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2010年版药典三部附录Ⅸ

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目录

1 拼音

2010 nián bǎn yào diǎn sān bù fù lù Ⅸ

中华人民共和国药典》(2010年版)三部附录Ⅸ

2 附录Ⅸ A 抗生素残留量检查法(培养法)

本法系依据在琼脂培养基内抗生素对微生物抑制作用比较对照品与供试品对接种的试验菌产生的抑菌圈的大小,检查供试品中氨苄西林四环素残留量。

2.1 磷酸缓冲液(pH 6.0)的制备

称取磷酸二氢钾8.0g、磷酸氢二钾2.0g,加水溶解并稀释至1000ml,经121℃灭菌30分钟。

2.2 抗生素Ⅱ号培养基的制备

称取胨6g、牛肉提取粉1.5g、酵母浸出粉6g,加入适量水溶解后,加入琼脂13~14g,加热使之溶胀,滤过除去不溶物,加入葡萄糖1g,溶解后加水至1000ml,调pH值使灭菌后为6.5~6.6;分装于玻璃管或锥形瓶中,经115℃灭菌30分钟,4℃保存

2.3 对照品溶液的制备

取氨苄西林对照品适量,用0.01mol/L盐酸溶解并稀释成每1ml中含氨苄西林10mg的溶液,精密量取适量,用磷酸盐缓冲液稀释成每1ml中含1.0μg的溶液。

取四环素对照品适量,用生理氯化钠溶液溶解并稀释成每1ml中含0.125μg的溶液。

2.4 菌悬液的制备

(1)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)悬液  用于检测氨苄西林。取金黄色葡萄球菌(CMCC 26003)营养琼脂斜面培养物,接种于营养琼脂斜面上,35~37℃培养20~22小时。临用时,用灭菌水或0.9%无菌氯化钠溶液将菌苔洗下,备用。

(2)藤黄微球菌(Micrococcus luteus)悬液  用于检测四环素。取藤黄微球菌[CMCC (B) 28001]营养琼脂斜面培养物,接种于营养琼脂斜面上,置26~27℃培养24小时。临用时,用0.9%无菌氯化钠溶液将菌苔洗下,备用。

2.5 检查法

取直径8cm或10cm的培养皿,注入融化的抗生素Ⅱ号培养基15~20ml,使在碟底内均匀摊布,放置水平台上使凝固,作为底层。取抗生素Ⅱ号培养基10~15ml置于1支50℃水浴预热的试管中,加入0.5%~1.5% (ml/ml)的菌悬液300μl混匀,取适量注入已铺制底层的培养皿中,放置水平台上,冷却后,在每个培养皿上等距离均匀放置钢管(内径6~8mm、壁厚1~2mm、管高10~15mm的不锈钢管,表面应光滑平整),于钢管中依次滴加供试品溶液、阴性对照溶液(磷酸盐缓冲液)及对照品溶液。培养皿置37℃培养18~22小时。

2.6 结果判定

对照品溶液有抑菌圈,阴性对照溶液无抑菌圈。供试品溶液抑菌圈的直径小于对照品溶液抑菌圈的直径时判为阴性;否则判为阳性

2.7 【附注】

本试验应在无菌条件下进行,使用的玻璃仪器、钢管等应无菌。

3 附录Ⅸ B 外源性DNA残留量测定法

在进行外源性DNA残留量测定时,可根据供试品具体情况选择下列任何一种方法进行测定。

3.1 第一法  DNA探针杂交法

供试品中的外源性DNA经变性为单链后吸附于固相膜上,在一定温度下可与相匹配的单链DNA复性而重新结合成为双链DNA,称为杂交。将特异性单链DNA探针标记后,与吸附在固相膜上的供试品单链DNA杂交,并使用与标记物相应的显示系统显示杂交结果,与已知含量的阳性DNA对照比对后,可测定供试品中外源性DNA残留量。

3.1.1 试剂

(1) DNA标记和检测试剂盒。

(2) DNA杂交膜  尼龙膜或硝酸纤维素膜。

(3)2%蛋白酶K溶液  称取蛋白酶K 0.20g,溶于灭菌水(电阻率大于18.2MΩ·cm) 10ml中,分装后储藏于-20℃备用。

(4)3%牛血白蛋白溶液  称取牛血清白蛋白0.30g,溶于灭菌水(电阻率大于18.2 MΩ·cm)  10ml中。

(5)1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液(pH8.0)  用盐酸调pH值至8.0。

(6)5.0mol/L氯化钠溶液。

(7)0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液(pH8.0)用10mol/L氢氧化钠溶液调pH值至8.0。

(8)20%十二烷基硫酸钠SDS)溶液  用盐酸调pH值至7.2。

(9)蛋白酶缓冲液(pH8.0)  量取1mol/L Tris溶液1.0ml(pH8.0)、5mol/L氯化钠溶液2.0ml、0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液(pH8.0)2.0ml、20% SDS溶液2.5ml,加灭菌水(电阻率大于18.2 MΩ·cm)至10ml。

(10) TE缓冲液(pH8.0)  量取1mol/L Tris溶液(pH8.0) 10ml、0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液(pH8.0)2ml,加灭菌水(电阻率大于18.2 MΩ·cm)至1000ml。

(11)1%鱼精DNA溶液  精密称取鱼精DNA 0.10g,置10ml量瓶中,用TE缓冲液溶解并稀释至刻度,摇匀,用7号针头反复抽打以剪切DNA成为小分子,分装后贮藏于-20℃备用。

(12) DNA稀释液  取1%鱼精DNA溶液50μl,加TE缓冲液至10ml。

3.1.2 用于探针标记和阳性对照的DNA制备

用于探针标记和阳性对照的DNA,由生产供试品用的传代细胞、工程菌或杂交瘤细胞提取纯化获得,其提纯和鉴定可参考下述推荐方案进行,具体方法可参考《分子克隆实验指南》([美]J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译,科学出版社,2002)或《精编分子生物学实验指南》([美]F.奥斯伯等著,颜子颖、王海林译,科学出版社,1998)。

将待提取的细胞基质悬液的细胞浓度调整为每1ml约含107个细胞,如果为细菌,则将其浓度调整为每1ml约含108个细菌。量取悬液1ml,离心,在沉淀中加裂解液400μl混匀,37℃作用12~24小时后,加入饱和苯酚溶液450μl,剧烈混匀,以每分钟10000转离心10分钟,转移上层液体,以饱和苯酚溶液450μl重复抽提1次;转移上层液体,加入三氯甲烷450μl,剧烈混匀,以每分钟10000转离心10分钟;转移上层液体,加入pH 5.2的3mol/L醋酸钠溶液40μl,充分混合,再加入-20℃以下的无水乙醇1ml,充分混合,-20℃以下作用2小时,以每分钟15000转离心15分钟;用适量-20℃70%乙醇溶液洗涤沉淀1次,以每分钟15000转离心15分钟,弃上清液,保留沉淀,吹至干燥后,加适量灭菌TE缓冲液溶解,RNase酶切,酚-三氯甲烷抽提,分子筛纯化DNA,即得。

用1%琼脂糖凝胶电泳法分光光度法鉴定阳性对照品的DNA纯度:应无RNA和寡核苷酸存在;A260/A280比值应在1.8~2.0之间(测定时将供试品稀释至A260为0.2~1.0)。

用于阳性对照和标记探针的DNA在使用前应进行酶切或超声处理,使其片段大小适合于DNA杂交和探针标记。

阳性对照品的DNA、浓度按下式计算:

