较多时,可取适宜稀释级的供试液1ml进行试验。用pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜,冲洗方法和冲洗量同“计数方法的验证”。冲洗后取出滤膜,菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。

4.3.3.2.1 阴性对照试验

取试验用的稀释液1ml照上述薄膜过滤法操作,作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。

4.3.3.2.2 培养和计数

培养条件和计数方法同平皿法,每片滤膜上的菌落数应不超过100cfu。

4.3.3.2.3 菌数报告规则

以相当于1g、1ml或10cm2供试品的菌落数报告菌数;若滤膜上无菌落生长,以<1报告菌数(每张滤膜过滤1g、1ml或10cm2供试品),或<1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。

4.4 控制菌检查

4.4.1 控制菌检查用培养基的适用性检查

控制菌检查用的培养基应进行培养基的适用性检查,成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。

4.4.1.1 菌种

对试验菌种的要求同计数培养基的适用性检查。

大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B) 44 102]

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26 003]

乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)[CMCC(B) 50 094]

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10 104]

生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B) 64 941]

白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98 001]

4.4.1.2 菌液制备

接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上,生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中,培养18~24小时;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上,培养24~48小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10~100cfu的菌悬液。

菌悬液在室温下放置应在2小时内使用,若保存在2~8℃可在24小时内使用。

4.4.1.3 适用性检查

控制菌检查用培养基的适用性检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示能力的检查。各培养基的检测项目及所用菌株见表2。

4.4.1.4 液体培养基促生长能力检查

分别接种不大于100cfu的试验菌(表2)于被检培养基和对照培养基中,在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较,被检培养基管试验菌应生长良好。

4.4.1.5 固体培养基促生长能力检查

取试验菌各0.1ml(含菌数50~100cfu)分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上,在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。

4.4.1.6 培养基抑制能力检查

接种不少于100cfu的试验菌(表2)于被检培养基中,在相应控制菌检查规定的培养温度及最长时间下培养,试验菌应不得生长。

4.4.1.7 固体培养基指示能力检查

取试验菌各0.1ml(含菌数不大于100cfu)(表2)分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上,在相应控制菌检查规定的培养温度及时间下培养。被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。

4.4.1.8 液体培养基指示能力检查

分别接种不大于100cfu的试验菌(表2)于被检培养基和对照培养基中,在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较,被检培养基管试验菌生长情况、指示剂反应等应与对照培养基一致。

4.4.1.9 控制菌检查方法的验证

当建立产品的微生物限度检查法时,应进行控制菌检查方法的验证,以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时,检查方法应重新验证。

验证时,依各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应验证的菌株,验证大肠菌群检查法时,采用大肠埃希菌作为验证菌株。验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。

4.4.1.10 菌种及菌液制备

同控制菌检查用培养基的适用性检查。验证方法 取规定量供试液及10~100cfu试验菌加入增菌培养基中,依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时,取规定量供试液,过滤,冲洗,试验菌应加在最后一次冲洗液中,过滤后,注入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。

表2 控制菌检查用培养基的促生长能力、抑制能力及指示能力检查

控制菌检查

培养基

特性

试验菌株

大肠埃希菌

胆盐乳糖培养基

4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基

曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基

促生长能力

抑制能力

促生长能力+指示能力

促生长能力+指示能力

大肠埃希菌

金黄色葡萄球菌

大肠埃希菌

大肠埃希菌

大肠菌群

乳糖胆盐发酵培养基

乳糖发酵培养基

曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基

促生长能力

抑制能力

促生长能力+指示能力

促生长能力+指示能力

大肠埃希菌

金黄色葡萄球菌

大肠埃希菌

大肠埃希菌

沙门菌

营养肉汤培养基

硫磺酸钠亮绿培养基

胆盐硫乳琼脂培养基或沙门、志贺菌属琼脂培养基

曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基

三糖铁琼脂培养基

促生长能力

促生长能力

抑制能力

促生长能力+指示能力

促生长能力+指示能力

指示能力

乙型副伤寒沙门菌

乙型副伤寒沙门菌

金黄色葡萄球菌

乙型副伤寒沙门菌

乙型副伤寒沙门菌

乙型副伤寒沙门菌

铜绿假单胞菌

胆盐乳糖培养基

溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基

绿脓菌素测定用培养基

促生长能力

抑制能力

促生长能力

抑制能力

促生长能力+指示能力

铜绿假单胞菌

金黄色葡萄球菌

铜绿假单胞菌

大肠埃希菌

铜绿假单胞菌

金黄色葡萄球菌

亚碲酸盐肉汤培养基

卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基

促生长能力

抑制能力

促生长能力+指示能力

抑制能力

金黄色葡萄球菌

大肠埃希菌

金黄色葡萄球菌

大肠埃希菌

梭菌

梭菌增菌培养基

哥伦比亚琼脂培养基

促生长能力

促生长能力

生孢梭菌

生孢梭菌

白色念珠菌

沙氏葡萄糖液体培养基

沙氏葡萄糖琼脂培养基

念珠菌显色培养基

1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基

促生长能力

促生长能力+指示能力

促生长能力+指示能力

抑制能力

促生长能力+指示能力

白色念珠菌

白色念珠菌

白色念珠菌

大肠埃希菌

白色念珠菌

4.4.1.11 结果判断

若上述试验检出试验菌,按此供试液制备法和控制茵检查法进行供试品的该控制菌检查;若未检出试验菌,应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性,并重新进行方法验证。

验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。

4.4.2 供试品检查

供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行。

4.4.2.1 阳性对照试验

阳性对照试验方法同供试品的控制菌检查,对照菌的加菌量为10~100cfu。阳性对照试验应检出相应的控制茵。

4.4.2.2 阴性对照试验

取稀释液10ml照相应控制菌检查法检查,作为阴性对照。阴性对照应无菌生长。

取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2),直接或处理后接种至适量(不少于100ml)的胆盐乳糖培养基中,培养18~24小时,必要时可延长至48小时。取上述培养物0.2ml,接种至含5ml MUG培养基的试管内,培养,于5小时、24小时在366nm紫外光下观察,同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光,为MUG阳性;不呈现荧光,为MUG阴性。观察后,沿培养管的管壁加人数滴靛基质试液,液面呈玫瑰红色,为靛基质阳性;呈试剂本色,为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。

