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2010年版药典二部附录Ⅴ

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目录

1 拼音

2010nián bǎn yào diǎn èr bù fù lù Ⅴ

中华人民共和国药典》(2010年版)二部附录 Ⅴ 色谱法

色谱法根据其分离原理可分为:吸附色谱法分配色谱法离子交换色谱法与排阻色谱法等。吸附色谱法是利用被分离物质在吸附剂上吸附能力的不同,用溶剂气体洗脱使组分分离;常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质。分配色谱法是利用被分离物质在两相中分配系数的不同使组分分离,其中一相被涂布或键合在固体载体上,称为固定相,另一相为液体或气体,称为流动相;常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。离子交换色谱法是利用被分离物质在离子交换树脂上交换能力的不同使组分分离;常用的树脂有不同强度的阳离子交换树脂、阴离子交换树脂,流动相为水或含有机溶剂缓冲液分子排阻色谱法又称凝胶色谱法,是利用被分离物质分子大小的不同导致在填料上渗透程度不同使组分分离;常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等,根据固定相和供试品的性质选用水或有机溶剂作为流动相。

色谱法又可根据分离方法分为:纸色谱法薄层色谱法柱色谱法气相色谱法高效液相色谱法等。所用溶剂应与供试品不起化学反应,纯度要求较高。分离时的温度,除气相色谱法或另有规定外,系指在室温操作。分离后各成分的检测,应采用各品种项下所规定的方法。采用纸色谱法、薄层色谱法或柱色谱法分离有色物质时,可根据其色带进行区分;分离无色物质时,可在短波(254nm)或长波(365nm)紫外光灯下检视,其中纸色谱或薄层色谱也可喷以显色剂使之显色,或在薄层色谱中用加有荧光物质的薄层硅胶,采用荧光猝灭法检视。柱色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法可用接于色谱柱出口处的各种检测器检测。柱色谱法还可分部收集流出液后用适宜方法测定。

2 附录Ⅴ A 纸色谱法

纸色谱法系以纸为载体,以纸上所含水分或其他物质为固定相,用展开剂进行展开的分配色谱。供试品经展开后,可用比移值(Rf)表示其各组成成分的位置(比移值=原点中心至斑点中心的距离/原点中心至展开剂前沿的距离)。由于影响比移值的因素较多,因而一般采用在相同实验条件下与对照物质对比以确定其异同。用作药品鉴别时,供试品在色谱图中所显主斑点的位置与颜色(或荧光),应与对照品在色谱图中所显主斑点相同。用作药品纯度检查时,可取一定量的供试品,经展开后,按各品种项下的规定,检视其所显杂质斑点的个数或呈色深度(或荧光强度)。进行药品含量测定时,将色谱主斑点剪下经洗脱后,再用适宜的方法测定。

2.1 1.仪器与材料

(1)展开容器 通常为圆形或长方形玻璃缸,缸上具有磨口玻璃盖,应能密闭。用于下行法时,盖上有孔,可插入分液漏斗,用以加入展开剂。在近顶端有一用支架架起的玻璃槽作为展开剂的容器,槽内有一玻棒,用以压住色谱滤纸;槽的两侧各支一玻棒,用以支持色谱滤纸使其自然下垂。用于上行法时,在盖上的孔中加塞,塞中插入玻璃悬钩,以便将点样后的色谱滤纸挂在钩上;并除去溶剂槽和支架。

(2)点样器 常用具支架的微量注射器或定量毛细管,应能使点样位置正确、集中。

(3)色谱滤纸 应质地均匀平整,具有一定机械强度,不含影响展开效果的杂质;也不应与所用显色剂起作用,以免影响分离和鉴别效果,必要时可进行处理后再用。用于下行法时,取色谱滤纸按纤维长丝方向切成适当大小的纸条,离纸条上端适当的距离(使色谱滤纸上端能足够浸入溶剂槽内的展开剂中,并使点样基线能在溶剂槽侧的玻璃支持棒下数厘米处)用铅笔划一点样基线,必要时,可在色谱滤纸下端切成锯齿形便于展开剂滴下。用于上行法时,色谱滤纸长约25cm,宽度则按需要而定,必要时可将色谱滤纸卷成筒形;点样基线距底边约2.5cm。

2.2 2.操作方法

(1)下行法 将供试品溶解于适宜的溶剂中制成一定浓度的溶液。用定量毛细管或微量注射器吸取溶液,点于点样基线上,溶液宜分次点加,每次点加后,俟其自然干燥、低温烘干或经温热气流吹干,样点直径为2~4mm,点间距离约为1.5~2.0cm,样点通常应为圆形。