DNA浓度(μg/ml)=50×A260

阳性对照品可分装于适宜的小管中,-20℃以下保存,长期使用。

3.1.3 探针的标记

按试剂盒使用说明书进行。

3.1.4 测定法

(1)蛋白酶K预处理  按下表对供试品、阳性对照和阴性对照进行加样,混合后于37℃保温4小时以上,以保证酶切反应完全。

加样量

2%蛋白酶K溶液

蛋白酶缓冲液

3%牛血清白蛋白溶液

加水至终体积

供试品

100μl

1μl

20μl

200μl

D1

100μl

1μl

20μl

适量

200μl

D2

100μl

1μl

20μl

适量

200μl

D3

100μl

1μl

20μl

适量

200μl

阴性对照

100μl

1μl

20μl

适量

200μl

注意事项:供试品的稀释

根据成品最大使用剂量,用DNA稀释液将供试品(原液)稀释至每100μl含1人份剂量;如成品最大使用剂量较大,而供试品的蛋白质含量较低,可用DNA稀释液将供试品稀释至每100μl含1/10人份剂量或每100μl含1/100人份剂量。

D1、D2、D3为稀释的阳性DNA对照。用DNA稀释液稀释至每1ml中含DNA 1000ng,然后依次10倍稀释成10ng/100μl (D1)、1ng/100μl (D2)、100pg/100μl(D3)3个稀释度;如成品使用剂量较大,而且DNA限量要求(100pg/剂量)较严格时,则需要提高DNA检测灵敏度,相应的阳性DNA对照应稀释成100pg/100μl(D1)、10pg/100μl (D2)、1pg/100μl(D3)3个稀释度。阴性对照为DNA稀释液,空白对照为未进行蛋白酶K预处理的TE缓冲液。

当供试品1/100人份剂量大于100μl时,终体积也随之增大,一般终体积为供试品体积的1倍左右,供试品体积和终体积相差过小,可能会影响蛋白酶K的活性。

2%蛋白酶K溶液和蛋白酶缓冲液的比例为1: 20,蛋白酶缓冲液和终体积的比例为1:16。

加入3%牛血清白蛋白溶液适量,是为了使阳性对照和阴性对照中含有一定的蛋白质,与供试品(通常为蛋白质)的酶切条件保持一致;如供试品为其他物质,则应改用其他相应物质。

若预处理后的供试品溶液中的蛋白质干扰本试验,可用上述饱和苯酚溶液抽提法或其他适宜方法提取供试品DNA(阳性对照、阴性对照也应再次提取DNA,与供试品溶液平行)。

(2)点膜  用TE缓冲液浸润杂交膜后,将预处理的供试品、阳性对照、阴性对照与空白对照置100℃水浴加热10分钟,迅速冰浴冷却,以每分钟8000转离心5秒。用抽溶加样器点样子杂交膜(因有蛋白质沉淀,故要视沉淀多少确定加样量,以避免加入蛋白质沉淀。所有供试品与阳性对照、阴性对照、空白对照加样体积应一致,或按同样比例加样)。晾干后置80℃真空干烤1小时以上。

(3)杂交及显色  按试剂盒使用说明书进行。

结果判定  阳性对照应显色,其颜色深度与DNA含量相对应,呈一定的颜色梯度;阴性对照、空白对照应不显色,或显色深度小于阳性DNA对照D3,试验成立。将供试品与阳性对照进行比较,根据显色的深浅判定供试品中外源性DNA的含量。

3.2 第二法  荧光染色法

应用双链DNA荧光染料与双链DNA特异结合形成复合物,在波长480nm激发下产生超强荧光信号,可用荧光酶标仪在波长520nm处进行检测,在一定的DNA浓度范围内以及在该荧光染料过量的情况下,荧光强度与DNA浓度成正比,根据供试品的荧光强度,计算供试品中的DNA残留量。

3.2.1 试剂

(1) 1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液(pH7.5)  用盐酸调pH值至7.5。

(2)0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液(pH7.5)用10mol/L氢氧化钠溶液调pH值至7.5。

(3) TE缓冲液(pH7.5)  量取1mol/L Tris溶液(pH7.5) 1.0ml、0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液(pH7.5)0.2ml,加灭菌注射用水至100ml。

(4)双链DNA荧光染料  按试剂使用说明书配制。

(5) DNA标准品  取DNA标准品适量溶于TE缓冲液中,制成100μg/ml DNA标准品,于-20℃保存。

DNA标准品浓度根据下式计算;

DNA浓度(μg/ml)=50×A260

3.2.2 DNA标准品溶液的制备

用TE缓冲液将DNA标准品配成0ng/ml、1.25ng/ml、2.5ng/ml、5.0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml的标准品溶液。

3.2.3 测定法

精密量取DNA标准品溶液和供试品溶液各400μl于1.5ml离心管中,分别加入新配制的双链DNA荧光染料400μl,混匀后,避光室温放置5分钟。取250μl上述反应液于96孔黑色酶标板中,并做3个复孔。用荧光酶标仪在激发波长480nm、发射擞长520nm处测定荧光强度。以TE缓冲液测得的荧光强度为本底,测定和记录各测定孔的荧光值。以标准品溶液的浓度对其相应的荧光强度作直线回归,求得直线回归方程(相关系数应不低于0.99),将供试品溶液的荧光强度代入直线回归方程,求出供试品中DNA残留量。

3.2.4 注意事项

(1) DNA残留量在1.25~80ng/ml范围内,本法线性较好,因此供试品DNA残留量在该范围内可定量测定;当DNA残留量低于1.25ng/ml时应为限量测定,表示为小于1.25ng/ml。

(2)供试品首次应用本法测定时需要进行方法学验证,验证内容至少包括精密度试验和回收率试验。若供试品干扰回收率和精密度,应采用适宜方法稀释或纯化DNA(可参见本项目第一法)以排除干扰,直至精密度试验和回收率试验均符合要求。需要纯化DNA后再进行测定的供试品,每次测定均应从纯化步骤起增加回收率试验,并用回收率对测定结果进行校正。

4 附录Ⅸ C 大肠杆菌菌体蛋白质残留量测定法

本法系采用酶联免疫法测定大肠杆菌表达系统生产的重组制品中菌体蛋白质残留量。

4.1 试剂

(1)包被液(pH9.6碳酸盐缓冲液)  称取碳酸钠0.32g、碳酸氢钠0.586g,置200ml量瓶中,加水溶解并稀释至刻度。

(2)磷酸盐缓冲液(pH7.4)  称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g,加水溶解并稀释至500ml,121℃灭菌15分钟。

(3)洗涤液(pH7.4)  量取聚山梨酯20 0.5ml,加磷酸盐缓冲液至500ml。

(4)稀释液(pH7.4)  称取牛血清白蛋白0.5g,加洗涤液溶解并稀释至100ml。

(5)浓稀释液  称取牛血清白蛋白1.0g,加洗涤液溶解并稀释至100ml。

(6)底物缓冲液(pH5.0,枸橼酸-磷酸盐缓冲液)称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 1.84g、枸橼酸0.51g,加水溶解并稀释至100ml。

(7)底物液  取邻苯二胺8mg、30%过氧化氨30μl,溶于底物缓冲液20ml中。临用时现配。

(8)终止液  1mol/L硫酸溶液。标准品溶液的制备  按菌体蛋白质标准品说明书加

水复溶,精密量取适量,用稀释液稀释成每1ml中含菌体蛋白质500ng、250ng、125ng、62.5ng、31.25ng、15.625ng、7.8125ng的溶液。

4.2 供试品溶液的制备

取供试品适量,用稀释液稀释成每1ml中约含250μg的溶液。如供试品每1ml中含量小于500μg时,用浓稀释液稀释1倍。

4.3 测定法

取兔抗大肠杆菌菌体蛋白质抗体适量,用包被液溶解并稀释成每1ml中含10μg的溶液,以100μl/孔加至96孔酶标板内,4℃放置过夜(16~18小时)。用洗涤液洗板3次;用洗涤液制备1%牛血清白蛋白溶液,以200μl/孔加至酶标板内,37℃放置2小时;将封闭好的酶标板用洗涤液洗板3次;以100μl/孔加入标准品溶液和供试品溶液,每个稀释度做双孔,同时加入2孔空白对照(稀释液),37℃放置2小时;用稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗大肠杆菌菌体蛋白质抗体1000倍,以100μl/孔加至酶标板内,37℃放置1小时,用洗涤液洗板10次,以100μl/孔加入底物液,37℃避光放置40分钟,以50μl/孔加入终止液终止反应。用酶标仪在波长492nm处测定吸光度,应用计算机分析软件进行读数和数据分析,也可使用手工作图法计算。