如MUG阳性、靛基质阳性,判供试品检出大肠埃希菌;如MUG阴性、靛基质阴性,判供试品未检出大肠埃希菌;如MUG阳性、靛基质阴性,或MUG阴性、靛基质阳性,则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上,培养18~24小时。

若平板上无菌落生长或生长的菌落与表3所列的菌落形态特征不符,判供试品未检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与表3所列的菌落形态特征相符或疑似,应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的鉴定试验,确认是否为大肠埃希菌。

表3大肠埃希菌菌落形态特征

培养基

菌落形态

曙红亚甲蓝琼脂

紫黑色,浅紫色、蓝紫色或粉红色,菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心,圆形,稍凸起,边缘整

齐,表面光滑,湿润,常有金属光泽

麦康凯琼脂

鲜桃红色或微红色,菌落中心里深桃红色,圆形,扁平,边缘整齐,表面光滑,湿润

4.4.2.2.1 (2)大肠菌群(Coliform)

取含适量(不少于10ml)的乳糖胆盐发酵培养基管3支,分别加入1:10的供试液1ml(含供试品0.1g或0.1ml)、1:100的供试液1ml(含供试品0.01g或0.01ml)、1:1000的供试液Iml(含供试品0.001g或0.001ml),另取1支乳糖胆盐发酵培养基管加入稀释液1ml作为阴性对照管。培养18~24小时。

乳糖胆盐发酵管若无菌生长或有菌生长但不产酸产气,判该管未检出大肠菌群;若产酸产气,应将发酵管中的培养物分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上,培养18~24小时。

若平板上无菌落生长,或生长的菌落与表4所列的菌落形态特征不符或为非革兰阴性无芽孢杆菌,判该管未检出大肠菌群;若平板上生长的菌落与表4所列的菌落形态特征相符或疑似,且为革兰阴性无芽孢杆菌,应进行确证试验

表4大肠菌群菌落形态特征

培养基

菌落形态

曙红亚甲蓝琼脂

紫黑色、紫红色、红色或粉红色,圆形,扁平或稍凸起,边缘整齐,表面光滑,湿润

麦康凯琼脂

鲜桃红色或粉红色,圆形,扁平或稍凸起,边缘整齐,表面光滑,湿润

确证试验 从上述分离平板上挑选4~5个疑似菌落,分别接种于乳糖发酵管中,培养24~48小时。若产酸产气,判该乳糖胆盐发酵管检出大肠菌群,否则判未检出大肠菌群。

根据大肠菌群的检出管数,按表5报告1g或1ml供试品中的大肠菌群数。

表5可能的大肠菌群数

各供试品量的检出结果

可能的大肠菌群数N

0.1g或0.1ml

0.01g或0.01ml

0.001g或0.001ml

(个/g或ml)

+

+

+

-

+

+

-

-

+

-

-

-

>103

102<N<103

10<N<102

<10

注:+代表检出大肠菌群;一代表来检出大肠菌群。

4.4.2.2.2 (3)沙门菌(Satmonella)

取供试品10g或10ml,直接或处理后接种至适量(不少于200ml)的营养肉汤培养基中,用匀浆仪或其他适宜方法混匀,培养18~24小时。

取上述培养物1ml,接种于10ml四硫磺酸钠亮绿培养基中,培养18~24小时后,分别划线接种于胆盐硫乳琼脂(或沙门、志贺菌属琼脂)培养基和麦康凯琼脂(或曙红亚甲蓝琼脂)培养基的平板上,培养18~24小时(必要时延长至40~48小时)。若平板上无菌落生长或生长的菌落不同于表6所列的特征,判供试品未检出沙门菌。

若平板上生长的菌落与表6所列的菌落形态特征相符或疑似,用接种针挑选2~3个菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种,培养18~24小时,如斜面未见红色、底层未见黄色;或斜面黄色、底层无黑色,判供试品未检出沙门菌。否则,应取三糖铁琼脂培养基斜面的培养物进行适宜的鉴定试验,确认是否为沙门菌。

表6沙门菌菌落形态特征

培养基

菌落形态

胆盐硫乳琼脂

无色至浅橙色,半透明,菌落中心带黑色或全部黑色或无黑色

沙门、志贺菌属琼脂

无色至淡红色,半透明或不透明,菌落中心有时带黑褐色

曙红亚甲蓝琼脂

无色至浅橙色,透明或半透明,光滑湿润的圆形菌落

麦康凯琼脂

无色至浅橙色,透明或半透明,菌落中心有时为暗色

4.4.2.2.3 (4)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aErug2nosa)

取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2),直接或处理后接种至适量(不少于100ml)的胆盐乳糖培养基中,培养18~24小时。取上述培养物,划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上,培养18~24小时。

铜绿假单胞菌典型菌落呈扁平、无定形、周边扩散、表面湿润,灰白色,周围时有蓝绿色素扩散。如平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符,判供试品未检出铜绿假单胞菌。如平板生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似,应挑选2~3个菌落,分别接种于营养琼脂培养基斜面上,培养18~24小时。取斜面培养物进行革兰染色、镜检及氧化酶试验。

氧化酶试验 取洁净滤纸片置于平皿内,用无菌玻棒取斜面培养物涂于滤纸片上,滴加新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液,在30秒内若培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性,否则为阴性。

若斜面培养物为非革兰阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性,均判供试品未检出铜绿假单胞菌。否则,应进行绿脓菌素试验。

绿脓菌素( Pyocyanin)试验 取斜面培养物接种于PDP琼脂培养基斜面上,培养24小时,加三氯甲烷3~5ml至培养管中,搅碎培养基并充分振摇。静置片刻,将三氯甲烷相移至另一试管中,加入1mol/L盐酸试液约1ml,振摇后,静置片刻,观察。若盐酸溶液呈粉红色,为绿脓菌素试验阳性,否则为阴性。同时用未接种的PDP琼脂培养基斜面同法作阴性对照,阴性对照试验应呈阴性。

