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2010年版药典三部附录Ⅲ

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1 拼音

2010 nián bǎn yào diǎn sān bù fù lù Ⅲ

中华人民共和国药典》(2010年版)三部附录Ⅲ 色谱法

色谱法根据其分离原理可分为:吸附色谱法分配色谱法离子交换色谱法与排阻色谱法等。吸附色谱法是利用被分离物质在吸附剂上吸附能力的不同,用溶剂气体洗脱使组分分离;常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质。分配色谱法是利用被分离物质在两相中分配系数的不同使组分分离,其中一相被涂布或键合在固体载体上,称为固定相,另一相为液体或气体,称为流动相;常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。离子交换色谱法是利用被分离物质在离子交换树脂上交换能力的不同使组分分离;常用的树脂有不同强度的阳离子交换树脂、阴离子交换树脂,流动相为水或含有机溶剂缓冲液分子排阻色谱法又称凝胶色谱法,是利用被分离物质分子大小的不同导致在填料上渗透程度不同使组分分离;常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等,根据固定相和供试品的性质选用水或有机溶剂作为流动相。

色谱法又可根据分离方法分为:纸色谱法薄层色谱法柱色谱法气相色谱法高效液相色谱法等。所用溶剂应与供试品不起化学反应,纯度要求较高。分离时的温度,除气相色谱法或另有规定外,系指在室温操作。分离后各成分的检测,应采用各品种项下所规定的方法。采用纸色谱法、薄层色谱法或柱色谱法分离有色物质时,可根据其色带进行区分;分离无色物质时,可在短波 (254nm)或长波(365nm)紫外光灯下检视,其中纸色谱或薄层色谱也可喷以显色剂使之显色,或在薄层色谱中用加有荧光物质的薄层硅胶,采用荧光猝灭法检视。柱色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法可用接于色谱柱出口处的各种检测器检测。柱色谱法还可分部收集流出液后用适宜方法测定。

2 附录Ⅲ A 纸色谱法

纸色谱法系以纸为载体,以纸上所含水分或其他物质为固定相,用展开剂进行展开的分配色谱。供试品经展开后,可用比移值(Rf)表示其各组成成分的位置(比移值=原点中心至斑点中心的距离/原点中心至展开剂前沿的距离)。由于影响比移值的因素较多,因而一般采用在相同实验条件下与对照物质对比以确定其异同。用作药品鉴别时,供试品在色谱图,中所显主斑点的位置与颜色(或荧光),应与对照品在色谱图中所显主斑点相同。用作药品纯度检查时,可取一定量的供试品,经展开后,按各品种项下的规定,检视其所显杂质斑点的个数或呈色深度(或荧光强度)。进行药品含量测定时,将色谱主斑点剪下经洗脱后,再用适宜的方法测定。

2.1 1.仪器与材料

2.1.1 (1)展开容器

通常为圆形或长方形玻璃缸,缸上具有磨口玻璃盖,应能密闭。用于下行法时,盖上有孔,可插入分液漏斗,用以加入展开剂。在近顶端有一用支架架起的玻璃槽作为展开剂的容器,槽内有一玻棒,用以压住色谱滤纸;槽的两侧各支一玻棒,用以支持色谱滤纸使其自然下垂。用于上行法时,在盖上的孔中加塞,塞中插入玻璃悬钩,以便将点样后的色谱滤纸挂在钩上;并除去溶剂槽和支架。

2.1.2 (2)点样器

常用具支架的微量注射器或定量毛细管,应能使点样位置正确、集中。

2.1.3 (3)色谱滤纸

质地均匀平整,具有一定机械强度,不含影响展开效果的杂质;也不应与所用显色剂起作用,以免影响分离和鉴别效果,必要时可进行处理后再用。用于下行法时,取色谱滤纸按纤维长丝方向切成适当大小的纸条,离纸条上端适当的距离(使色谱滤纸上端能足够浸入溶剂槽内的展开剂中,并使点样基线能在溶剂槽侧的玻璃支持棒下数厘米处)用铅笔划一点样基线,必要时,可在色谱滤纸下端切成锯齿形便于展开剂滴下。用于上行法时,色谱滤纸长约25cm,宽度则按需要而定,必要时可将色谱滤纸卷成筒形;点样基线距底边约2.5cm。