以标准品溶液吸光度对其相应的浓度作标准曲线,并以供试品溶液吸光度在标准曲线上得到相应菌体蛋白质含量,按以下公式计算:

式中c为供试品溶液中菌体蛋白质含量,ng/ml;

n为供试品稀释倍数;

T为供试品蛋白质含量,mg/ml。

5 附录Ⅸ D 假单胞菌菌体蛋白质残留量测定法

本法系采用酶联免疫法测定假单胞菌表达系统生产的重组制品菌体蛋白质残留量。

5.1 试剂

(1)包被液(pH9.6碳酸盐缓冲液)  精密称取碳酸钠0.32g、碳酸氢钠0.586g,置200ml量瓶中,加水溶解并稀释至刻度。

(2)磷酸盐缓冲液  称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g,置500ml量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,121℃灭菌15分钟。

(3)洗涤液  量取聚山梨酯20 0.5ml,加磷酸盐缓冲液稀释至500ml。

(4)浓稀释液  称取牛血清白蛋白1.0g,加洗涤液溶解并稀释至100ml。

(5)稀释液  浓稀释液与水等体积混合。

(6)底物缓冲液(0.005mol/L醋酸钠-枸橼酸缓冲液)  称取醋酸钠0.68g、枸橼酸(C6H8O7·H2O)1.05g,加水溶解并稀释至1000ml,调pH值至3.6。

(7)底物液A  称取3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB) 0.08g,加二甲基亚砜40ml溶解,加甲醇60ml,混匀,加底物缓冲液100ml,避光搅拌2小时至完全溶解,室温静置4小时。

(8)底物液B  量取1.5%过氧化氢溶液3.2ml,加底物缓冲液至1000ml。

(9)底物液  临用前取底物液A、B等体积混合。

(10)终止液  2mol/L硫酸溶液。

5.2 标准品溶液的制备

按试剂盒使用说明书用稀释液溶解菌体蛋白质标准品,精密量取适量,用稀释液稀释成每1ml中含菌体蛋白质20ng、10ng、5ng、2.5ng、1.2ng、0.6ng、0.3ng的溶液。

5.3 供试品溶液的制备

取供试品适量,用稀释液稀释成每1ml中约含蛋白质100μg的溶液。如供试品每1ml中含蛋白质量小于200μg时,用浓稀释液将供试品稀释1倍。

5.4 测定法

取包被抗体,用包被液稀释至适宜的浓度(稀释倍数参见试剂盒说明书),以100μl/孔加至96孔酶标板内,在2~8℃放置16~20小时;用洗涤液洗板3次;用洗涤液制备1%牛血清白蛋白溶液,以200μl/孔加至酶标板内,置室温振荡(每分钟200~300转)1小时,用洗涤液洗板3次;以100μl/孔加入标准品溶液和供试品溶液,每个稀释度做双孔,同时加入2孔空白对照(稀释液),置室温振荡(每分钟200~300转)1小时;用洗涤液洗板3次;按试剂盒说明书用稀释液稀释一抗至适宜的浓度,以100μl/孔加至酶标板内,置室温振荡(每分钟200~300转)1小时;用洗涤液洗板3次;然后按试剂盒说明书用稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗至适宜的浓度,以100μl/孔加至酶标板内,置室温振荡(每分钟200~300转)30分钟,用洗涤液洗板8次;以100μl/孔加入底物液,置室温避光反应10~15分钟,以100μl/孔加入终止液终止反应。用酶标仪在波长450nm处测定吸光度,应用计算机分析软件进行读数和数据分析,也可使用手工作图法计算。

以标准品溶液吸光度对其相应的浓度作标准曲线,并以供试品溶液吸光度在标准曲线上得到相应菌体蛋白质含量,按以下公式计算:

式中c为供试品溶液中菌体蛋白质含量,ng/ml;

n为供试品稀释倍数;

T为供试品蛋白质含量,mg/ml。

6 附录Ⅸ E 酵母工程菌菌体蛋白质残留量测定法

本法系采用酶联免疫法测定酵母表达系统生产的重组制品菌体蛋白质残留量。

6.1 试剂

(1)包被液(pH9.6碳酸盐缓冲液)  称取碳酸钠0.32g、碳酸氢钠0.586g,加水溶解并稀释至200ml。

(2) PBS  称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g,加水溶解并稀释至1000ml,调pH值至7.4,121℃灭菌15分钟。

(3)洗涤液(PBS-Tween20)  量取聚山梨酯200.5ml,加PBS至1000ml。

(4)稀释液  称取牛血清白蛋白0.5g,加洗涤液溶解并稀释至100ml。

(5)底物缓冲液(0.005mal/L醋酸钠-枸橼酸缓冲液)  称取醋酸钠0.68g、枸橼酸(C6H8O7·H2O)1.05g,加水溶解并稀释至1000ml,调pH值至3.6。

(6)底物液A  称取3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB) 0.08g,加二甲基亚砜40ml溶解,加甲醇60ml,混匀,加底物缓冲液100ml,避光搅拌2小时至完全溶解,室温静置4小时。

(7)底物液B  量取1.5%过氧化氢溶液3.2ml,加底物缓冲液至1000ml。

(8)底物液  临用前取底物液A、底物液B等体积混匀。

(9)终止液  1mol/L硫酸溶液。

6.2 标准品溶液的制备

按试剂盒使用说明书加水复溶,精密量取适量,用稀释液稀释成每1ml中含菌体蛋白质1000ng、500pg、250ng、125ng、62.5ng的溶液。

6.3 供试品溶液的制备

取供试品适量,用稀释液稀释成适当浓度。

6.4 测定法

取豚鼠抗酵母工程菌蛋白质抗体适量,用包被液稀释成适当浓度,以100μl/孔加至酶标板内,用保鲜膜封好,于4℃放置过夜;用洗涤液洗板3次,用洗涤液制备1%牛血清白蛋白溶液,以200μl/孔加至酶标板内,37℃放置2小时;将封闭好的酶标板用洗涤液洗板3次;以100μl/孔加入标准品溶液及供试品溶液,每个稀释度做双孔,同时加入2孔空白对照(稀释液),封板,37℃放置1小时;用洗涤液洗板6次;按试剂盒使用说明书取兔抗酵母工程菌蛋白质抗体适量,用稀释液稀释成适当浓度,以100μl/孔加至酶标板内,封板,37℃放置1小时;用洗涤液洗板6次;用稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体溶液(IgG-HRP)至适当浓度,以100μl/孔加至酶标板内,用保鲜膜封好,37℃放置1小时;用洗涤液洗板6次,以100μl/孔加入底物液,室温避光放置5~10分钟;以100μl/孔加入终止液终止反应。用酶标仪以630nm波长为参比波长,在波长450nm处测定吸光度,应用计算机分析软件进行读数和数据分析,也可使用手工作图法计算。

以标准品溶液吸光度对其相应的浓度作标准曲线,并以供试品溶液吸光度在标准曲线上得到相应菌体蛋白质含量,按以下公式计算:

式中  c为供试品溶液中菌体蛋白质含量,ng/ml;

n为供试品稀释倍数;

