2010年版药典三部附录XVII

1 拼音

2010 nián bǎn yào diǎn sān bù fù lù XVII

《中华人民共和国药典》（2010年版）三部附录XVII

2 附录XVII A 抑菌剂（防腐剂）效力检查法指导原则

抑菌剂（防腐剂）效力检查法系用于测定灭菌、非灭菌制剂中抑菌剂的活性，以评价最终产品的抑菌效力，同时也可用于指导生产企业在研发阶段制剂中抑菌剂浓度的确定。如果药物本身不具有充分的抗菌活性，那么应根据制剂特性（如水溶液制剂）添加适宜的抑菌剂，以防止制剂在正常贮藏和使用过程中可能发生的微生物污染和繁殖使药物发生变质而对使用者造成危害，尤其是多剂量包装的制剂。在药品生产过程中，抑菌剂不能用于替代药品生产的GMP管理，不能作为非灭菌制剂降低微生物污染的唯一途径，也不能作为控制多剂量包装制剂灭菌前的生物负载的手段。所有抑菌剂都具有一定的毒性，制剂中抑菌剂的量应为最低有效量。同时，为保证用药安全，最终包装容器中的抑菌剂有效浓度应低于对人体有害的浓度。

在制剂通则中要求具有扰菌活性的制剂，不管是添加的抑菌剂，还是药物本身具有抗菌活性，在药物研发阶段，均应确认其抗菌效力。抑菌剂的抗菌效力在贮存过程中有可能因药物的成分或包装容器等因素影响而提高或降低，因此，应验证最终容器中的抑菌剂效力在有效期内不因贮藏条件而降低。

本试验方法和抑菌剂抑菌效力判断标准用于包装未启开的成品制剂。

2.1 产品分类

进行本试验的药品分为四类（表1），以便标准的制定和执行。

表1 产品分类

2.2 培养基

2.2.1 培养基的制备

1．胰酪胨大豆肉汤培养基（TSB）

酪蛋白胨 17.0g

磷酸二氢钾 2.5g

大豆木瓜蛋白酶消化物 3.0g

氯化钠 5.0g

葡萄糖 2.5g

水 1000ml

除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调pH值约7.0，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为7.3±0.2，分装，灭菌。

2．胰酪胨大豆琼脂培养基（TSA）

除上述胰酪胨大豆肉汤培养基的处方和制法，加入14.0g琼脂，凋pH值使灭菌后为7.3±0.2，分装，灭菌。

3．沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基照微生物限度检查法（2010年版药典三部附录Ⅻ G）制备。

2.2.2 培养基的适用性检查

抑菌剂效力测定用培养基应进行培养基的适用性检查，包括成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。

2.2.2.1 菌种

试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa） [CMCC（B） 10104]

大肠埃希菌（Escherichia coli） [CMCC （B） 44102]

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） [CMCC（B） 26003]

白色念珠菌（Candida aibicans） [CMCC （F）98001]

黑曲霉（Aspergillus niger） [CMCC （F） 98003]

2.2.2.2 菌液制备

接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至胰酪胨大豆肉汤培养基中，30～35℃培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养24～48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100CFU的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基中．20～25℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100CFU的孢子悬液。

菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。

2.2.2.3 适用性检查

取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌各50～100CFU．分别注入无菌平皿中，立即倾注胰酪胨大豆琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～35℃培养48小时，计数；取白色念珠菌、黑曲霉各50～100CFU，分别注入无菌平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置20～25℃培养72小时，计数；同时，用对应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。

2.2.2.4 结果判定

若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上菌落平均数的70%，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。

2.3 抑菌剂效力测定

2.3.1 菌种

同培养基的适用性检查，若需要，制剂中常见的污染微生物也可作为试验菌株。

2.3.2 菌液制备

接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的新鲜培养物至胰酪胨大豆肉汤培养基或胰酪胨大豆琼脂培养基中，30～35℃培养18～24小时；接种白色念珠菌于沙氏葡萄糖液体培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基中，20～25℃培养24～48小时。若为琼脂培养物，加入适量的0.9%无菌氯化钠溶液将琼脂表面的培养物洗脱，然后，用适宜方法吸出菌悬液至无菌试管内，加入适量的0.9%无菌氯化钠溶液并采用比浊法制成每1ml含菌数约为10⁸ CFU的菌悬液。若为液体培养物，用离心法收集菌体，并用0.9%无菌氯化钠溶液冲洗，采用比浊法制成每1ml含菌数约为10⁸ CFU的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基中，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05% （ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，加入适量的含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液并采用比浊法制成每1ml含孢子数10⁸ CFU的孢子悬液。同时采用平皿法测定1ml菌悬液的菌数。

菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。黑曲霉的孢子悬液可保存在2～8℃，在1周内使用。

2.3.3 供试品接种

抑菌剂效力可能受试验用容器特征的影响，如容器的材质、形状、体积及封口的方式等。因此，只要供试品每个包装容器的装量足够试验用，同时容器便于按无菌操作技术接入试验菌液、混合及取样等，一般应将试验菌直接接种于供试品原包装容器中进行贮存。若因供试品的性状或每个容器装量等因素需将供试品转移至无菌容器时，该容器的材质不得影响供试品的特性（如吸附作用），特别应注意不得影响供试品的pH，pH对抑菌剂的活性影响很大，同时容器的口径大小应便于供试品的进出及混匀。

取包装完整的供试品至少5份，直接接种试验菌，或取适量供试品分别转移至5个适宜的无菌容器中（若试验菌株数超过5株，应增加相应的供试品份数），每一容器接种一种试验菌，1、2、3类供试品中1g或1ml接种菌量为10⁵～10⁶ CFU，4类供试品中1g或1ml接种菌量为10³～10⁴CFU，接种菌液的体积不得超过供试品体积的0.5%～1%，充分混合，使供试品中的斌验菌均匀分布。然后将接种的供试品在试验期间置20～25℃，避光贮存，贮存温度的变化应尽可能控制在最小范围，并防止被污染。

2.3.4 存活菌数测定

根据产品类型，在供试品刚接种（0时）及表2规定的间隔时间，分别从上述每个容器中取供试品1ml （g），用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液稀释成1: 10、1：10²、1: 10³等稀释级。采用平皿法或薄膜过滤法（照2010年版药典三部附录Ⅻ G 微生物限度检查法，其中测定细菌用胰酪胨大豆琼脂培养基，测定真菌用沙氏葡萄糖琼脂培养基）测定每份供试品中所含的菌数。菌数测定方法应进行验证，验证方法按微生物限度检查法（2010年版药典三部附录Ⅻ G）中的“计数方法的验证”进行，其中测定细菌用胰酪胨大豆琼脂培养基，测定真菌用沙氏葡萄糖琼脂培养基。

根据菌数测定结果，计算1ml （g）供试品各试验菌所加的菌数及各间隔时间的菌数，并换算成lg值。

2.3.5 结果判断

抑菌剂效力根据各间隔时间的菌数lg值相对于初始值（0时菌数lg值）减少程度进行评价（表2），试验结果按有效数字的修约规则进舍，保留小数点后1位有效数字。结果符合表2要求可判定该产品抑菌效力符合规定。

表2  抑菌剂抑菌效力判断标准

2类供试品

3类供试品

4类供试品

注：表中“不增加”是指对前一个测定时间，试验菌增加的数量不超过0.5lg。

3 附录XVII B 药品微生物检验替代方法验证指导原则

本指导原则是为所采用的试验方法能否替代药典规定的方法用于药品微生物的检验提供指导。

随着微生物学的迅速发展，制药领域不断引入了一些新的微生物检验技术，大体可分为三类：（1）基于微生物生长信息的检验技术，如生物发光技术、电化学技术、比浊法等；（2）直接测定被测介质中活微生物的检验技术，如同相细胞技术法、流式细胞计数法等；（3）基于微生物细胞所含有特定组成成分的分析技术，如脂肪酸测定技术、核酸扩增技术、基因指纹分析技术等。这些方法与传统检查方法比较，或简便快速，或具有实时或近实时监控的潜力，使生产早期采取纠正措施及监控和指导优良生产成为可能，同时新技术的使用也促进了生产成本降低及检验水平的提高。

在控制药品微生物质量中，微生物实验室出于各种原因如成本、生产量、快速简便及提高药品质量等需要而采用非药典规定的检验方法（即替代方法）时，应进行替代方法的验证，确认其应用效果优于或等同于药典的方法。

3.1 微生物检验的类型及验证参数

药品微生物检验方法主要分两种类型：定性试验和定量试验。定性试验就是测定样品中是否存在活的微生物，如无菌检查及控制菌检查。定量试验就是测定样品中存在的微生物数量，如菌落计数试验。

由于生物试验的特殊性，如微生物检验方法中的抽样误差、稀释误差、操作误差、培养误差和计数误差都会对检验结果造成影响，因此，药品质量标准分析方法验证指导原则（2010年版药典二部附录XIX A）不完全适宜于微生物替代方法的验证。药品微生物检验替代方法的验证参数见表1。

表1 不同微生物检验类型验证参数

注：+表示需要验证的参数；-表示不需要验证的参数。

尽管替代方法的验证参数与药品质量标准分析方法验证参数有相似之处，但是其具体的内容是依据微生物检验特点而没立的。替代方法验证的实验结果需进行统计分析，当替代方法属于定性检验时，一般采用非参数的统计技术；当替代方法属于定量检验时，需要采用参数统计技术。