若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阳性,判供试品检出铜绿假单胞菌。若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阴性,应继续进行适宜的鉴定试验,确认是否为铜绿假单胞菌。

4.4.2.2.4 (5)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)

取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2),直接或处理后接种至适量(不少于100ml)的亚碲酸钠(钾)肉汤(或营养肉汤)培养基中,培养18~24小时,必要时可延长至48小时。取上述培养物,划线接种于卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上,培养24~72小时。若平板上无菌落生长或生长的菌落不同于表7所列特征,判供试品未检出金黄色葡萄球菌。

表7 金黄色葡萄球菌菌落形态特征

培养基

菌落形态

甘露醇氯化钠琼脂

金黄色,圆形凸起,边缘整齐,外围有黄色环,菌落直径0.7~1mm

卵黄氯化钠琼脂

金黄色,圆形凸起,边缘整齐,外围有卵磷脂分解的乳浊圈,菌落直径1~2mm

若平板上生长的菌落与表7所列的菌落特征相符或疑似,应挑选2~3个菌落,分别接种于营养琼脂培养基斜面上,培养18~24小时。取营养琼脂培养基的培养物进行革兰染色,并接种于营养肉汤培养基中,培养18~24小时,作血浆凝固酶试验。

血浆凝固酶试验 取灭菌小试管3支,各加入血浆和无菌水混合液(1:1)0.5ml,再分别加入可疑菌株的营养肉汤培养物(或由营养琼脂培养基斜面培养物制备的浓菌悬液)0.5ml、金黄色葡萄球菌营养肉汤培养物(或由营养琼脂培养基斜面培养物制备的浓菌悬液)0.5ml、营养肉汤或0.9%无菌氯化钠溶液0.5ml,即为试验管、阳性对照管和阴性对照管。将3管同时培养,3小时后开始观察直至24小时。阴性对照管的血浆应流动自如,阳性对照管血浆应凝固,若试验管血浆凝固为血浆凝固酶试验阳性,否则为阴性。如阳性对照管或阴性对照管不符合规定时,应另制备血浆,重新试验。若上述疑似菌为非革兰阳性球菌、血浆凝固酶试验阴性,判供试品未检出金黄色葡萄球菌。

4.4.2.2.5 (6)梭菌(Clostridium)

取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2)2份,其中1份置80℃保温10分钟后迅速冷却。上述2份供试液直接或处理后分别接种至100ml的梭菌增菌培养基中。置厌氧条件下培养48小时。取上述每一培养物0.2ml,分别涂抹接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基平板上,置厌氧条件下培养48~72小时。若平板上无菌落生长,判供试品未检出梭菌;若平板上有菌落生长,应挑选2~3个菌落分别进行革兰染色和过氧化氢酶试验。

过氧化氢酶试验 取上述平板上的菌落,置洁净玻片上,滴加3%过氧化氢试液,若菌落表面有气泡产生,为过氧化氯酶试验阳性,否则为阴性。

若上述可疑菌落为革兰阳性梭菌,有或无卵圆形或球形的芽孢,过氧化氢酶试验阴性,判供试品检出梭菌,否则判供试品未检出梭菌。

取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2)直接或处理后接种至适量(不少于100ml)的沙氏葡萄糖液体培养基中,培养48~72小时。取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上,培养24~48小时(必要时延长至72小时)。

白色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的菌落呈乳白色,偶见淡黄色,表面光滑有浓酵母气味,培养时间稍久则菌落增大,颜色变深、质地变硬或有皱褶。若平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符,判供试品未检出白色念珠菌。如平板上生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似,应挑选2~3个菌落分别接种至念珠菌显色培养基平板上,培养24~48小时(必要时延长至72小时)。若平板上无绿色或翠绿色的菌落生长,判供试品未检出白色念珠菌。若平板上生长的菌落为绿色或翠绿色,挑取相符或疑似的菌落接种于1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基上,培养24~48小时。取培养物进行染色,镜检及芽管试验。

芽管试验 挑取1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基上的培养物,接种于加有一滴血清的载玻片上,盖上盖玻片,置湿润的平皿内,于35~37℃培养1~3小时,置显微镜下观察孢子上有否长出短小芽管。

若上述疑似菌为非革兰阳性菌,显微镜下未见厚膜孢子、假菌丝和芽管,判供试品未检出白色念珠菌。

4.4.2.3 结果判断

供试品检出控制菌或其他致病菌时,按一次检出结果为准,不再复试。

供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数其中任何一项不符合该品种项下的规定,应从同一批样品中随机抽样,独立复试两次,以3次结果的平均值报告菌数。

若供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数、控制菌三项检验结果均符合该品种项下的规定,判供试品符合规定;若其中任何一项不符合该品种项下的规定,判供试品不符合规定。稀释液

稀释液配制后,应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

1.pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液 照无菌检查法(2010年版药典一部附录XIII B)制备。

2.pH6.8无菌磷酸盐缓冲液、pH7.6无菌磷酸盐缓冲液按缓冲液(2010年药典一部附录XV D)配制后,过滤,分装,灭菌。

如需要,可在上述稀释液灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。

3. 0.9%无菌氯化钠溶液 取氯化钠9.0g,加水溶解使成1000ml,过滤,分装、灭菌。

4.5 培养基及其制备方法

培养基可按以下处方制备,也可使用按该处方生产的符合要求的脱水培养基。配制后,应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

4.5.1 1.营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基及改良马丁琼脂培养基

照无菌检查法(2010年版药典一部附录XIII B)制备。

4.5.2 2.玫瑰红钠琼脂培养基

5.0g

玫瑰红钠

0.0133g

葡萄糖

10.0g

琼脂

14.0g

磷酸二氢钾

1.0g

1000ml

硫酸镁

0.5g

除葡萄糖、玫瑰红钠外,取上述成分,混合,微温溶解,滤过,加入葡萄糖、玫瑰红钠,分装,灭菌。

4.5.3 3.酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD

10.0g

琼脂

14.0g

酵母浸出粉

5.0g

1000ml

葡萄糖

20.0g

除葡萄糖外,取上述成分,混合,微温溶解,滤过,加入葡萄糖,分装,灭菌。

4.5.4 4.胆盐乳糖培养基(BL)