2.2 2.操作方法

2.2.1 (1)下行法

将供试品溶解于适宜的溶剂中制成一定浓度的溶液。用定量毛细管或微量注射器吸取溶液,点于点样基线上,溶液宜分次点加,每次点加后,俟其自然干燥、低温烘干或经温热气流吹干,样点直径为2~4mm,点间距离约为1.5~2.0cm,样点通常应为圆形。将点样后的色谱滤纸的点样端放在溶剂槽内并用玻棒压住,使色谱滤纸通过槽侧玻璃支持棒自然下垂,点样基线在支持棒下数厘米处。展开前,展开缸内用各品种项下规定的溶剂的蒸气使之饱和,一般可在展开缸底部放一装有规定溶剂的平皿或将被规定溶剂润湿的滤纸条附着在展开缸内壁上,放置一定时间,俟溶剂挥发使缸内充满饱和蒸气。然后小心添加展开剂至溶剂槽内,使色谱滤纸的上端浸没在槽内的展开剂中。展开剂即经毛细管作用沿色谱滤纸移动进行展开,展开至规定的距离后,取出色谱滤纸,标明展开剂前沿位置,俟展开剂挥散后按规定方法检测色谱斑点。

2.2.2 (2)上行法

点样方法同下行法。展开缸内加入展开剂适量,放置俟展开剂蒸气饱和后,再下降悬钩,使色谱滤纸浸入展开剂约0.5cm,展开剂即经毛细管作用沿色谱滤纸上升,除另有规定外,一般展开至约15cm后,取出晾干,按规定方法检视。

展开可以单向展开,即向一个方向进行;也可进行双向展开,即先向一个方向展开,取出,俟展开剂完全挥发后,将滤纸转动90°,再用原展开剂或另一种展开剂进行展开;亦可多次展开、连续展开或径向展开等。

3 附录Ⅲ B 高效液相色谱法

高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱,对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品,由流动相带入柱内,各组分在柱内被分离,并依次进入检测器,由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。

3.1 1.对仪器的一般要求和色谱条件

所用的仪器为高效液相色谱仪。仪器应定期检定并符合有关规定。

3.1.1 (1)色谱柱

反相色谱系统使用非极性填充剂,常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶,以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用,辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶(如氰基键合硅烷和氨基键合硅烷等)也有使用。正相色谱系统使用极性填充剂,常用的填充剂有硅胶等。离子交换色谱系统使用离子交换填充剂;分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂;对映异构体的分离通常使用手性填充剂。

填充剂的性能(如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等)以及色谱柱的填充,直接影响供试品的保留行为和分离效果。分析分子量小于2000的化合物应选择孔径在15nm(1nm=10A)以下的填料,分析分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料。

除另有规定外,普通分析柱的填充剂粒径一般在3~10μm之间,粒径更小(约2μm)的填充剂常用于填装微径柱(内径约2mm)。

使用微径柱时,输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配;如有必要,色谱条件也需作适当的调整。当对其测定结果产生争议时,应以品种项下规定的色谱条件的测定结果为准。

以硅胶为载体的键合固定相的使用温度通常不超过40℃,为改善分离效果可适当提高色谱柱的使用温度,但不宜超过60℃。

流动相的pH值控制在2~8之间。当pH值大于8时,可使载体硅胶溶解;当pH值小于2时,与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色谱系统中需使用pH值大于8的流动相时,应选用耐碱的填充剂,如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶填充剂、包覆聚合物填充剂、有机-无机杂化填充剂或非硅胶基键合填充剂等;当需使用pH值小于2的流动相时,应选用耐酸的填充剂,如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶填充剂、有机-无机杂化填充剂等。

3.1.2 (2)检测器

最常用的检测器为紫外检测器,包括二极管阵列检测器,其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。

紫外、荧光、电化学检测器为选择性检测器,其响应值不仅与供试品溶液的浓度有关,还与化合物的结构有关;蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用型检测器,对所有的化合物均有响应;蒸发光散射检测器对结构类似的化合物,其响应值几乎仅与供试品的质量有关;二极管阵列检测器可以同时记录供试品的吸收光谱,故可用于供试品的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。

紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与供试品溶液的浓度在一定范围内呈线性关系,但蒸发光散射检测器的响应值与供试品溶液的浓度通常呈指数关系,故进行计算时,一般需经对数转换

不同的检测器,对流动相的要求不同。如采用紫外检测器,所用流动相应符合紫外-可见分光光度法2010年版药典三部附录Ⅱ A)项下对溶剂的要求;采用低波长检测时,还应考虑有机相中有机溶剂的截止使用波长,并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发性盐组分的流动相。

3.1.3 (3)流动相

反相色谱系统的流动相首选甲酵-水系统(采用紫外末端波长检测时,首选乙腈-水系统),如经试用不适合时,再选用其他溶剂系统。应尽可能少用含有缓冲液的流动相,必须使用时,应尽可能选用含较低浓度缓冲液的流动相。由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态,故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统,流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5%.否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化,造成色谱系统不稳定

各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得改变外,其余如色谱柱内径、长度、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等,均可适当改变,以适应供试品并达到系统适用性试验的要求。其中,调整流动相组分比例时,以组分比例较低者(小于或等于50%)相对于自身的改变量不超过±30%且相对于总量的改变量不超过±10%为限,如30%相对改变量的数值超过总量的10%时,则改变量以总量的±10%为限。

对于必须使用特定牌号的填充剂方能满足分离要求的品种,可在该品种项下注明。

3.2 2.系统适用性试验

色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个参数。其中,分离度和重复性尤为重要。

按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试验,即用规定的对照品溶液或系统适用性试验溶液在规定的色谱系统进行试验,必要时,可对色谱系统进行适当调整,以符合要求。

3.2.1 (1)色谱柱的理论板数(n)

用于评价色谱柱的分离效能。由于不同物质在同一色谱柱上的色谱行为不同,采用理论板数作为衡量柱效能的指标时,应指明测定物质,一般为待测组分或内标物质的理论板数。

在规定的色谱条件下,注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液,记录色谱图,量出供试品主成分峰或内标物质峰的保留时间tR(以分钟或长度计,下同,但应取相同单位)和峰宽(W)或半高峰宽(Wh/2),按n=16 (tR/W2或n=5.54(tR/Wh/22计算色谱柱的理论板数。

3.2.2 (2)分离度(R)

用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的分离程度,是衡量色谱系统效能的关键指标。可以通过测定待测物质与已知杂质的分离度,也可以通过测定待测组分与某一添加的指标性成分(内标物质或其他难分离物质)的分离度,或将供试品或对照品用适当的方法降解,通过测定待测组分与某一降解产物的分离度,对色谱系统进行评价与控制。

无论是定性鉴别还是定量分析,均要求待测峰与其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。除另有规定外,待测组分与相邻共存物之间的分离度应大于1.5。分离度的计算公式为:

式中  tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间;

tR1为相邻两峰中前一蜂的保留时间;

W1、W2及W1,h/2、W2,h/2分别为此相邻两峰的峰宽及半高峰宽(如图)。

当对测定结果有异议时,色谱柱的理论板数(n)和分离度(R)均以峰宽(W)的计算结果为准。

3.2.3 (3)重复性

用于评价连续进样中,色谱系统响应值的重复性能。采用外标法时,通常取各品种项下的对照品溶液,连续进样5次,除另有规定外,其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%;采用内标法时,通常配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液,加入规定量的内标溶液,配成3种不同浓度的溶液,分别至少进样2次,计算平均校正因子。其相对标准偏差应不大于2.0%。

(4)拖尾因子(T)  用于评价色谱峰的对称性。为保证分离效果和测量精度,应检查待测峰的拖尾因子是否符合各品种项下的规定。拖尾因子计算公式为:

式中W0.05h为5%峰高处的峰宽;

d1为峰顶点至峰前沿之间的距离(如图)。

除另有规定外,峰高法定量时T虚在0.95~1.05之间。峰面积法测定时,若拖尾严重,将影响峰面积的准确测量。必要时,应在各品种项下对拖尾因子作出规定。

3.3 3.测定法

3.3.1 (1)内标法

按各品种顼下的规定,精密称(量)取对照品和内标物质,分别配成溶液,精密量取各适量,混合配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器,记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高,按下式计算校正因子:

式中AS为内标物质的峰面积或峰高;

AR为对照品的峰面积或峰高;

CS为内标物质的浓度;

CR为对照品的浓度。

再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液,注入仪器,记录色谱图,测量供试品中待测成分和内标物质的峰面积或峰高,按下式计算含量:

式中  AX为供试品的峰面积或峰高;

cX为供试品的浓度;

A'S为内标物质的峰面积或峰高;

C'S为内标物质的浓度;

f为校正因子。

采用内标法,可避免因样品前处理及进样体积误差对测定结果的影响。

3.3.2 (2)外标法

按各品种项下的规定,精密称(量)取对照品和供试品,配制成溶液,分别精密取一定量,注入仪器,记录色谱图,测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积(或峰高),按下式计算含量:

式中各符号意义同上。

由于微量注射器不易精确控制进样量,当采用外标法测定供试品中成分或杂质含量时,以定量环或自动进样器进样为好。

3.3.3 (3)加校正因子的主成分自身对照法

测定杂质含量时,可采用加校正因子的主成分自身对照法。在建立方法时,按各品种项下的规定,精密称(量)取杂质对照品和待测成分对照品各适量,配制测定杂质校正因子的溶液,选样,记录色谱图,接上述(1)法计算杂质的校正因子。此校正因子可直接载入各品种项下,用于校正杂质的实测峰面积。这些需作校正计算的杂质,通常以主成分为参照,采用相对保留时间定位,其数值一并载入各品种项下。

测定杂质含量时,按各品种项下规定的杂质限度,将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液作为对照溶液,进样,调节检测灵敏度(以噪声水平可接受为限)或进样量(以柱子不过载为限),使对照溶液的主成分色谱峰的峰高约达满量程的10%~25%或其峰面积能准确积分[通常含量低于0.5%的杂质,峰面积的相对标准偏差(RSD)应小于10%;含量在0.5%~2%的杂质,峰面积的RSD应小于5%;含量大于2%的杂质,峰面积的RSD应小于2%]。然后,取供试品溶液和对照品溶液适量,分别进样,供试品溶液的记录时间,除另有规定外,应为主成分色谱峰保留时间的2倍,测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积,分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较,依法计算各杂质含量。

3.3.4 (4)不加校正因子的主成分自身对照法

测定杂质含量时,若没有杂质对照品,也可采用不加校正因子的主成分自身对照法。同上述(3)法配制对照溶液并调节检测灵敏度后,取供试品溶液和对照溶液适量,分别进样,前者的记录时间,除另有规定外,应为主成分色谱峰保留时间的2倍,测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积并与对照溶液主成分的峰面积比较,计算杂质含量。

若供试品所含的部分杂质未与溶剂峰完全分离,则按规定先记录供试品溶液的色谱图Ⅰ,再记录等体积纯溶剂的色谱图Ⅱ。色谱图Ⅰ上杂质峰的总面积(包括溶剂峰),减去色谱图Ⅱ上的溶剂峰面积,即为总杂质峰的校正面积。然后依法计算。

3.3.5 (5)面积归一化法

按备品种项下的规定,配制供试品溶液,取一定量注入仪器,记录色谱图。测量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积,计算各峰面积占总峰面积的百分率。用于杂质检查时,由于峰面积归一化法测定误差大,因此,通常只用于粗略考查供试品中的杂质含量。除另有规定外,一般不宜用于微量杂质的检查。

4 附录Ⅲ C 气相色谱法

气相色谱法系采用气体为流动相(载气)流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。物质或其衍生物气化后,被载气带入色谱柱进行分离,各组分先后进入检测器,用数据处理系统记录色谱信号。

4.1 1.对仪器的一般要求

所用的仪器为气相色谱仪,由载气源、进样部分、色谱柱、柱温箱、检测器和数据处理系统等组成。进样部分、色谱柱和检测器的温度均应根据分析要求适当设定

4.1.1 (1)载气源

气相色谱法的流动相为气体,称为载气,氦、氮和氢可用作载气,可由高压钢瓶或高纯度气体发生器提供,经过适当的减压装置,以一定的流速经过进样器和色谱柱;根据供试品的性质和检测器种类选择载气,除另有规定外,常用载气为氮气。