T为供试品蛋白质含量,mg/ml。

7 附录Ⅸ F 激肽释放酶原激活剂测定法

本法系采用显色底物法(或显色基质法)测定供试品中激肽释放酶原激活剂(PKA)含量。

7.1 试剂

(1)0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液(含0.15mol/L氯化钠溶液,简称TNB)  称取6.06g三羟甲基氨基甲烷(Tris,分子量为121.14)及8.77g氯化钠,加适量水溶解后,用1mol/L盐酸调pH值至8.0,补加水至1000ml。

(2) 2mmol/L激肽释放酶显色底物(S-2302)溶液称取S-2302 12.5mg,加10ml水溶解。

(3)前激肽释放酶(PK)  采用适宜方法提纯PK,小体积分装,-30℃以下保存备用。

7.2 PKA标准品溶液的制备

取PKA标准品适量,用0.85%氯化钠溶液分别稀释成每1ml中含10.0IU、20.0IU、30.0IU、40.0IU、50.0IU的溶液。按每次用量,小体积分装,-30℃保存备用。用前融化(仅允许冻融1次),并用TNB稀释10倍。

7.3 供试品溶液的制备

取供试品适量,用TNB稀释10倍。

7.4 测定法

取供试品溶液20μl,加至96孔微量滴定板孔内,加PK 20~50μl,同时开动秒表计时,向每孔加PK的时间间隔应相同,将微孔滴定板振荡1分钟;加盖,于25~30℃放置30分钟后,按加PK的顺序和时间间隔向各反应孔加2mmol/L S-2302溶液20μl,振荡1分钟;加盖,于25~30℃放置15分钟后,再以同样的加液顺序和时间间隔加50%醋酸溶液20μl,振荡1分钟后,照紫外-可见分光光度法(2010年版药典三部附录Ⅱ A),在波长405nm处测定吸光度;同时以TNB 20~50μl代替PK 20~50μl,同法操作,作为空白对照。用PKA标准品溶液的20μl替代供试品溶液,同法操作。以PKA标准品溶液的PKA活性的对数对其相应的吸光度对数作直线回归,求得直线回归方程,计算出供试品PKA活性。

7.5 【附注】

(1)每个PKA标准品溶液和供试品溶液做3孔,其中2个为测定孔、1个为对照孔,2个测定孔吸光度差值应小于0.020。

(2)每次测定可根据供试品PKA含量,适当调整PKA标准品溶液的范围。

(3)线性回归的相关系数应不低于0.99。

(4)加PK、S-2302及50%醋酸溶液时,各孔的间隔时间应相同,加液的顺序要一致,尽可能使各孔处于同一反应条件下。

(5)加PK和加S-2302溶液后的放置时间系从第一孔加液时算起。

(6)如放置温度低于25℃,应分别在两次反应过程的限定时间内于37℃放置10分钟。

8 附录Ⅸ G 质粒丢失率检查法

大肠杆菌表达系统的工程菌含有表达目的蛋白的表达质粒,质粒上一般带有抗生素抗性基因便于筛选,在菌体传代过程中,在一定浓度的抗生素环境下(如种子培养液),质粒丢失后菌体便不能存活,而在不含抗生素的发酵培养液中,随着传代代次的提高,可能有部分大肠杆菌丢失了质粒,失去了抗生素抗性基因,也同时失去表达目的蛋白的能力。通过比较在含有或不含抗生素培养基的菌体存活数,可以检测质粒的丢失率,考查质粒稳定性。

实际操作中一般用模拟发酵或发酵过程实时收集的发酵液,包括最后阶段(传代最多代次)的收集液,经过适当稀释后涂布于不含抗生素的培养基上,置37℃培养过夜;挑取不少于100个单菌落,分别接种到含抗生素和不含抗生素的培养皿中,置37℃培养过夜。比较两者差异,一般应重复2次以上,计算质粒丢失率。工艺验证中

规定质粒丢失率,并应在允许的范围内。

9 附录Ⅸ H SV40核酸序列检查法

本法系通过设计2对特异引物扩增SV40 VP1 100bp(2220~2319)和大T抗原C端451bp (2619~3070)2个片段,采用PCR检查供试品中是否存在SV40核酸序列。

供试品溶液及对照溶液的制备  取供试品400μl,加2%蛋白酶K溶液25μl、10% SDS溶液50μl、0.05mol/LEDTA溶液(pH8.0) 10μl,置56℃培养1小时,用等体积的酚-三氯甲烷(1:1)混合液抽提后,再用等体积的三氯甲烷抽提,加2倍体积的乙醇,-20℃放置16小时,以每分钟10000转离心15分钟,沉淀用75%乙醇溶液洗涤干燥,加无DNA酶和RNA酶的水10μl,使溶解。阳性对照及阴性对照按上述方法与供试品同时处理。

9.1 引物

VP1上游引物:2220 5'-ACA CAG CAA CCA CAG TGG TTC-3' 2240

VP1 下游引物:2319 5'-GTA AAC AGC CCA CAA ATG TCA AC-3' 2297

T抗原C端上游引物:3070 5'-GAC CTG TGG CTG AGT TTG CTC A-3' 3049

T抗原C端下游引物:2619 5'-GCT TTA TTT GTA ACC ATT ATA AG3' 2641

9.2 检查法

(1)每个待扩增的供试品引物加量为30×10-12mol,DNA模板加量为1μl.总体积50μl。在PCR仪上以94℃先变性3分钟,然后94℃变性20秒、50℃退火20秒、72℃延伸40秒,共进行40个循环;72℃延伸3分钟。

(2)扩增产物电泳检查  2%琼脂糖凝胶(每1ml含1μg溴化乙锭),缓冲液为1×TAE.在100V条件下电泳40分钟,检查扩增片段。VP1扩增片段为100bp,大T抗原C端片段为451bp。

(3)以同样模板重复扩增VP1片段,排除污染因素导致的非特异扩增;或将扩增产物及对照从胶上移至Hybond N尼龙膜上,与VP1探针进行免疫印迹试验,以证明所扩增片段确为VP1片段。

(4)以自动测序仪对供试品及阳性对照的大T抗原C端扩增产物进行序列测定。

9.3 结果判定

阳性对照应得到特异产物,阴性对照应无相应片段,则试验成立。

若未能扩增出VP1片段,则结果判定为未检出SV40核酸序列。

若扩增出VP1片段,可重复试验1次,仍未扩增出VP1片段者,判定为未检出SV40核酸序列。

若重试仍能扩增出VP1片段,则应扩增大T抗原C端片段,如扩增出大T抗原C端片段,应将其扩增产物和阳性对照扩增产物进行测序并比较,核酸序列一致判定为检出SV40核酸序列;如未扩增出大T抗原C端片段,则可按上述步骤(1)~(3)重复试验1次,如仍未扩增出大T抗原C端片段,则可判定为未检出SV40核酸序列。

10 附录Ⅸ I 类A血型物质测定法(血凝抑制法)

本法系用标准类A血型物质和供试品分别与抗A血型血清反应.通过比较血凝反应终点,测定供试品中类A血型物质含量。

10.1 1%A型红细胞悬液

将6人份A型血等量混合,加适量生理氯化钠溶液混匀,以每分钟2000转离心10分钟,倾去上清液,用生理氯化钠溶液洗3次,吸取沉积红细胞1ml.加生理氯化钠溶液99ml,混匀,制成1%A型人红细胞悬液。

10.2 标准类A血型物质溶液的制备

国家药品检定机构分发或经其认可。将标准品制成每1ml中含1mg的标准溶液。取1组10支直径9mm的试管,将标准溶液用生理氯化钠溶液做2倍系列稀释,体积为0.1ml,由1/100稀释度(每1mt含0.01mg)开始。