将点样后的色谱滤纸的点样端放在溶剂槽内并用玻棒压住,使色谱滤纸通过槽侧玻璃支持棒自然下垂,点样基线在支持棒下数厘米处。展开前,展开缸内用各品种项下规定的溶剂的蒸气使之饱和,一般可在展开缸底部放一装有规定溶剂的平皿或将被规定溶剂润湿的滤纸条附着在展开缸内壁上,放置一定时间,俟溶剂挥发使缸内充满饱和蒸气。然后小心添加展开剂至溶剂槽内,使色谱滤纸的上端浸没在槽内的展开剂中。展开剂即经毛细管作用沿色谱滤纸移动进行展开,展开至规定的距离后,取出色谱滤纸,标明展开剂前沿位置,俟展开剂挥散后按规定方法检测色谱斑点。

(2)上行法 点样方法同下行法。展开缸内加入展开剂适量,放置俟展开剂蒸气饱和后,再下降悬钩,使色谱滤纸浸入展开剂约0.5cm,展开剂即经毛细管作用沿色谱滤纸上升,除另有规定外,一般展开至约15cm后,取出晾干,按规定方法检视。

展开可以单向展开,即向一个方向进行;也可进行双向展开,即先向一个方向展开,取出,俟展开剂完全挥发后,将滤纸转动90°,再用原展开剂或另一种展开剂进行展开;亦可多次展开、连续展开或径向展开等。

3 附录Ⅴ B 薄层色谱法

薄层色谱法系将供试品溶液点样于薄层板上,经展开、检视后所得的色谱图,与适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比,用于药品的鉴别或杂质检查的方法。

3.1 1.仪器与材料

(1)薄层板

自制薄层板 除另有规定外,玻璃板要求光滑、平整,洗净后不附水珠,晾干。最常用的固定相有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H和硅胶HF254,其次有硅藻土、硅藻土G、氧化铝、氧化铝G、微晶纤维素、微晶纤维素F254等。其颗粒大小,一般要求粒径为5~40μm。

薄层涂布,一般可分为无黏合剂和含黏合剂两种。前者系将固定相直接涂布于玻璃板上,后者系在固定相中加入一定量的黏合剂,一般常用10%~15%煅石膏(CaSO4·2H2O在140℃加热4小时),混匀后加水适量使用,或用羧甲基纤维素钠水溶液(0.2%~0.5%)适量调成糊状,均匀涂布于玻璃板上。使用涂布器涂布应能使固定相在玻璃板上涂成一层符合厚度要求的均匀薄层。

市售薄层板 分普通薄层板和高效薄层板,如硅胶薄层板、硅胶GF254薄层板、聚酰胺薄膜和铝基片薄层板等。高效薄层板的粒径一般为5~7μm。

(2)点样器 同纸色谱法项下。

(3)展开容器 应使用适合薄层板大小的玻璃制薄层色谱展开缸,并有严密的盖子,底部应平整光滑,或有双槽。

(4)显色剂 见各品种项下的规定。可采用喷雾显色、浸渍显色或置适宜试剂的蒸气中熏蒸显色,用以检出斑点。

(5)显色装置 喷雾显色要求用压缩气体使显色剂呈均匀

细雾状喷出;浸渍显色可用专用玻璃器皿或用适宜的玻璃缸代替;蒸气熏蒸显色可用双槽玻璃缸或适宜大小的干燥器代替。

(6)检视装置 为装有可见光、短波紫外光(254nm)、长波紫外光(365nm)光源及相应滤片的暗箱,可附加摄像设备供拍摄色谱用,暗箱内光源应有足够的光照度

3.2 2.操作方法

(1)薄层板制备

自制薄层板 除另有规定外,将1份固定相和3份水在研钵中按同一方向研磨混合,去除表面的气泡后,倒入涂布器中,在玻璃板上平稳地移动涂布器进行涂布(厚度为0.2~0.3mm),取下涂好薄层的玻璃板,置水平台上于室温下晾干后,在110℃活化30分钟,即置有干燥剂的干燥箱中备用。使用前检查其均匀度(可通过透射光和反射光检视)。

市售薄层板 临用前一般应在110℃活化30分钟。聚酰胺薄膜不需活化。铝基片薄层板可根据需要剪裁,但须注意剪裁后的薄层板底边的硅胶层不得有破损。如在贮放期间被空气中杂质污染,使用前可用适宜的溶剂在展开容器中上行展开预洗,110℃活化后,置干燥器中备用。