4.1.2 (2)进样部分

进样方式一般可采用溶液直接进样、自动进样或顶空进样。

溶液直接进样采用微量注射器、微量进样阀或有分流装置的气化室进样;采用溶液直接进样或自动进样时,进样口温度应高于柱温30~50℃;进样量一般不超过数微升;柱径越细,进样量应越少;采用毛细管柱时,一般应分流,以免过载。

顶空进样适用于固体和液体供试品中挥发性组分的分离和测定。将固态或液态的供试品制成供试液后,置于密闭小瓶中,在恒温控制的加热室中加热至供试品中挥发性组分在液态和气态达到平衡后,由进样器自动吸取一定体积的顶空气注入色谱柱中。

4.1.3 (3)色谱柱

色谱柱为填充柱或毛细管柱。填充柱的材质为不锈钢或玻璃,内径为2~4mm,柱长为2~4m,内装吸附剂、高分子多孔小球或涂渍固定液的载体,粒径为0.18~0.25mm、0.15~0.18mm或0.125~0.15mm。常用载体为经酸洗并硅烷化处理的硅藻土或高

分子多孔小球,常用固定液有甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。毛细管柱的材质为玻璃或石英,内壁或载体经涂渍或交联固定液,内径一般为0.25mm、0.32mm或0.53mm,柱长5~60m,固定液膜厚0.1~5.0μm,常用的固定液有甲基聚硅氧烷、不同比例组成的苯基甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。

新填充柱和毛细管柱在使用前需老化处理,以除去残留溶剂及易流失的物质,色谱柱如长期未用,使用前应老化处理,使基线稳定。

4.1.4 (4)柱温箱

由于柱温箱温度的波动会影响色谱分析结果的重现性,因此柱温箱控温精度应在±1℃,且温度波动小于每小时0.1℃。温度控制系统分为恒温和程序升温两种。

4.1.5 (5)检测器

适合气相色谱法的检测器有火焰离子化检测器(FID)、热导检测器(TCD)、氮磷检测器(NPD)、火焰光度检测器(FPD)、电子捕获检测器(ECD)、质谱检测器(MS)等。火焰离子化检测器对碳氢化合物响应良好,适合检测大多数的药物;氮磷检测器对含氮、磷元素的化合物灵敏度高;火焰光度检测器对含磷、硫元素的化合物灵敏度高;电子捕获检测器适于含卤素的化合物;质谱检测器还能给出供试品某个成分相应的结构信息,可用于结构确证。除另有规定外,一般用火焰离子化检测器,用氢气作为燃气,空气作为助燃气。在使用火焰离子化检测器时,检测器温度一般应高于柱温,并不得低于150℃,以免水汽凝结,通常为250~350℃。

4.1.6 (6)数据处理系统

可分为记录仪、积分仪以及计算机工作站等。

各品种项下规定的色谱条件,除检测器种类、固定液品种及特殊指定的色谱柱材料不得改变外,其余如色谱柱内径、长度、载体牌号、粒度、固定液涂布浓度、载气流速、柱温一进样量、检测器的灵敏度等,均可适当改变,以适应具体品种并符合系统适用性试验的要求。一般色谱图约于30分钟内记录完毕。

4.2 2.系统适用性试验

除另有规定外,应照高效液相色谱法(2010年版药典三部附录Ⅲ B)项下的规定。

4.3 3.测定法

(1)内标法

(2)外标法

(3)面积归一化法

上述(1)~(3)法的具体内容均同高效液相色谱法(2010年版药典三部附录Ⅲ B)项下相应的规定。

(4)标准溶液加入法  精密称(量)取某个杂质或待测成分对照品适量,配制成适当浓度的对照品溶液,取一定量,精密加入到供试品溶液中,根据外标法或内标法测定杂质或主成分含量,再扣除加入的对照品溶液含量,即得供试品溶液中某个杂质和主成分含量。

也可按下述公式进行计算,加入对照品溶液前后校正因子应相同,即:

则待测组分的浓度cX可通过如下公式进行计算:

式中  cX为供试品中组分X的浓度;

AX为供试品中组分X的色谱峰面积;

△cX为所加入的已知浓度的待测组分对照品的浓度;

Ais为加入对照品后组分X的色谱峰面积。

由于气相色谱法的进样量一般仅数微升,为减小进样误差,尤其当采用手工进样时,由于留针时间和室温等对进样量也有影响,故以采用内标法定量为宜;当采用自动进样器对,由于进样重复性的提高,在保证分析误差的前提下,也可采用外标法定量。当采用顶空进样时,由于供试品和对照品处于不完全相同的基质中,故可采用标准溶液加入法以消除基质效应的影响;当标准溶液加入法与其他定量方法结果不一致时,应以标准加入法结果为准。

5 附录Ⅲ D 分子排阻色谱法

分子排阻色谱法是根据待测组分的分子大小进行分离的一种液相色谱技术。分子排阻色谱法的分离原理为凝胶色谱柱的分子筛机制。色谱柱多以亲水硅胶、凝胶或经修饰凝胶如葡聚糖凝胶(Sephadex)和聚丙烯酰胺凝胶(Sepharose)等为填充剂,这些填充剂表面分布着不同尺寸的孔径,药物分子进入色谱柱后,它们中的不同组分按其分子大小进入相应的孔径内,大于所有孔径的分子不能进入填充剂颗粒内部,在色谱过程中不被保留,最早被流动相洗脱至柱外,表现为保留时间较短;小于所有孔径的分子能自由进入填充剂表面的所有孔径,在色谱桂中滞留时间较长,表现为保留时间较长;其余分子则按分子大小依次被洗脱。

5.1 1.对仪器的一般要求

分子排阻色谱法所需的进样器和检测器同高效液相色谱法,液相色谱泵一般分常压、中压和高压。在药物分析中,尤其是分子量或分子量分布测定中,通常采用高效分子排阻色谱法(HPSEC)。应选用与供试品分子大小相适应的色谱柱填充剂。使用的流动相通常为水溶液或缓冲液,溶液的pH值不宜超出填充剂的耐受力,一般pH值在2~8范围。流动相中可加入适量的有机溶剂,但不宜过浓,一般不应超过30%,流速不宜过快,一般为0.5~1.0ml/min。

5.2 2.系统适用性试验

高效分子排阻色谱法的系统适用性试验中色谱柱的理论板数(n)、分离度、重复性、拖尾因子的测定方法,在一般情况下,同高效液相色谱法项下方法,但在高分

子杂质检查时,某些药物分子的单体与其二聚体不能达到基线分离时,其分离度的计算公式为:

除另有规定外,分离度应大子2.0。

5.3 3.测定法

5.3.1 (1)分子量测定法

一般适用于蛋白质多肽的分子量测定。按各品种项下规定的方法,选用与供试品分子大小相适宜的色谱柱和适宜分子量范围的对照品,除另有规定外,对照品与供试品均需使用二硫苏糖醇(DTT)和十二烷基硫酸钠SDS)处理,以打开分子内和分子间的二硫键,并使分子的构型与构象趋于一致,经处理的蛋白质和多肽分子通常以线性形式分离,以对照品分子量(Mw)的对数值对相应的保留时间(tR)制得标准曲线的线性回归方程lgMw=α+btR,供试品以保留时间由标准曲线回归方程计算其分子量或亚基的分子量。

5.3.2 (2)生物大分子聚合物分子量与分子量分布的测定法

生物大分子聚合物如多糖、多聚核苷酸胶原蛋白等具有分子大小不均一的特点,故生物大分子聚合物分子量与分子量分布是控制该类产品的关键指标。在测定生物大分子聚合物分子量与分子量分布时,选用与供试品分子结构与性质相同或相似的对照品十分重要。

按各品种项下规定的方法,除另有规定外,同样采用分子量对照品和适宜的GPC软件,以对照品重均分子量(Mw)的对数值对相应的保留时间(tR)制得标准曲线的线性回归方程lgMw=a+btR,供试品采用适宜的GPC软件处理结果,并按下列公式计算出供试品的分子量与分子量分布。