10.3 供试品溶液的制备

取1组10支直径9mm的试管,将供试品用生理氯化钠溶液做2倍系列稀释,体积为0.1ml,由供试品开始。

10.4 抗A血型血清试验剂量的测定

取1组10支直径9mm的试管,将抗A血型血清用生理氯化钠溶液做2倍系列稀释,体积为0.1ml,由1/2稀释度开始,加1%A型人红细胞悬液0.1ml;同时取生理氯化钠溶液0.1ml与1%A型人红细胞0.1ml作为阴性对照。摇匀,室温放置15分钟,以每分钟1500转离心1分钟,根据细胞沉降压缩情况观察凝集程度。以呈现完全凝集(++++)的抗A血型血清的最高稀释度为1个抗体试验剂量。

10.5 测定法

在每稀释度供试品及标准类A血型物质溶液中分别加含2个抗体试验剂量的抗A血型血清0.1ml。摇匀,36.5~37.5℃放置10分钟,再于上述各管中分别加入1%A型人红细胞悬液0.1ml,摇匀,36.5~37.5℃放置15分钟.以每分钟1500转离心1分钟,根据红细胞沉降压缩情况观察凝集程度。

10.6 结果判定

供试品呈现完全血凝抑制(终点)的最高稀释倍数乘以对照组呈现相似瓶凝抑制的最高倍稀释管的血型物质含量,即为每1ml供试品所含类A血型物质的质量( mg)。

11 附录Ⅸ J 抗A、抗B血凝素测定法(间接抗人球蛋白法)

本法系采用间接抗人球蛋白法(Coombs试验),测定供试品中抗A、抗B血凝素。

11.1 试剂

(1)红细胞悬液  取A型、B型及RhD阳性的O型红细胞各3例,分别混合,用适量生理氯化钠溶液洗涤3次,最后以每分钟2000转离心5分钟,吸取沉淀红细胞适量,用生理氯化钠溶液分别制成5% (ml/ml)红细胞悬液。自红细胞采集之日起1周内使用。

(2)抗人球蛋白血清  为多价抗人球蛋白血清,使用前需标定,选择适宜的稀释度用于试验,如生产厂商有说明,按说明书稀释后使用,也可按附注方法确定。

11.2 测定法

取供试品适量,用生理氯化钠溶液做2倍系列稀释,每个稀释度的供试品使用2排管( 75mm×12mm小试管),每管分别加入供试品溶液0.2ml,向第1排各管加A型5%红细胞悬液0.2ml,第2排各管加B型5%红细胞悬液0.2ml,混匀,置37℃水浴30分钟,用适量的生理氯化钠溶液洗涤3次,每次以每分钟1000转离心1分钟,每管加入抗人球蛋白血清0.2ml,混匀,以每分钟1000转离心1分钟,肉眼观察结果。本试验同时设阴性对照、阳性对照及红细胞对照。

(1)阴性对照  取AB型人血清0.2ml(双份),分别加入5%A型及B型红细胞悬液0.2ml,混匀,自“置37℃水浴30分钟”起,同法操作。

(2)阳性对照  取抗RhD血清(IgG型)0.2ml,加入5% RhD阳性O型红细胞0.2ml,混匀,自“置37℃水浴30分钟”起,同法操作。

(3)红细胞对照  取生理氯化钠溶液0.2ml(双份),分别加入5%A型及B型红细胞悬液0.2ml,混匀,自“置37℃水浴30分钟”起,同法操作。

11.3 结果判定

阴性对照及红细胞对照结果均呈阴性,阳性对照结果不低于“+++”,试验成立。

抗A、抗B血凝素滴度以产生“+”凝集的供试品最高稀释倍数计算,不计红细胞悬液及抗人球蛋白血清的体积。

11.4 【附注】

(1)供试品为凝血因子Ⅷ制剂时,需先用生理氯化钠溶液预稀释成每1ml中含4IU后,再进行测定。

(2)抗人球蛋白血清的标定  将抗人球蛋白血清和抗RhD血清分别用生理氯化钠溶液做2倍系列稀释,每管0.2ml,于稀释的抗RhD血清管中加入5% RhD阳性的O型压积红细胞悬液0.1ml,混匀后置37℃水浴中30分钟,用生理氯化钠溶液洗3次并配成2%红细胞悬液,取每个稀释度致敏红细胞悬液0.2ml,分别加入1排稀释的抗人球蛋白血清中,混匀,以每分钟1000转离心1分钟,判定结果。用等量未致敏人RhD阳性O型红细胞替代致敏红细胞,同法操作,作为阴性对照。阴性对照成立,以出现“+”血凝反应的抗RhD血清的最高稀释倍数所对应的抗人球蛋白血清的最高稀释倍数为最适稀释度。

(3)红细胞凝集判定标准如下:

++++  一个结实的凝集块;

+++  几个大的凝集块;

++  中等大的凝集块,背景清晰;

+  小凝集块,背景浑浊;

阴性  无凝集和溶血

(4)阴性对照、阳性对照、红细胞对照与供试品试验应同步进行。

12 附录Ⅸ K 抗补体活性测定法

本法系采用免疫溶血反应作指示系统,根据供试品消耗补体所反映出的溶血率变化,测定供试品的抗补体试剂

(1)镁-钙贮备液  称取氯化钙1.103g、氯化镁(MgCl2·6H2O) 5.083g,加水溶解并稀释至25ml。

(2)巴比妥缓冲液贮备液  称取氯化钠41.5g、巴比妥钠5.1g,加水800ml溶解。用1mol/L盐酸溶液调pH值至7.3,加镁-钙贮备液2.5ml。加水稀释至1000ml,用0.22μm膜滤过,4℃保存备用。

(3)明胶巴比妥缓冲液(GVB)  称取明胶0.625g,加水30ml煮沸使溶解,加巴比妥缓冲液贮备液100ml,再加水稀释至500ml,新鲜制备,当天使用。

(4)阿氏液(Alsever's 液)  称取枸橼酸0.5g、枸橼酸钠8.0g、葡萄糖20.5g、氯化钠4.2g,加水溶解并稀释至1000ml(pH6.2左右)。根据一次采羊血需要量将该溶液分装于采血瓶中,116℃蒸汽灭菌10分钟(灭菌后,尽快释放蒸汽)。放冷后置4℃冰箱保存备用。

(5)绵羊红细胞  由绵羊颈静脉无菌采集全血适量,与等体积的阿氏液混合,无菌分装,4℃保存1周后方可使用。

(6)溶血素  兔抗羊红细胞血清。

(7)豚鼠血清(补体)  取10只以上豚鼠血清,混合,4℃离心除去血细胞,分装,-70℃保存,也可冻干保存。豚鼠血清每1ml中的补体总活性应不低于100 CH50。

12.1 5%羊红细胞悬液制备

取绵羊红细胞适量,用加明胶巴比妥缓冲液至少洗3次后,悬浮于适量明胶巴比妥缓冲液中。取0.2ml红细胞悬液,加至2.8ml水中,待红细胞完全溶解后照紫外-可见分光光度法(2010年版药典三部附录Ⅱ A)在波长541nm处测定吸光度,根据下列公式,将该溶液的吸光度调节至0.62±0.01(每1ml红细胞悬液含红细胞1×109个)。

式中Vi为稀释前红细胞悬液体积,ml;

A为稀释前红细胞溶解液吸光度;

Vf为稀释后红细胞悬液体积,ml。

12.2 溶血素滴定

按表1稀释溶血素。从1: 75稀释的溶血素开始,1.0ml不同稀释度的溶血素分别与5%羊红细胞悬液1.0ml混合,37℃放置30分钟后,取0.2ml,加明胶巴比妥缓冲液1.10ml,稀释的豚鼠补体溶液(如150倍稀释补体)0.2ml,37℃放置60分钟后,以每分钟2000转离心5分钟,吸取上清液,照紫外-可见分光光度法(2010年版药典三部附录Ⅱ A)在波长541nm处测定各管吸光度。每个稀释度做2管,同时再做3管未溶血对照管(明胶巴比妥缓冲液1.4ml,加5%羊红细胞悬液0.1ml),3管全溶血管(水1.4ml加5%羊红细胞悬液0.1ml),同法操作。按下式计算各管溶血率(Y),以Y值为纵坐标,以不同溶血素稀释度为横坐标作图,从而确定敏化羊红细胞所用的溶血素的稀释度。选择增加溶血素的量也不影响Y值的溶血素的稀释度,为每1ml含1个最小溶血单位(即每1ml含1MHU)。最小溶血率应在50%~70%范围,否则试验不成立。