进行微生物替代方法的验证时，若替代方法只是针对药典方法中的某一环节进行技术修改，此时，需要验证的对象仅是该项替代技术而不是整个检验方法。如无菌试验若改为使用含培养基的过滤器，然后通过适宜的技术确认活的微生物存在，那么，验证时仅需验证所用的微生物回收系统而不是整个无菌试验方法。

3.2 替代方法验证的一般要求

在开展替代方法对样品检验的适用性验证前，有必要对替代方法有一个全面的了解。首先，所选用的替代方法应具备必要的方法适用性证据，表明在不含样品的情况下，替代方法在不同类型的微生物检验中所具有的专属性、精密度和检测限等参数。这些证据或由替代方法的研发者提供，或由方法使用者完成。

使用者在基本确认替代方法的适用性后，应采用样品按表1规定的参数逐一进行验证，以确认替代方法可否用于该样品的检验。验证至少使用2个批号的样品，每批样品应平行进行至少3次独立实验。

在开展各参数验证时，涉及的菌种除应包括微生物限度检查法（2010年版药典三部附录Ⅻ G）和无菌检查法（2010年版药典三部附录Ⅻ A）中培养基适用性检查规定的菌株外，还应根据替代方法及样品的特点增加相应的菌株。各菌种应分别进行验证。

3.3 样品中微生物定性检验方法的验证

3.3.1 1．专属性

微生物定性检验的专属性是指检测样品中可能存在的特定微生物种类的能力。当替代方法以微生物生长作为判断微生物是否存在时，其专属性验证应确认所用培养基的促生长试验，还应考虑样品的存在对检验结果的影响。当替代方法不是以微生物生长作为判断指标时，其专属性验证应确认检测系统中的外来成分不得干扰试验而影响结果，如确认样品的存在不会对检验结果造成影响。采用替代方法进行控制菌的检验，还应选择与控制菌具有类似特性的菌株作为验证对象。

3.3.2 2．检测限

微生物定性检验的检测限是指在替代方法设定的检验条件下，样品中能被检出的微生物的最低数量。南于微生物所具有的特殊性质，检测限是指在稀释或培养之前初始样品所含有的微生物数量，而不是指检验过程中某一环节的供试液中所含有的微生物数量。例如，微生物限度检查中规定不得检出沙门菌，对检测限而言，是指每10g样品中能被检出的沙门菌的最低数量。

检测限确定的方法是在样品中接种较低浓度的试验茵（每单位不超过5CFU），然后分别采用药典方法和替代方法对该试验菌进行检验，以检出与否来比较两种方法的差异。试验菌的接种量须根据试验而定，以接种后采用药典方法50%的样品可检出该试验菌为宜。检测限验证至少应重复进行5次。对于同一种试验菌可采用卡方检验（X2）来评价两种方法的检测限是否存在差异。

3.3.3 3．重现性

微生物定性检验的重现性是指相同的样品在正常的实验条件（如实验地点、实验人员、仪器、试剂的批次等）发生变化时，所得检验结果的精密度。重现性可视为微生物检验方法在检验结果上抵抗操作和环境变化的能力。方法使用者应优先测定该验证参数。在样品中接种一定数量的试验菌（接种量应在检测限以上），采用药典方法和替代方法，分别由不同人员，在不同时间，使用不同的试剂（或仪器）进行检验．采用卡方检验（X2）来评价两种方法的重现性是否存在差异。验证过程中，应关注样品的一致性。

3.3.4 4．耐用性

微生物定性检验的耐用性是指当方法参数有小的刻意变化时，检验结果不受影响的能力，为方法正常使用时的可靠性提供依据。方法使用者应优先测定该验证参数。与药典方法比较，若替代方法检验条件较为苛刻，则应在方法中加以说明。替代方法与药典方法的耐用性比较不是必须的，但应单独对替代方法的耐用性进行评价，以便使用者了解方法的关键操作点。

3.4 样品中微生物定量检验方法的验证

微生物定量检验一般都涉及菌落计数。对计数结果进行数据处理时通常需要使用统计的方法。由于菌落计数服从泊松分布，因此采用泊松分布的统计方法对计数结果进行数据处理优于采用正态分布的统计方法。检验者往往习惯采用正态分布的统计方法，因此也可以通过对数转换或平方根加1的方法将原始数据转换为正态分布数据后再进行统计分析。两种统计方法都适用于微生物数据的统计分析。