式中Mn为数均分子量;Mw为重均分子量;

D为分布系数;

RIi为供试品在保留时间i时的峰高;

Mi为供试品在保留时间i时的分子量。

5.3.3 (3)高分子杂质测定法

高分子杂质系指供试品中含有分子量大于药物分子的杂质,通常是药物在生产或贮存过程中产生的高分子聚合物或在生产过程中未除尽的可能产生过敏反应的高分子物质。

按各品种项下规定的色谱条件进行分离。

定量方法

①主成分自身对照法  同高效液相色谱法项下规定。一般用于高分子杂质含量较低的品种。

②面积归一化法  同高效液相色谱法项下规定。

③限量法  除另有规定外,规定不得检出保留时间小于对照品保留时间的组分,一般用于混合物中高分子物质的控制。

④自身对照外标法  一般用于Sephadex G-10凝胶色谱系统中β-内酰胺抗生素中高分子杂质的检查。在该分离系统中,除部分寡聚物外,β-内酰胺抗生素中高分子杂质在色谱过程中均不保留,即所有的高分子杂质表现为单一的色谱峰,以供试品自身为对照品,按外标法计算供试品中高分子杂质的相对百分含量。

【附注】  Sephadex G-10的处理方法

色谱柱的填装  装柱前先将约15g葡聚糖凝胶Sephadex G-l0用水浸泡48小时,使之充分溶胀,搅拌除去空气泡,徐徐倾入玻璃柱,一次性装填完毕,以免分层,然后用水将附着玻璃管壁的Sephadex G-10洗下,使色谱柱面平整,新填装的色谱柱要先用水连续冲洗4~6小时,以排出柱中的气泡。

供试品的加入  进样可以采用自动进样阀,也可以直接将供试品加在床的表面(此时,先将床表面的流动相吸干或渗干,立即将供试品溶液沿着色谱管壁转圈缓缓加入,注意勿使填充剂翻起,待之随着重力的作用渗入固定相后,再沿着色谱管壁转圈缓缓加入3~5ml流动相,以洗下残留在色谱管壁的供试品溶液)。

6 附录Ⅲ E 离子色谱法

离子色谱法系采用高压输液泵系统将规定的洗脱液泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱分析方法。注入的供试品由洗脱液带入色谱柱内进行分离后,经过抑制器或衍生系统进入检测器,由积分仪或数据处理系统记录色谱信号。离子色谱法常用于无机阴离子、无机阳离子、有机酸、糖醇类、氨基糖类、氨基酸、蛋白质、糖蛋白等物质的定性和定量分析。它的分离机理主要为离子交换,即基于离子交换树脂上可解离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子之间进行的可逆交换;离子色谱法的其他分离机理还有形成离子对、离子排阻等。

6.1 1.对仪器的一般要求

离子色谱仪器中所有与洗脱液或供试品接触的管道、器件均应使用惰性材料,如聚醚醚酮(PEEK)等。仪器应定期检定并符合有关规定。

6.1.1 (1)色谱柱

离子交换色谱的色谱柱填充剂有两种,分别是有机聚合物载体填充剂和无机载体填充剂。

有机聚合物载体填充剂最为常用,填充剂的载体一般为苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、乙基乙烯基苯-二乙烯基苯共聚物、聚甲基丙烯酸酯或聚乙烯聚合物等有机聚合物。这类载体的表面通过离子键附聚了大量具有阴离子交换功能基(如烷基季铵基、烷醇季铵基等)或阳离子交换功能基(如磺酸、羧酸、羧酸-膦酸和羧酸-膦酸冠醚等)的乳胶微粒,可分别用于阴离子或阳离子的交换分离。有机聚合物载体填充剂在较宽的酸碱范围(pH0~14)内具有较高的稳定性,且有一定的耐有机溶剂腐蚀性。

无机载体填充剂一般以硅胶为载体。在硅胶表面的硅醇基通过化学键合季铵基等阴离子交换功能基或磺酸基、羧酸基等阳离子交换功能基,可分别用于阴离子或阳离子的交换分离。硅胶载体填充剂机械稳定性好、在有机溶剂中不会溶胀或收缩。硅胶载体填充剂在pH2~8的洗脱液中稳定,一般适用于阳离子样品的分离。