(2)点样 除另有规定外,用点样器点样于薄层板上,一般为圆点,点样基线距底边2.0cm,样点直径为2~4mm(高效薄层板为1~2mm),点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜,一般为1.0~2.0cm(高效薄层板可不小于5mm)。点样时必须注意勿损伤薄层板表面。

(3)展开 展开缸如需预先用展开剂饱和,可在缸中加入足够量的展开剂,必要时在壁上贴两条与缸一样高、宽的滤纸条,一端浸入展开剂中,密封顶盖,使系统平衡或按各品种项下的规定操作。

将点好供试品的薄层板放入展开缸中,浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5~1.0cm(切勿将样点浸入展开剂中),密封顶盖,待展开至适宜的展距(如:20cm的薄层板,展距一般为10~15cm;10cm的高效薄层板,展距一般为5cm左右),取出薄层板,晾干,按各品种项下的规定检测。

展开可以单向展开,即向一个方向进行;也可以进行双向展开,即先向一个方向展开,取出,待展开剂完全挥发后,将薄层板转动90°,再用原展开剂或另一种展开剂进行展开;亦可多次展开。

(4)显色与检视 荧光薄层板可用荧光猝灭法;普通薄层板,有色物质可直接检视,无色物质可用物理或化学方法检视。物理方法是检出斑点的荧光颜色及强度;化学方法一般用化学试剂显色后,立即覆盖同样大小的玻璃板,检视。

3.3 3.系统适用性试验

按各品种项下要求对检测方法进行系统适用性试验,使斑点的检测灵敏度、比移值(Rf)和分离效能符合规定。

(1)检测灵敏度 系指杂质检查时,供试品溶液中被测物质能被检出的最低量。一般采用对照溶液稀释若干倍的溶液与供试品溶液和对照溶液在规定的色谱条件下,在同一块薄层板上点样、展开、检视,前者应显示清晰的斑点。

(2)比移值(Rf) 系指从基线至展开斑点中心的距离与从基线至展开剂前沿的距离的比值。鉴别时,可用供试品溶液主斑点与对照品溶液主斑点的比移值进行比较,或用比移值来说明主斑点或杂质斑点的位置。

捕获.JPG

除另有规定外,比移值(Rf)应在0.2~0.8之间。

(3)分离效能 鉴别时,在对照品与结构相似药物的对照品制成混合对照溶液的色谱图中,应显示两个清晰分离的斑点。杂质检查的方法选择时,可将杂质对照品用供试品自身稀释对照溶液溶解制成混合对照溶液,也可将杂质对照品用待测组分的对照品溶液溶解制成混合对照溶液,还可采用供试品以适当的降解方法获得的溶液,上述溶液点样展开后的色谱图中,应显示两个清晰分离的斑点。

3.4 4.测定法

(1)鉴别 可采用与同浓度的对照品溶液,在同一块薄层板上点样、展开与检视,供试品溶液所显主斑点的颜色(或荧光)与位置(Rf)应与对照品溶液的主斑点一致,而且主斑点的大小与颜色的深浅也应大致相同。或采用供试品溶液与对照品溶液等体积混合,应显示单一、紧密的斑点;或选用与供试品化学结构相似的药物对照品与供试品溶液的主斑点比较,两者Rf应不同,或将上述两种溶液等体积混合,应显示两个清晰分离的斑点。

(2)杂质检查 可采用杂质对照品法、供试品溶液的自身稀释对照法,或两法并用。供试品溶液除主斑点外的其他斑点应与相应的杂质对照品溶液或系列浓度杂质对照品溶液的相应主斑点比较,或与供试品溶液的自身稀释对照溶液或系列浓度自身稀释对照溶液的相应主斑点比较,不得更深。

通常应规定杂质的斑点数和单一杂质量,当采用系列自身稀释对照溶液时,也可规定估计的杂质总量。

4 附录Ⅴ C 柱色谱法

4.1 1.吸附柱色谱

色谱柱为内径均匀、下端(带或不带活塞)缩口的硬质玻璃管,端口或活塞上部铺垫适量棉花或玻璃纤维,管内装入吸附剂。吸附剂的颗粒应尽可能大小均匀,以保证良好的分离效果。除另有规定外,通常采用直径为0.07~0.15mm的颗粒。色谱柱的大小,吸附剂的品种和用量,以及洗脱时的流速,均按各品种项下的规定。