20.0g

磷酸二氢钾

1.3g

乳糖

5.0g

牛胆

2.0g

氯化钠

5.0g

(或去氧胆酸钠

(0.5g)

磷酸氢二钾

4.0g

1000ml

除乳糖、牛胆盐(或去氧胆酸钠)外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.4±0.2,煮沸,滤清,加入乳糖、牛胆盐(或去氧胆酸钠),分装,灭菌。

4.5.5 5.乳糖胆盐发酵培养基

20.0g

0.04%溴甲酚紫指示液

25ml

乳糖

10.0g

1000ml

牛胆盐

5.0g

除0.04%溴甲酚紫指示液外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.4±0.2,加入0.04%溴甲酚紫指示液,根据要求的用量分装于含倒管的试管中。灭菌。所用倒管的规格应保证产气结果的观察。

4.5.6 6.曙红亚甲蓝琼脂培养基(EMB)

营养琼脂培养基

100ml

曙红钠指示液

2ml

20%乳糖溶液

5ml

亚甲蓝指示液

1.3~1.6ml

取营养琼脂培养基,加热溶化后,冷至60℃,按无菌操作

加入灭菌的其他3种溶液,摇匀,倾注平皿。

4.5.7 7.麦康凯琼脂培养基(MacC)

20.0g

1%中性红指示液

3ml

乳糖

10.0g

琼脂

14.0g

牛胆盐

5.0g

1000ml

氯化钠

5.0g

除乳糖、1%中性指示液、牛胆盐及琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.2±0.2,加入琼脂,加热溶化后,再加入其余各成分,摇匀,分装,灭菌,冷至约60℃,倾注平皿。

4.5.8 8. 4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-methylumbelliferyi-β-D-glucuronide,MUG)培养基

10.0g

磷酸二氢钾(无水)

0.9g

硫酸锰

0.5mg

磷酸氢二钠(无水)

6.2g

硫酸锌

0.5mg

亚硫酸

40mg

硫酸镁

0.1g

去氧胆酸钠

1.0g

氯化钠

5.0g

MUG

75mg

氯化钙

50mg

1000ml

除MUG外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.3±0.1,加入MUG,溶解,每管分装5ml,灭菌。

4.5.9 9.三糖铁琼脂培养基(TSI)

20.0g

硫酸亚铁

0.2g

牛肉浸出粉

5.0g

硫代硫酸钠

0.2g

乳糖

10.0g

0.2%酚磺酞指示液

12.5ml

蔗糖

10.0g

琼脂

12.0g

葡萄糖

1.0g

1000ml

氯化钠

5.0g

除三种糖、0.2%酚磺酞指示液、琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.3±0.1,加入琼脂,加热溶化后,再加入其余各成分,摇匀,分装,灭菌,制成高底层(2~3cm)短斜面。

4.5.10 10.四硫磺酸钠亮绿培养基(TTB)

5.0g

硫代硫酸钠

30.0g

牛胆盐

1.0g

1000ml

碳酸钙

10.0g

取上述成分,混合,微温溶解,灭菌。

临用前,取上述培养基,每10ml加入碘试液0.2ml和亮绿试液0.1ml,混匀。

4.5.11 11.沙门、志贺菌属琼脂培养基(SS)

5.0g

硫代硫酸钠

8.5g

牛肉浸出粉.

5.0g

中性红指示液

2.5ml

乳糖

10.0g

亮绿试液

0.33ml

牛胆盐

8.5g

琼脂

16.0g

枸橼酸钠

8.5g

1000ml

枸橼酸铁铵

1.0g

除乳糖、中性红指示液、琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.2±0.1,滤过,加入琼脂,加热溶化后,再加入其余各成分,摇匀,灭菌,冷至60℃,倾注平皿。

4.5.12 12.胆盐硫乳琼脂培养基(DHL)

20.0g

枸橼酸钠

1.Og

牛肉浸出粉

3.0g

枸橼酸铁铵

1.0g

乳糖

10.0g

中性红指示液

3ml

蔗糖

10.0g

琼脂

16.0g

去氧胆酸钠

1.0g

1000ml

硫代硫酸钠

2.3g

除糖、指示液及琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.2±0.1,加入琼脂,加热溶化后,再加入其余成分,摇匀,冷至60℃,倾注平皿。

4.5.13 13.溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基

10.0g

溴化十六烷基三甲铵

0.3g

牛肉浸出粉

3.0g

琼脂

14.0g

氯化钠

5.0g

1000ml

除琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.5±0.1,加入琼脂,加热溶化后,分装,灭菌,冷至60℃,倾注平皿。

4.5.14 14.亚碲酸盐肉汤培养基

临用前,取灭菌的营养肉汤培养基,每100ml中加入新配制的1%亚碲酸钠(钾)试液0.2ml,混匀,即得。

4.5.15 15.卵黄氯化钠琼脂培养基

6.0g

10%氯化钠卵黄液

100ml

牛肉浸出粉

1.8g

琼脂

14.0g

氯化钠

30.0g

650ml

除10%氯化钠卵黄液外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.6±0.1,灭菌,待冷至约60℃,以无菌操作加入10%氯化钠卵黄液,充分振摇,倾注平皿。

10%氯化钠卵黄液的制备 取新鲜鸡蛋1个,以无菌操作取出卵黄,放人10%无菌氯化钠溶液100ml中,充分振摇,即得。

4.5.16 16.甘露醇氯化钠琼脂培养基

10.0g

酚磺酞指示液

2.5ml

牛肉浸出粉

1.0g

琼脂

14.0g

甘露醇

10.0g

1000ml

氯化钠

75.0g

除甘露醇、酚磺酞指示液及琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.4±0.2,加入琼脂,加热溶化后,滤过,分装,灭菌,冷至60℃,倾注平皿。

4.5.17 17.乳糖发酵培养基

20.0g

乳糖

10.0g

0.04%溴甲酚紫指示液

25ml

1000ml

除0.04%溴甲酚紫指示液外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.2±0.2,加入指示液,分装于含倒管的小试管中,每管3ml。灭菌。

4.5.18 18.绿脓菌素(Pyocyanin)测定用培养基(PDP琼脂培养基)