6.1.2 (2)洗脱液

离子色谱对复杂样品的分离主要依赖于色谱柱的填充剂,而洗脱液相对较为简单。分离阴离子常采用稀碱溶液、碳酸盐缓冲液等作为洗脱液;分离阳离子常采用稀甲烷磺酸溶液等作为洗脱液。通过增加或减少洗脱液中酸碱溶液的浓度可提高或降低洗脱液的洗脱能力;在洗脱液内加入适当比例的有机改性剂,如甲醇、乙腈等可改善色谱峰峰形。制备洗脱液的去离子水应经过纯化处理,电导率一般小于0.056μS/cm。使用的洗脱液需经脱气处理,常采用氦气在线脱气的方法,也可采用超声、减压过滤或冷冻的方式进行离线脱气。

6.1.3 (3)检测器

电导检测器是离子色谱常用的检测器,其他检测器有紫外检测器、安培检测器、蒸发光散射检测器等。

电导检测器主要用于测定无机阴离子、无机阳离子和部分极性有机物,如羧酸等。离子色谱法中常采用抑制型电导检测器,即使用抑制器将具有较高电导率的洗脱液在进入检测器之前中和成具有极低电导率的水或其他较低电导率的溶液,从而显著提高电导检测的灵敏度。安培检测器用于分析解离度低,但具有氧化或还原性质的化合物。直流安培检测器可以测定碘离子(I-)、硫氰酸根离子(SCN-)和各种酚类化合物等。积分安培检测器和脉冲安培检测器则常用于测定糖类和氨基酸类化合物。

紫外检测器适用于在高浓度氯离子等存在下痕量的溴离子(Br-)、亚硝酸根离子(NO2-)、硝酸根离子(NO3-)以及其他具有强紫外吸收成分的测定。柱后衍生-紫外检测法常用于分离分析过渡金属离子和镧系金属等。蒸发光散射、原子吸收、原子发射光谱、电感耦合等离子体原子发射光谱、质谱(包括电感耦合等离子体质谱)也可作为离子色谱的检测器。离子色谱在与蒸发光散射检测器或(和)质谱检测器等联用时,一般采用带有抑制器的离子色谱系统。

6.2 2.样品处理

离子色谱法的色谱柱填充剂大多数不兼容有机溶剂,一旦污染后不能用有机溶剂清洗,所以离子色谱法对样品处理的要求较高。对于基质简单的澄清水溶液一般通过稀释和0.45μm滤膜过滤后直接进样分析。对于基质复杂的样品,可通过微波消解、紫外光降解、固相萃取等方法去除干扰物后进样分析。

6.3 3.系统适用性试验

照高效液相色谱法(2010年版药典三部附录Ⅲ B)项下相应的规定。

6.4 4.测定法

(1)内标法

(2)外标法

(3)面积归一化法

上述(1)~(3)法的具体内容均同高效液相色谱法(2010年版药典三部附录Ⅲ B)项下相应的规定。

(4)标准曲线法  按各品种项下的规定,精密称(量)取对照品适量配制成贮备溶液。分别量取贮备溶液配制成一系列梯度浓度的对照溶液。量取上述梯度浓度的对照品溶液各适量注入仪器,记录色谱图,测量对照品溶液中待测组分的峰面积或峰高。以标准溶液的峰面积或峰高为纵坐标,以标准溶液的浓度为横坐标,回归计算标准曲线,其公式为:

AR=a×CR+b

式中AR为对照溶液的峰面积或峰高;

CR为对照溶液的浓度;

a为标准曲线的斜率;

b为标准曲线的截距。

再取各品种项下供试品溶液,注入色谱仪,记录色谱图,测量供试品溶液中待测成分(或其杂质)的峰面积或峰高。按下式计算其浓度:

式中AS为供试品溶液的峰面积或峰高;

CS为供试品溶液的浓度;

a、b符号的意义同上。

上述测定法中,以外标法和标准曲线法最为常用。

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  • 评论总管
    2019/8/23 15:26:57 | #0
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本页最后修订于 2015年1月14日 星期三 1:46:37 (GMT+08:00)
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