表1 溶血素稀释

制备

制备

溶血素

稀释度

明胶巴比妥

缓冲液/ml

溶血素

溶血素

稀释度

明胶巴比妥

缓冲液/ml

溶血素

稀释度

ml

稀释度

ml

7.5

10

75

100

150

200

300

400

0.60

0.90

1.80

1.80

1.00

1.00

1.00

1.00

未稀释的

未稀释的

7.5

10

75

100

150

200

0.1

0.1

0.2

0.2

1.0

1.0

1.0

1.0

600

800

1200

1600

2400

3200

4800

1.00

1.00

1.00

1.00

1.00

1.00

1.00

300

400

600

800

1200

1600

2400

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

最适敏化的羊红细胞(EA)的制备  量取每1ml含2MHU的溶血素(A)适量,缓慢注入等体积的5%羊红细胞(E)悬液中,37℃放置15分钟后,2~8℃保存,6小时内使用。

12.3 滴定豚鼠血清中补体活性

用明胶巴比妥缓冲液适当稀释豚鼠血清,然后按表2滴定补体。以补体用量的对数对Y/(1-Y)的对数作直线回归,求出直线回归方程的截距(a)、斜率(b)和相关系数(r)。补体活性按下式计算:

式中1/X为a值反对数的倒数。

表2补体滴定

1

2

3

4

5

6

7

GVB/ml

1.2

1.1

1.0

0.9

0.8

0.7

0.6

适当稀释的补体/ml

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

EA/ml

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

8

9

10

11

12

13

14

GVB/ml

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

1.3

1.3(水)

适当稀释的补体/ml

0.8

0.9

1.0

1.1

1.2

EA/ml

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

37℃培养60分钟→冰浴中冷却→每分钟2000转离心5分钟→取上清液测吸光度

12.4 抗补体活性测定

根据测得的豚鼠血清补体活性,用加明胶巴比妥缓冲液稀释成每1ml含100CH50溶液,按表3制备培养混合物。表3中静注人免疫球蛋白(IVIG)是按每1ml含50mg浓度计算的。如果IVIG的浓度不是每1ml含50mg时,则按下式计算IVIG的加量(V),然后再根据IVIG的实际取量计算明胶巴比妥缓冲液的加入量;但要保持供试品加缓冲液的总量为0.8ml。将此混合物于37℃放置60分钟后,取0.2ml加9.8ml明胶色比妥缓冲液(50倍稀释),测定剩余补体活性。

表3 供试品及补体对照管制备

供试品管/ml

补体对照管/ml

供试品(50mg/ml)

明胶巴比妥缓冲液

补体(100CH50/ml)

0.2

0.6

0.2

0.8

0.2

按下式计算供试品抗补体活性。D为每1ml含80~120 CH50时,试验成立。

式中  D为补体对照管剩余补体活性,CH50/ml;

G为供试品管剩余补体活性,CH50/ml。

12.5 【附注】

(1)洗红细胞时,务必将白细胞弃掉。

(2)敏化红细胞时一定要慢慢轻摇。

(3)仅允许使用澄清明胶溶液。

13 附录Ⅸ L 鼠IgG残留量测定法

本法系用酶联免疫法测定经单克隆抗体亲和色谱方法纯化的重组制品中鼠IgG残留量。

13.1 试剂

(1)包被液(pH9.6碳酸盐缓冲液)  称取碳酸钠0.32g、碳酸氢钠0.586g,加水溶解并稀释至200ml。

(2) PBS (pH7.4)  称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g,加水溶解并稀释至1000ml,121℃灭菌15分钟。

(3)洗涤液(PBS-Tween20)  量取聚山梨酯200.5ml,加PBS稀释至1000ml。

(4)稀释液  称取牛血清白蛋白0.5g,加洗涤液溶解并稀释至100ml。

(5)底物缓冲液(枸橼酸-PBS)  称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)1.84g、枸橼酸0.51g,加水溶解并稀释至100ml。

(6)底物液  取邻苯二胺8mg、30%过氧化氢溶液30μl,溶于底物缓冲液20ml中。临用前配制。

13.2 标准品溶液的制备

按使用说明书用适量水复溶鼠IgG标准品。精密量取适量,用稀释液稀释成每1ml中含100ng、50ng、25ng、12.5ng、6.25ng、3.13ng的溶液。

13.3 供试品溶液的制备

取供试品适量,用稀释液稀释成每1ml中含1个成品剂量(如未能确定制剂的规格,则按成品的最大剂量计算)的溶液。

13.4 测定法

山羊抗鼠IgG抗体适量,用包被液稀释成每1ml含10μg的溶液;以100μl/孔加至96孔酶标板内,4℃放置过夜(16~18小时),用洗涤液洗板3次;用洗涤液制备1%牛血清白蛋白溶液,以200μl孔加至酶标板内,37℃封闭2小时,将封闭好的酶标板用洗涤液洗3次,以100μl/孔加标准品溶液和供试品溶液,37℃放置1小时,将封闭好的酶标板用洗涤液洗3次;按使用说明书用稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的绵羊抗鼠IgG抗体,以100μl/孔加至酶标板内,37℃放置30分钟,用洗涤液洗板3次;以50μl/孔加入底物液,37℃避光放置20分钟,以50μl/孔加入终止液(1mol/L,硫酸溶液)终止反应。用酶标仪在波长492nm处测定吸光度,应用计算机分析软件进行读数和数据分析,也可使用手工作图法计算。以标准品溶液吸光度对其相应的浓度作标准曲线,线性回归的相关系数应大于0.995。以供试品溶液吸光度在标准曲线上读出相应的鼠IgG残留量。

式中  c为供试品溶液鼠IgG残留量,ng/ml;

n为供试品溶液的稀释倍数;

F为成品的剂量规格,IU/剂量或μg/剂量;

T为供试品的效价或主成分蛋白质含量,IU/ml或μg/ml。

14 附录Ⅸ N 人凝血酶活性检查法

本法系依据凝.血酶能使人纤维蛋白原凝固的原理,将供试品和人纤维蛋白原混合,观察是否产生凝块,以此判定供试品是否具有凝血酶活性。

14.1 试剂

(1)0.5%纤维蛋白原溶液  用生理氯化钠溶液将复溶的冻干人纤维蛋白原溶液稀释成每1ml含5ng的溶液。

(2)人凝血酶溶液  用生理氯化钠溶液将复溶的冻干人凝血酶稀释成每1ml中含0.5IU的溶液。

14.2 测定法

取供试品0.2ml,加0.5%纤维蛋白原溶液0.2ml,37℃放置24小时,观察有无凝块或纤维蛋白析出。放置期闻至少观察2次,同时做阴性对照及阳性对照。

(1)阴性对照  用0.2ml生理氯化钠溶液替代供试品,同法操作。

(2)阳性对照  用0.2ml凝血酶溶液(每1ml含0.5 IU)替代供试品,同法操作。

14.3 结果判定

阴性对照无任何凝块或纤维蛋白析出,阳性对照有凝块或纤维蛋白析出,则试验成立。肉眼观察供试品应无凝块或纤维蛋白析出。

【附注】  含肝素的供试品应根据肝素含量,用适量的硫酸鱼精蛋白中和供试品内的肝素(按10μg硫酸鱼精蛋白中和1IU肝素进行),再取供试品照上述方法检查。

15 附录Ⅸ O 活化的凝血因子活性检查法

本法系依据活化的凝血因子在脑磷脂存在下,使缺血小板血浆发生凝固的原理,将供试品和缺血小板人血浆及脑磷脂混合,测定凝固时间,根据凝固时间判定供试品是否含有活化的凝血因子。