20.0g

甘油

10ml

氯化镁(无水)

1.4g

琼脂

14.0g

硫酸钾(无水)

10.0g

1000ml

取胨、氯化镁、硫酸钾和水混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.3±0,1,加入甘油及琼脂,加热溶化,混匀,分装于试管,灭菌,置成斜面。

4.5.19 19.梭菌增菌培养基

牛肉浸出粉

10.0g

盐酸半胱氨酸

0.5g

10.0g

氯化钠

5.0g

酵母浸出粉

3.0g

醋酸钠

3.0g

可溶性淀粉

1.0g

琼脂

0.5g

葡萄糖

5.0g

1000ml

取上述成分,混合,加热煮沸使溶解,调节pH值使灭菌后为6.8±0.2,加热溶化,滤过,分装,灭菌。

4.5.20 20.哥伦比亚琼脂培养基

酪蛋白胰酶消化

10. Og

胃酶消化物

5.Og

心胰酶消化物

3.Og

酵母浸出粉

5. Og

玉米淀粉

1.Og

氯化钠

5.Og

琼脂

1 5.Og

1000ml

除琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.3±0.2,加入琼脂,加热溶化,滤过,分装,灭菌,冷至45~50℃,加入相当于20mg庆大霉素的无菌硫酸庆大霉素,混匀,倾注平皿。

4.5.21 21.沙氏葡萄糖液体培养基

10g

葡萄糖

40g

1000ml

除葡萄糖外,取上述成分,混合,微温溶解,滤过。加入葡萄糖,溶解,分装,灭菌。

4.5.22 22.沙氏葡萄糖琼脂培养基

10g

1000ml

葡萄糖

40g

琼脂

14g

除琼脂和葡萄糖外,混合,微温溶解,滤过。加入琼脂和葡萄糖,溶解,分装,灭菌。

4.5.23 23.(科玛嘉)念珠菌显色培养基①

10.2g

琼脂

15g

氢罂素

0.5g

灭菌水

1000ml

色素

22.0g

注:①本检查法中白色念珠菌检查所描述该菌在念珠菌显色培养基上的菌落特征,是指该菌在法国科玛嘉公司提供的科玛嘉念珠菌显色培养基上生长的菌落特征。给出这一信息是为了方便本方法的使用者,并不表示对该公司产品的认可。若其他等效产品具有相同的效果,那么也可使用其他等效的产品。

除琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值至6.3±0.2。滤过,加入琼脂,加热煮沸,不断搅拌至琼脂完全溶解,倾注平皿。

4.5.24 24. 1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基

黄色玉米粉

40g

琼脂

10~15g

聚山梨酯80

10ml

1000ml

取玉米粉、聚山梨酯80及蒸馏水500ml,混合,60℃加热30分钟,混匀,用纱布滤过,补足原水量。取琼脂,水500ml,混合,加热溶解。将以上两种溶液混合,摇匀,分装,灭菌。

4.6 微生物限度标准

非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径和对患者健康潜在的危害以及中药的特殊性而制订的。药品的生产、贮存、销售过程中的检验,中药提取物及辅料的检验,新药标准制订,进口药品标准复核,考察药品质量及仲裁等,除另有规定外,其微生物限度均以本标准为依据。

4.6.1 1.制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂

应符合无菌检查法规定。

4.6.2 2.口服给药制剂

4.6.2.1 2.1 不含药材原粉的制剂

细菌数 每1g不得过1000cfu。每1ml不得过100cfu。

霉菌和酵母菌数 每1g或1ml不得过100cfu。

大肠埃希菌 每1g或1ml不得检出。

4.6.2.2 2.2 含药材原粉的制剂

细菌数 每1g不得过10000cfu(丸剂每1g不得过30000cfu)。每1ml不得过500cfu。

霉菌和酵母菌数 每1g或1ml不得过100cfu。

大肠埃希菌 每1g或1ml不得检出。

大肠菌群 每1g应小于100个。每1ml应小于10个。

4.6.2.3 2.3 含豆豉神曲等发酵原粉的制剂

细菌数 每1g不得过100000cfu。每1ml不得过1000cfu。

霉菌和酵母菌数 每1g不得过500cfu。每1ml不得过100cfu。

大肠埃希菌 每1g或1ml不得检出。

大肠菌群 每1g应小于100个。每1ml应小于10个。

4.6.3 3.局部给药制剂

4.6.3.1 3.1 用于手术、烧伤或严重创伤的局部给药制剂

应符合无菌检查法规定。

4.6.3.2 3.2 用于表皮或黏膜不完整的含药材原粉的局部给药制剂

细菌数每1g或10cm2不得过1000cfu。每1ml不得过100cfu。

霉菌和酵母菌数 每1g、1ml或10cm2不得过100cfu。

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 每1g、1ml或10cm2不得检出。

4.6.3.3 3.3 用于表皮或黏膜完整的含药材原粉的局部给药制剂

细菌数 每1g或10cm2不得过10000cfu。每1ml不得过100cfu。

霉菌和酵母菌数 每1g、1ml或10cm2不得过100cfu。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 每1g、1ml或10cm2不得检出。

4.6.3.4 3.4 耳、鼻及呼吸道吸入给药制剂

细菌数 每1g、1ml或10cm2不得过100cfu。

霉菌和酵母菌数 每1g、1ml或10cm2不得过10cfu。

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 每1g、1ml或10cm2不得检出。

大肠埃希菌 鼻及呼吸道给药的制剂,每1g、1ml或10cm2不得检出。

4.6.3.5 3.5 阴道尿道给药制剂

细菌数 每1g、1ml或10cm2不得过100cfu。

霉菌和酵母菌数 每1g、1ml或10cm2应小于10cfu。

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、梭菌、白色念珠菌每1g、1ml或10cm2不得检出。

4.6.3.6 3.6 直肠给药制剂

细菌数 每1g不得过1000cfu。每1ml不得过100cfu。

霉菌和酵母菌数 每1g或1ml不得过100cfu。

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 每1g或1ml不得检出。

4.6.3.7 3.7 其他局部给药制剂

细菌数每1g、1ml或10cm2不得过100cfu。

霉菌和酵母菌数 每1g、1ml或10cm2不得过100cfu。

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 每1g、1ml或10cm2不得检出。

4.6.4 4.含动物组织(包括脏器提取物)及动物类原药材粉(蜂蜜、王浆、动物角、阿胶除外)的口服给药制剂

每10g或10ml还不得检出沙门菌。

4.6.5 5.有兼用途径的制剂

应符合各给药途径的标准。

4.6.6 6.霉变、长螨者

以不合格论。

4.6.7 7.中药提取物及辅料

参照相应制剂的微生物限度标准执行。

5 附录XIII D细菌内毒素检查法

本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素,以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。