3.4.1 1．准确度

微生物定量检验的准确度是指替代方法的检验结果与药典方法检验结果一致的程度。准确度的确认应在检测的范围内，通常用微生物的回收率（%）来表示。

检测范围内的准确度都应符合要求，准确度验证的方法是：制备试验菌的菌悬液，菌悬液的浓度应选择为能够准确计数的最高浓度，然后系列稀释至较低浓度（如小于10CFU/ml）。例如，菌落计数平皿法的替代方法，在制备高浓度菌悬液时，其浓度可以是10³CFU/ml，并系列稀释至10⁰ CFU/ml。每个试验菌应至少选择5个菌浓度进行准确度确认，替代方法的检验结果不得少于药典方法检验结果的70%，也可以采用合适的统计学方法表明替代方法的回收率至少与药典方法一致。当替代方法的回收率高于药典方法时，有必要结合专属性项下的有关内容对准确度进行评价。

3.4.2 2．精密度

微生物定量检验的精密度是指在检验范围内，对同一个均匀的样品多次重复取样测定，其检验结果的一致程度，通常采用标准偏差或相对标准偏差来表示，也可以采用其他适宜的方式。

精密度验证的方法是：制备试验菌的菌悬液，菌悬液的浓度应选择为能够准确读数的最高浓度，然后系列稀释至较低浓度（如小于10CFU/ml）。每个试验菌选择其中至少5个浓度的菌悬液进行检验。每一个浓度至少应进行10次重复检验，以便能够采用统计分析方法得到标准偏差或相对标准偏差。一般情况下，可以接受的相对标准偏差（RSD）应不大于35%。不考虑特殊的检验结果，替代方法的相对标准偏差（RSD）应不大干药典方法。例如，药典菌落计数平皿法其可接受的相对标准偏差（RSD）与含菌浓度的关系见表2。

表2 不同含菌浓度下预期的相对标准偏差

3.4.3 3．专属性

微生物定量检验的专属性是指通过检测适宜的试验菌，以证明检验方法与其设定目的相适应的能力。例如，菌落计数平皿法其设定目的在于检出一定数量的微生物，则其专属性验证应证明当样品中存在一定数量的试验菌时，通过平皿法检验，能够检出试验菌，而样品的存在不会对结果造成影响。专属性验证时，应能够设计出可能使替代方法出现假阳性的实验模型来挑战替代方法，从而确认替代方法的适用性。当替代方法不依赖微生物生长出菌落或出现混浊就可以定量时（如不需要增菌或在1～50CFU范围内就可直接测定菌数的定量方法），以上验证方式就显得更为重要。

3.4.4 4．定量限

微生物定量检验的定量限是指样品中能被准确定量测定的微生物最低数量。由于无法得到含有已知微生物数量的实验样品，因此，在定量限验证时，应选择在检验范围内至少5个菌浓度，每个浓度重复取样测定不少于5次，替代方法的定量限不得大于药典方法。需要注意的是，由于细菌计数和菌落数服从泊松分布，可能存在计数结果的误差，因此替代方法的定量限仅需证实在相近的低限度下其灵敏度至少相当于药典方法。

定量限验证的方法是：在检验范围的低限制备5份不同含菌浓度的菌悬液，每份菌悬液分别用药典方法和替代方法进行不少于5次检验，采用统汁方法比较替代方法的检验结果与药典方法结果的差异，从而评价替代方法的定量限。

3.4.5 5．线性

微生物定量检验的线性是指在一定范围内，检验结果与样品中微生物数量成比例关系的程度。线性验证时必须覆盖能够准确测定的所有浓度范围。每株试验菌应选择至少5个浓度，每个浓度至少测定5次。根据以上实验数据，以检验结果为因变量，以样品中微生物的预期数量为自变量进行线性回归分析，计算相关系数r。当相关系数不能准确评估线性时，只能确定简单大约的关系值。替代方法的相关系数不得低于0.95。

3.4.6 6．范围

微生物定量检验的范围是指能够达到一定的准确度、精密度和线性，检验方法适用的高低限浓度或数量的区间。

3.4.7 7．重现性

微生物定量检验的重现性是指相同的样品在正常的实验条件（如实验地点、实验人员、仪器、试剂的批次等）发生变化时，所得检验结果的精密度。重现性可视为微生物检验方法在检验结果上抵抗操作和环境变化的能力。方法使用者应优先测定该验证参数。在样品中接种一定数量的试验菌（接种量应在定量限以上）．采用药典方法和替代方法，分别由不同人员，在不同时间，使用不同的试剂（或仪器）进行检验，对检验结果进行统计分析，以相对标准偏差（RSD）来评价两种方法的重现性差异。验证过程中，应关注样品的一致性。

3.4.8 8．耐用性

微生物定量检验的耐用性是指当方法参数有小的刻意变化时，检验结果不受影响的能力，为方法正常使用时的可靠性提供依据。方法使用者应优先测定该验证参数。与药典方法比较，若替代方法检验条件较为苛刻，则应在方法中加以说明。替代方法与药典方法的耐用性比较不是必须的，但应单独对替代方法的耐用性进行评价，以便使用者了解方法的关键操作点。