15.1 试剂

(1)缺血小板人血浆  无菌采集人全血于3.8%枸橼酸钠抗凝剂(体积比9:1)中,混匀,以每分钟1500转4℃离心30分钟,用塑料注射器取上层2/3的血浆,以每分钟3500转4℃离心30分钟,取上层2/3血浆,分装于塑料管中,每支3ml,保存于-40℃备用。

(2)三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液(pH7.5)称取三羟甲基氨基甲烷7.27g、氯化钠5.27g,加水溶解并稀释至1000ml(用盐酸调pH值至7.5)。

(3)脑磷脂混悬液  冻干脑磷脂加水复溶,量取适量用生理氯化钠溶液稀释,稀释后的脑磷脂混悬液应使空白凝固时间在200~300秒。

(4) 0.025mol/L氯化钙溶液  称取氯化钙(CaCl2·2H2O) 147g溶予1000ml水中,制成1mol/L氯化钙贮备液。临用时,用水将1mol/L氯化钙贮备液稀释40倍。(5)硫酸鱼精蛋白溶液  称取硫酸鱼精蛋白适量,用pH7.5的Tris缓冲液溶解并稀释成适宜浓度的溶液。

15.2 供试品溶液的制备

取复溶后的供试品,根据测得的肝素含量(2010年版药典三部附录Ⅸ P)加硫酸鱼精蛋白溶液适量,中和供试品中的肝素(10μg硫酸鱼精蛋白中和1IU肝素),再用Tris缓冲液(pH7.5)稀释10倍和100倍。

15.3 测定法

取缺血小板人血浆0.1ml,加脑磷脂混悬液0.1ml,混匀,37℃放置1分钟,加供试品溶液(10倍或100倍稀释液)0.1ml、已预热至37℃的0.025mol/L氯化钙溶液0.1ml,记录凝固时间。用Tris缓冲液(pH7.5) 0.1ml替代供试品溶液,同法操作,作空白对照。

15.4 结果判定

空白对照凝固时间不低于200秒,试验成立。1: 10和1: 100供试品稀释液凝固时间均应不低于150秒。

15.5 【附注】

(1)直接与血和血浆接触的器具应为塑料制品或硅化的玻璃制品。从供试品稀释到测定完毕应在30分钟内完成。

(2)供试品每个稀释度做2管。

16 附录Ⅸ P 肝素含量测定法(凝固法)

本法系依据硫酸鱼精蛋白能中和抗凝剂肝素,从而影响血浆凝固时间的原理,测定供试品中肝素含量。

16.1 试剂

(1)缺血小板人血浆  无菌采集人全血于3.8%枸橼酸钠抗凝剂(体积比9:1)中,混匀,以每分钟1500转4℃离心30分钟,用塑料注射器取上层2/3的血浆,以每分钟3500转4℃离心30分钟,取上层2/3血浆,分装于塑料管中,每支3ml,-40℃保存备用。

(2)三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液(pH7.5)  称取三羟甲基氨基甲烷7.27g、氯化钠5.27g,加水溶解并稀释至1000ml(用盐酸调pH值至7.5)。

(3)脑磷脂混悬液  冻干脑磷脂加水复溶,取适量,用生理氯化钠溶液稀释,稀释后的脑磷脂混悬液应使空白凝固时间在200~300秒。

(4) 0.025mol/L氯化钙溶液  称取氯化钙(CaCl2·2H2O) 147g溶于1000ml水中,制成1mol/L氯化钙贮备液。临用时,用水将1mol/L氯化钙贮备液稀释40倍。

(5)硫酸鱼精蛋白溶液  取硫酸鱼精蛋白适量,用pH7.5 Tris缓冲液溶解并稀释成每1ml含1~20mg的溶液。

16.2 供试品溶液的制备

于每支含不同浓度的硫酸鱼精蛋白溶液10μl的塑料管中,分别加入按标示量复溶后的供试品0.5ml,混匀。

16.3 测定法

在已含有缺血小板人血浆0.1ml的塑料管中,加入脑磷脂混悬液0.1ml,混匀,37℃放置1分钟,加供试品溶液0.1ml、已预热至37℃的0.025mol/L氯化钙溶液0.1ml,记录凝固时间。用Tris缓冲液(pH7.5)0.1ml替代供试品溶液,同法操作,作空白对照。空白对照凝固时间不低于200秒,试验成立。取凝固时间最短的供试品管,作为硫酸鱼精蛋白中和0.5ml供试品中的肝素量。硫酸鱼精蛋白10μg中和1IU肝素。例如凝固时间最短的供试品管中含硫酸鱼精蛋白30μg,则中和供试品0.5ml中的肝素量为3IU,即供试品每1ml含6IU肝素。

16.4 【附注】

(1)直接与血和血浆接触的器具应为塑料制品或硅化的玻璃制品。

(2)采用全自动凝血仪操作时,参考仪器使用说明书进行。

17 附录Ⅸ Q 人红细胞抗体测定法(微量板法)

本法系依据红细胞与红细胞抗体结合后发生凝集的原理,通过比较血凝反应终点,测定供试品中人红细胞抗体效价。

17.1 试剂

1% O型红细胞悬液  取3例或3例以上O型抗凝血混合,采血后7天内使用。用前以生理氯化钠溶液洗涤3次,末次以每分钟2000转离心10分钟,取压积红细胞适量,用生理氯化钠溶液制成1%浓度备用。

17.2 测定法

在“V"形、底角呈90°的96孔微量板上,用生理氯化钠溶液将供试品做2倍系列稀释,每个供试品做2排,每孔加入50μl。再向每孔加入1% O型红细胞悬液50μl,轻拍微量板30秒混匀。室温静置3小时观察结果,同时用生理氯化钠溶液替代供试品,同法操作,作阴性对照。

17.3 结果判定

将微量板置于白色背景之上,将供试品孔与阴性对照孔比较,红细胞沉于底部成一规则的圆点而孔壁未粘有红细胞判为阴性;孔壁上均匀附着1层红细胞,或红细胞未全部沉于底部,部分附着于孔壁上均判为阳性。以供试品出现阳性的最高稀释倍数为其红细胞抗体的效价。如同批供试品前后排结果相差在1个以上稀释度时应重试。相差1个稀释度时,则以2排结果中出现阳性的最高稀释度为该供试品的红细胞抗体效价。

18 附录Ⅸ R 人血小板抗体测定法

本法系采用血小板与血小板抗体结合后,使血小板发生凝集的原理,通过比较凝集反应终点测定供试品中人血小板抗体效价。

18.1 试剂

(1)5%乙二胺四乙酸二钠(EDTA)抗凝剂称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)0.365g、磷酸二氢钾0.875g、氯化钠2.125g、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2·2H2O)  12.5g,加水溶解并稀释至250ml。

(2)0.33% EDTA溶液  称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)0.73g、磷酸二氢钾1.75g、氯化钠4.25g、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2·2H2O)1.65g、加水溶解并稀释至500ml。

(3)血小板稀释液  取3人份以上AB型血清混合,56℃灭能30分钟,按AB型血清每100ml加硫酸钡50g的比例加入硫酸钡,置37℃吸附1小时,随时搅动,然后以每分钟3000转离心30分钟,弃去沉淀,吸上清液备用。试验当天按1份血清加3份生理氯化钠溶液配成血小板稀释液(注意AB型血清中不得混有红细胞及溶血)。(4)血小板悬液的制备  采集人静脉血 20ml,按5%EDTA溶液与全血以1:9(体积比)的比例混合,于20℃以每分钟800转离心15分钟,取上层血浆加0.33%EDTA溶液至原全血体积,于20℃以每分钟1500转离心10分钟,弃去上清液,如此再重复用0.33% EDTA洗涤2次,弃上清液,向沉淀中加血小板稀释液0.5ml,混匀,计数并将血小板浓度调至2.5×105~3.5×105/mm3即可(注意:计数时血小板悬液应在计数板上静置2~3分钟,并在10分钟内计数完)。