细菌内毒素检查包括两种方法,即凝胶法和光度测定法,后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时,可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时,除另有规定外,以凝胶法结果为准。

本试验操作过程应防止微生物和内毒素的污染。

细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示,1EU与1个内毒素国际单位(IU)相当。

细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成,用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价

细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价,用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。

细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml(用于凝胶法)或0.005EU/ml(用于光度测定法)且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水

试验所用的器皿需经处理,以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法(250℃、30分钟以上)去除,也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械,如微孔板和与微量加样器配套的吸头等,应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。

供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的pH值在6.0~8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品,需调节被测溶液(或其稀释液)的pH值,可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。

内毒素限值的确定 药品、生物制品的细菌内毒素限值(L)一般按以下公式确定:

L=K/M

式中 L为供试品的细菌内毒素限值,一般以EU/ml、

EU/mg或EU/U(活性单位)表示;

K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量,以EU/(kg·h)表示,注射剂K=5EU/(kg·h),放射性药品注射剂K=2.5EU/(kg·h),鞘内用注射剂K=0.2EU/(kg·h);

M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量,以ml/( kg·h)、mg/(kg·h)或U/(kg·h)表示,人均体重按60kg计算,人体面积按1.62m2计算。注射时间若不足1小时,按1小时计算。供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量(M)。

按人用剂量计算限值时,如遇特殊情况,可根据生产和临床用药实际情况做必要调整,但需说明理由。

确定最大有效稀释倍数( MVD) 最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数(1→MVD),在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD:

MVD=cL/λ式中 L为供试品的细菌内毒素限值;c为供试品溶液的浓度,当L以EU/ml表示时,则c等于1.0ml/ml,当L以EU/mg或EU/U表示时,f的单位需为mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药,则MVD取1,可计算供试品的最小有效稀释浓度c=λ/L;

λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml),或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。

5.1 方法1 凝胶法

凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。

5.1.1 鲎试剂灵敏度复核试验

在本检查法规定的条件下,使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度,用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时,应进行鲎试剂灵敏度复核试验。

根据鲎试剂灵敏度的标示值(λ),将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解,在旋涡混合器上混匀15分钟,然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液,每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支,其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液,每一个内毒素浓度平行做4管;另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后,封闭管口,垂直放人37℃±1℃的恒温器中,保温60分钟±2分钟。

将试管从恒温器中轻轻取出,缓缓倒转180°,若管内形成凝胶,并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性;未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。

当最大浓度2λ管均为阳性,最低浓度0.25λ管均为阴性,阴性对照管为阴性,试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值,即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc)。

λc=antilg(∑X/4)

式中 X为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。

当λc在0.5λ~2λ(包括0.5λ和2λ)时,方可用于细菌内毒素检查,并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。

5.1.2 干扰试验

按表1制备溶液A、B、C和D,使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数(MVD)的溶液,按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。

只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性,并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时,试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值(Es和Et)。

Es=antilg(∑Xs/4) Et=antilg(∑Xt/4)式中 Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值(lg)。

当Es在0.5λ~2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es-2Es(包括0.5Es和2Es)时,认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰,应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释,再重复干扰试验。

表1 凝胶法干扰试验溶液的制备

编号

内毒素浓度/被加入内毒索的溶液

稀释用液

稀释倍数

所含内毒素的浓度

平行管数

A

无/供试品溶液

2

B

2λ/供试品溶液

供试品溶液

1

2

4

8

0.5λ

0.25λ

4

4

4

c

2λ/检查用水

检查用水

1

2

4

8

0.5λ

0.25λ

4

4

4

D

无/检查用水

-

-

-

2

注;A为供试品溶液;B为干扰试验系列;C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列,D为阴性对照。

可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法(如过滤、中和、透析或加热处理等)排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性,要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。

当进行新药的内毒素检查试验前,或无内毒素检查项的品种建立内毒素检在法时,须进行干扰试验。

当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时,须重新进行干扰试验。

5.1.3 检查法

5.1.3.1 (1)凝胶限度试验

按表2制备溶液A、B、C和D。使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A和B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。

表2凝胶限度试验溶液的制备

编号

内毒素浓度/被加入内毒素的溶液

平行管数

A

无/供试品溶液

2

B

2λ/供试品溶液

2

c

2λ/检查用水

2

D

无/检查用水

2

注:A为供试品溶液;B为供试品阳性对照;C为阳性对照;D为阴性对照。

结果判断 保温60分钟±2分钟后观察结果。若阴性对照溶液D的平行管均为阴性,供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性,阳性对照溶液C的平行管均为阳性,试验有效。若溶液A的两个平行管均为阴性,判定供试品符合规定;若溶液A的两个平行管均为阳性,判定供试品不符合规定。若溶液A的两个平行管中的一管为阳性,另一管为阴性,需进行复试。复试时,溶液A需做4支平行管,若所有平行管均为阴性,判定供试品符合规定;否则判定供试品不符合规定。

5.1.3.2 (2)凝胶半定量试验

本方法系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。按表3制备溶液A、B、C和D。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。

表3凝胶半定量试验溶液的制备

编号

内毒素浓度/被加入内毒素的溶液

稀释用液

稀释倍数

所含内毒素的浓度

平行管数

A

无/供试品溶液

检查用水

1

2

4

8

-

-

-

-

2

2

2

2

B

2λ/供试品溶液

1

2

c

2λ/检查用水

检查用水

1

2

4

8

0.5λ

0.25λ

2

2

2

2

D

无/检查用水

2

注:A为不超过MVD并且通过干扰试验的供试品溶液。从通过干扰试验的稀释倍数开始用检查用水稀释至1倍、2倍、4倍和8倍,最后的稀释倍数不得超过MVD。

B为含2A浓度标准内毒素的溶液A(供试品阳性对照)。

C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列。

D为阴性对照。

5.1.4 结果判断

若阴性对照溶液D的平行管均为阴性,供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性,系列溶液C的反应终点浓度的几何平均值在0.5λ~2λ之间,试验有效。

系列溶液A中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以λ,为每个系列的反应终点浓度,所有平行管反应终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度[按公式CE=antilg(∑X/2)]。如果检验时采用的是供试品的稀释液,则计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘以稀释倍数。

如试验中供试品溶液的所有平行管均为阴性,应记为内毒素浓度小于λ(如果检验的是稀释过的供试品,则记为小于λ乘以供试品进行半定量试验的初始稀释倍数)。如果供试品溶液的所有平行管均为阳性,应记为内毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以λ。

若内毒素浓度小于规定的限值,判供试品符合规定。若内毒素浓度大于或等于规定的限值,判供试品不符合规定。

5.2 方法2 光度测定法

光度测定法分为浊度法和显色基质法。

浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。根据检测原理,可分为终点浊度法和动态浊度法。终点浊度法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度(吸光度或透光率)之间存在着量化关系来测定内毒素含量的方法。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间,或是检测浊度增加速度的方法。

显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。根据检测原理,分为终点显色法和动态显色法。终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的呈色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。动态显色法是检测反应混合物的色度达到某一预先设定的吸光度所需要的反应时间,或检测色度增长速度的方法。光度测定试验需在特定的仪器中进行,温度一般为37℃±1℃。

供试品和鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等,参照所用仪器和试剂的有关说明进行。

为保证浊度和显色试验的有效性,应预先进行标准曲线的可靠性试验以及供试品的干扰试验。

5.2.1 标准曲线的可靠性试验

当使用新批号的鲎试剂或试验条件有任何可能会影响检验结果的改变时,需进行标准曲线的可靠性试验。

用标准内毒素制成溶液,制成至少3个浓度的稀释液(相邻浓度间稀释倍数不得大于10),最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。每一稀释步骤的混匀时间同凝胶法,每一浓度至少做3支平行管。同时要求做2支阴性对照。当阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间,将全部数据进行线性回归分析

根据线性回归分析,标准曲线的相关系数(r)的绝对值应大于或等于0.980,试验方为有效。否则须重新试验。

5.2.2 干扰试验

选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度(设为λm),作为供试品干扰试验中添加的内毒素浓度。按表4制备溶液A、B、C和D。

按所得线性回归方程分别计算出供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量ct和cs,再按下式计算该试验条件下的回收率(R)。

R=(cs-ct)/λm×100%

当内毒素的回收率在50%~200%之间,则认为在此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。

当内毒素的回收率不在指定的范围内,须按“凝胶法干扰试验”中的方法去除干扰因素。并重复干扰试验来验证处理的有效性。

表4 光度测定法干扰试验溶液的制备

编号

内毒素浓度

被加入内毒素的溶液

平行管数

A

供试品溶液

至少2

B

标准曲线的中点(或附近点)的浓度(设为λm)

供试品溶液

至少2

c

至少3个浓度(最低一点设定为λ)

检查用水

每一浓度至少2

D

检查用水

至少2

注:A为稀释倍数不超过MVD的供试品溶液。

B为加入了标准曲线中点或靠近中点的一个已知内毒素浓度的,且与溶液A有相同稀释倍数的供试品溶液。

C为如“标准曲线的可靠性试验”项下描述的,用于制备标准曲线的标准内毒素溶液。

D为阴性对照。

当鲎试剂、供试品的来源、处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时,须重新进行干扰试验。

5.2.3 检查法

按“光度测定法的干扰试验”中的操作步骤进行检测。

使用系列溶液C生成的标准曲线来计算溶液A的每一个平行管的内毒素浓度。

试验必须符合以下三个条件方为有效:

(1)系列溶液C的结果要符合“标准曲线的可靠性试验”中的要求;

(2)用溶液B中的内毒素浓度减去溶液A中的内毒素浓度后,计算出的内毒素的回收率要在50%~200%的范围内;(3)溶液D的反应时间应大于标准曲线最低浓度的反应时间。

5.2.4 结果判断

若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后,小于规定的内毒素限值,判定供试品符合规定。若大于或等于规定的内毒素限值,判定供试品不符合规定。

注:本检查法中,“管”的意思包括其他任何反应容器,如微孔板中的孔。

6 附录XIII E异常毒性检查法

本法系给予小鼠一定剂量的供试品溶液,在规定时间内观察小鼠出现的死亡情况,以判断供试品是否符合规定的一种方法。

供试用的小鼠应健康合格,体重17~20g,在试验前及试验的观察期内,均应按正常饲养条件饲养。做过本试验的小鼠不得重复使用。

6.1 供试品溶液的制备

除另有规定外,用氯化钠注射液按各品种项下规定的浓度制成供试品溶液。

6.2 检查法

除另有规定外,取上述小鼠5只,按各品种项下规定的给药途径,每只小鼠分别给予供试品溶液0.5ml。给药途径分为以下几种:

6.3 静脉注射

将供试品溶液注入小鼠尾静脉,应在4~5秒内匀速注射完毕。规定缓慢注射的品种可延长至30秒。腹腔注射 将供试品溶液注入小鼠腹腔。

6.4 皮下注射

将供试品溶液注入小鼠腹部或背部两侧皮下。口服给药 将供试品溶液通过适宜的导管,灌人小鼠胃中。结果判断 除另有规定外,全部小鼠在给药后48小时内不得有死亡;如有死亡时,应另取体重18~19g的小鼠10只复试,全部小鼠在48小时内不得有死亡。

7 附录XIII F降压物质检查法

本法系比较组胺对照品(S)与供试品(T)引起麻醉血压下降的程度,以判定供试品中所含降压物质的限度是否符合规定。对照品溶液的制备 精密称取磷酸组胺对照品适量,按组胺计算,加水溶解使成每1ml中含1.0mg的溶液,分装于适宜的容器内,4~8℃贮存,经验证保持活性符合要求的条件下,可在3个月内使用。