18.2 供试品溶液的制备

用生理氯化钠溶液将供试品做2倍系列稀释至1: 16。

18.3 阳性对照溶液的制备

取经人血小板免疫的猪血浆(或兔血清)0.5ml,60℃灭能10分钟,用硫酸钡0.05g于37℃吸附15分钟后,以每分钟3000转离心20分钟,取上清液备用。

18.4 阴性对照溶液的制备

生理氯化钠溶液及血小板稀释液。

18.5 测定法

量取不同稀释度供试品溶液各0.1ml,分别加血小板悬液0.1ml,于37℃保温30分钟后,滴到计数板上,静置2~3分钟,在20~40倍显微镜下观察结果。本试验同时设阴性对照、阳性对照组。

(1)阳性对照  取阳性对照溶液0.1ml,自“加血小板悬液0.1ml”起,同法操作。

(2)阴性对照  取阴性对照溶液0.1ml,自“加血小板悬液0.1ml”起,同法操作。

18.6 结果判定

阳性对照为“++”;阴性对照为“-”;试验成立。以“+”为判定终点,即以供试品出现“+”的最高稀释度为该供试品的血小板抗体效价。

18.7 【附注】

(1)“-”无凝块或偶见2~3个血小板成串。

(2)“+”小凝块,3~5个血小板凝集,游离血小板少。

(3)“++”大凝块,6个以上血小板聚集,几乎无游离血小板。

19 附录Ⅸ S 无细胞百日咳疫苗鉴别试验(酶联免疫法)

本法系采用酶联免疫法测定无细胞百日咳疫苗有效组分百日咳毒素PT)和丝状血凝素(FHA)。

19.1 试剂

(1)包被液(pH9.6碳酸盐缓冲液)  称取碳酸钠1.59g,碳酸氢钠2.93g,加水溶解,定容至1000ml。

(2)磷酸盐缓冲液(pH7.4)  称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g,加水溶解并稀释至1000ml,121℃灭菌15分钟。

(3)洗涤液(PBS-Tween20)  量取聚山梨酯20(Tween20)0.5ml,加磷酸盐缓冲液稀释至1000ml。

(4)封闭液  称取牛血清白蛋白1.0g,加洗涤液溶解并稀释至100ml。

(5)稀释液  称取牛血清白蛋白0.5g,加洗涤液溶解并稀释至100ml。

(6)底物缓冲液(0.005mol/L醋酸钠-枸橼酸缓冲液)  称取醋酸钠0.68g、枸橼酸(C6H8O7·H2O)1.05g.加水溶解并稀释至1000ml,调pH值至3.6。

(7)底物液A  称取3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB) 0.08g,加二甲基亚砜40ml溶解,加甲醇60ml,混匀,加底物缓冲液100ml,避光搅拌2小时至完全溶解.室温静置4小时后使用。

(8)底物液B  量取1.5%过氧化氢溶液3.2ml,加底物缓冲液稀释至1000ml。

(9)底物液  取底物液A和底物液B等体积混匀,临用前配制。

(10)终止液  2mol/L硫酸溶液。

19.2 阳性对照的制备

用纯化的PT或FHA参考品作阳性对照(2~8μg/ml)。

19.3 阴性对照的制备

用PBS或其他适宜的对照品作阴性对照。

19.4 供试品溶液的制备

取疫苗供试品适量,加枸橼酸钠或其他适宜的试剂进行疫苗解吸附处理。

19.5 测定法

分别取PT抗体或FHA抗体(2~5μg/ml)适量,以100μl/孔加至酶标板内,用封口膜封好,2~8℃放置16~20小时;用洗涤液洗板3次,以200μl/孔加封闭液至酶标板内,用封口膜封好,37℃放置1小时;将封闭好的酶标板用洗涤液洗板3次,以100μl/孔加入,PT或FHA阳性对照和供试品溶液,37℃放置1小时;用洗涤液洗板6次,稀释辣根过氧化物酶标记的PT抗体或FHA抗体至适当浓度,以100μl/孔加至酶标板内,用封口膜封好,37℃放置1小时;用洗涤液洗板6次,以100μl/孔加入底物液,室温避光放置5~l5分钟;以50μl/孔加入终止液终止反应。用酶标仪在适宜波长处测定吸光度。

19.6 结果判定

Cutoff值为阴性对照吸光度的2.1倍。阳性对照的吸光度应大于Cutoff值。

供试品溶液的吸光度大于Cutoff值者为阳性。

20 附录Ⅸ T 抗毒素抗血清制品鉴别试验(酶联免疫法)

本法系采用酶联免疫法检查抗毒素、抗血清制品的蛋白质成分。

20.1 试剂

(1)包被液(pH9.6碳酸盐缓冲液)  称取碳酸钠0.32g、碳酸氢钠0.586g,加水溶解并稀释至200ml。

(2)磷酸盐缓冲液(pH7.4)  称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.44g、磷酸二氢钾0.24g,加水溶解并稀释至1000ml,121℃灭菌15分钟。

(3)洗涤液(PBS-Tween20)  量取聚山梨酯200.5ml,加磷酸盐缓冲液至1000ml。

(4)封闭液  称取牛血清白蛋白2.0g,加洗涤液溶解并稀释至100ml。

(5)稀释液  称取牛血清白蛋白0.5g,加洗涤液溶解并稀释至100ml。

(6)底物缓冲液(0.005mol/L醋酸钠-枸橼酸缓冲液)  称取醋酸钠0.68g、枸橼酸(C6H8O7·H2O)1.05g,加水溶解并稀释至1000ml,调pH值至3.6。

(7)底物液A  称取3,3',5,5'-四甲基联苯胺0.08g.加二甲基亚砜40ml溶解,加甲醇60ml,混匀,加底物缓冲液100ml,避光搅拌2小时至完全溶解,避光室温静置4小时。

(8)底物液B  量取1.5%过氧化氢溶液3.2ml,加底物缓冲液稀释至1000ml。

(9)底物液  取底物液A、底物液B等体积混匀。临用前配制。

(10)终止液  2mol/L硫酸溶液。

20.2 阴性对照、阳性对照的制备

用马IgG作阳性对照,用人IgG、牛IgG、羊IgG、猪IgG作阴性对照,取阴性对照、阳性对照,用包被液稀释至适宜浓度。

20.3 供试品溶液的制备

取供试品适量,用包被液稀释成5~10μg/ml。

20.4 测定法

取供试品溶液及对照溶液,分别以100μl/孔加至酶标板内,供试品溶液及对照溶液均做双孔,用封口膜封好,2~8℃放置16~20小时;用洗涤液洗板3次,用封闭液以200μl/孔加至酶标板内,用封口膜封好,37℃放置1小时;将封闭好的酶标板用洗涤液洗板3次,用稀释液按1: 2000稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗马IgG抗体,以100μl/孔加至酶标板内,用封口膜封好,37℃放置1小时;用洗涤液洗板6次,以100μl/孔加入底物液,室温避光放置5~15分钟;以100μl/孔加入终止液终止反应。用酶标仪在波长450nm处测定吸光度。

20.5 结果判定

取4种阴性对照中吸光度最高的计算Cutoff值,Cutoff值为阴性对照吸光度(2孔平均值)的2.1倍。阳性对照的吸光度大于Cutoff值则试验成立,供试品吸光度大于Cutoff值时为阳性,表示供试品与马IgG同源

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  • 评论总管
    2021/1/28 7:52:43 | #0
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本页最后修订于 2015年1月14日 星期三 2:27:02 (GMT+08:00)
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