7.1 对照品稀释液的制备

临用前,精密量取组胺对照品溶液适量,用氯化钠注射液配成每1ml中含组胺0.5μg的溶液。供试品溶液的制备 按品种项下规定的限值,且供试品溶液与标准品稀释液的注人体积应相等的要求,制成适当浓度的供试品溶液。

7.2 检查法

取健康合格、体重2kg以上的猫,雌者应无孕,用适宜的麻醉剂(如巴比妥类)麻醉后,固定于保温手术台上,分离气管,必要时插入插管以使呼吸畅通,或可进行人工呼吸。在一侧颈动脉插入连接测压计的动脉套管,管内充满适宜的抗凝剂溶液,以记录血压,也可用其他适当仪器记录血压。在一侧股静脉内插入静脉插管,供注射药液用。试验中应注意保持动物体温。全部手术完毕后,将测压计调节到与动物血压相当的高度(一般为13.3~20.0kPa),开启动脉夹,待血压稳定后,方可进行药液注射。各次注射速度应基本相同,每次注射后立即注入一定量的氯化钠注射液。每次注射应在前一次反应恢复稳定以后进行,且相邻两次注射的间隔时间应尽量保持一致。

自静脉依次注入上述对照品稀释液,剂量按动物体重每1kg注射组胺0.05μg、0.1μg及0.15μg,重复2~3次,如0.1μg剂量所致的血压下降值均不小于2.67kPa,同时相应各剂量所致反应的平均值有差别,可认为该动物的灵敏度符合要求。

取对照品稀释液按动物体重每1kg注射组胺0.1μg的剂量(dS),供试品溶液按品种项下规定的剂量(dT),照下列次序注射一组4个剂量:dS、dT、dT、dS。然后以第一与第三、第二与第四剂量所致的反应分别比较;如dT所致的反应值均不大于dS所致反应值的一半,则判定供试品的降压物质检查符合规定。否则应按上述次序继续注射一组4个剂量,并按相同方法分别比较两组内各对dS、dT剂量所致的反应值:如dT所致的反应值均不大于dS所致的反应值,则判定供试品的降压物质检查符合规定;如dT所致的反应值均大于以所致的反应值,则判定供试品的降压物质检查不符合规定;否则应另取动物复试。如复试的结果仍有dT所致的反应值大于dS所致的反应值,则判定供试品的降压物质检查不符合规定。

所用动物经灵敏度检查如仍符合要求,可继续用于降压物质检查。

8 附录XIII G 过敏反应检查法

本法系将一定量的供试品溶液注入豚鼠体内,间隔一定时间后静脉注射供试品溶液进行激发,观察动物出现过敏反应的情况,以判定供试品是否引起动物全身过敏反应。

供试用的豚鼠应健康合格,体重250~350g,雌鼠应无孕。在试验前和试验过程中,均应按正常饲养条件饲养。做过本试验的豚鼠不得重复使用。

8.1 供试品溶液的制备

除另有规定外,按品种项下规定的浓度制备供试品溶液。

8.2 检查法

除另有规定外,取上述豚鼠6只,隔日每只每次腹腔或适宜的途径注射供试品溶液0.5ml,共3次,进行致敏。每日观察每只动物的行为和体征,首次致敏和激发前称量并记录每只动物的体重。然后将其均分为2组,每组3只,分别在首次注射后第14日和第21日,由静脉注射供试品溶液1ml进行激发。观察激发后30分钟内动物有无过敏反应症状

8.3 结果判断

静脉注射供试品溶液30分钟内,不得出现过敏反应。如在同一只动物上出现竖毛、发抖、干呕、连续喷嚏3声、连续咳嗽3声、紫癜呼吸困难等现象中的2种或2种以上,或出现二便失禁、步态不稳或倒地、抽搐休克、死亡现象之一者,判定供试品不符合规定。

9 附录XIII H溶血与凝聚检查法

本法系将一定量供试品与2%的家兔红细胞混悬液混合,温育一定时间后,观察其对红细胞状态是否产生影响的一种方法。

9.1 2%红细胞混悬液的制备

取健康家兔血液,放入含玻璃珠的锥形瓶中振摇10分钟,或用玻璃棒搅动血液,以除去纤维蛋白原,使成脱纤血液。加入0.9%氯化钠溶液约10倍量,摇匀,每分钟1000~1500转离心15分钟,除去上清液,沉淀的红细胞再用0.9%氯化钠溶液按上述方法洗涤2~3次,至上清液不显红色为止。将所得红细胞用0.9%氯化钠溶液制成2%的混悬液,供试验用。

9.2 供试品溶液的制备

除另有规定外,按品种项下规定的浓度制成供试品溶液。

9.3 检查法

取洁净玻璃试管5只,编号,1、2号管为供试品管,3号管为阴性对照管,4号管为阳性对照管,5号管为供试品对照管。按下表所示依次加入2%红细胞悬液、0.9%氯化钠溶液、蒸馏水,混匀后,立即置37℃±0.5℃的恒温箱中进行温育。3小时后观察溶血和凝聚反应。

试管编号

1、2

3

4

5

2%红细胞悬液/ml

2.5

2.5

2.5

0.9%氯化钠溶液/ml

2.2

2.5

4.7

蒸馏水/ml

2.5

供试品溶液/ml

0.3

0.3

如试管中的溶液呈澄明红色,管底无细胞残留或有少量红细胞残留,表明有溶血发生;如红细胞全部下沉,上清液无色澄明,或上清液虽有色澄明,但1、2号管和5号管肉眼观察无明显差异,则表明无溶血发生。

若溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀,轻轻倒转3次仍不分散,表明可能有红细胞凝聚发生,应进一步置显微镜下观察,如可见红细胞聚集为凝聚。

9.4 结果判断

当阴性对照管无溶血和凝聚发生,阳性对照管有溶血发生,若供试品管中的溶液在3小时内不发生溶血和凝聚,判定供试品符合规定;若供试品管的溶液在3小时内发生溶血和(或)凝聚,判定供试品不符合规定。

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