4.1.1 (1)吸附剂的填装

干法 将吸附剂一次加入色谱柱,振动管壁使其均匀下沉,然后沿管壁缓缓加入洗脱剂;若色谱柱本身不带活塞,可在色谱柱下端出口处连接活塞,加入适量的洗脱剂,旋开活塞使洗脱剂缓缓滴出,然后自管顶缓缓加入吸附剂,使其均匀地润湿下沉,在管内形成松紧适度的吸附层。操作过程中应保持有充分的洗脱剂留在吸附层的上面。

湿法 将吸附剂与洗脱剂混合,搅拌除去空气泡,徐徐倾入色谱柱中,然后加入洗脱剂将附着在管壁的吸附剂洗下,使色谱柱面平整。

俟填装吸附剂所用洗脱剂从色谱柱自然流下,至液面和柱表面相平时,即加供试品溶液。

4.1.2 (2)供试品的加入

除另有规定外,将供试品溶于开始洗脱时使用的洗脱剂中,再沿管壁缓缓加入,注意勿使吸附剂翻起。或将供试品溶于适当的溶剂中,与少量吸附剂混匀,再使溶剂挥发去尽使呈松散状,加在已制备好的色谱柱上面。如供试品在常用溶剂中不溶,可将供试品与适量的吸附剂在乳钵中研磨混匀后加入。

4.1.3 (3)洗脱

除另有规定外,通常按洗脱剂洗脱能力大小递增变换洗脱剂的品种和比例,分部收集流出液,至流出液中所含成分显著减少或不再含有时,再改变洗脱剂的品种和比例。操作过程中应保持有充分的洗脱剂留在吸附层的上面。

4.2 2.分配柱色谱

方法和吸附柱色谱基本一致。装柱前,先将固定液溶于适当溶剂中,加入适宜载体,混合均匀,待溶剂完全挥干后分次移入色谱柱中并用带有平面的玻棒压紧;供试品可溶于固定液,混以少量载体,加在预制好的色谱柱上端。

洗脱剂需先加固定液混合使之饱和,以避免洗脱过程中固定液的流失。

5 附录Ⅴ D 高效液相色谱法

高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱,对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品,由流动相带入柱内,各组分在柱内被分离,并依次进入检测器,由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。

5.1 1.对仪器的一般要求和色谱条件

所用的仪器为高效液相色谱仪。仪器应定期检定并符合有关规定。

5.1.1 (1)色谱柱

反相色谱系统使用非极性填充剂,常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶,以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用,辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶(如氰基键合硅烷和氨基键合硅烷等)也有使用。正相色谱系统使用极性填充剂,常用的填充剂有硅胶等。离子交换色谱系统使用离子交换填充剂;分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂;对映异构体的分离通常使用手性填充剂。填充剂的性能(如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等)以及色谱柱的填充,直接影响供试品的保留行为和分离效果。分析分子量小于2000的化合物应选择孔径在15nm(1nm=10A)以下的填料,分析分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料。除另有规定外,普通分析柱的填充剂粒径一般在3~10μm之间,粒径更小(约2μm)的填充剂常用于填装微径柱(内径约2mm)。

使用微径柱时,输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配;如有必要,色谱条件也需作适当的调整。当对其测定结果产生争议时,应以品种项下规定的色谱条件的测定结果为准。

以硅胶为载体的键合固定相的使用温度通常不超过40℃,为改善分离效果可适当提高色谱柱的使用温度,但不宜超过60℃。

流动相的pH值控制在2~8之间。当pH值大于8时,可使载体硅胶溶解;当pH值小于2时,与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色谱系统中需使用pH值大于8的流动相时,应选用耐碱的填充剂,如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶填充剂、包覆聚合物填充剂、有机一无机杂化填充剂或非硅胶基键合填充剂等;当需使用pH值小于2的流动相时,应选用耐酸的填充剂,如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶填充剂、有机-无机杂化填充剂等。

5.1.2 (2)检测器

最常用的检测器为紫外检测器,包括二极管阵列检测器,其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。

紫外、荧光、电化学检测器为选择性检测器,其响应值不仅与供试品溶液的浓度有关,还与化合物的结构有关;蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用型检测器,对所有的化合物均有响应;蒸发光散射检测器对结构类似的化合物,其响应值几乎仅与供试品的质量有关;二极管阵列检测器可以同时记录供试品的吸收光谱,故可用于供试品的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。

紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与供试品溶液的浓度在一定范围内呈线性关系,但蒸发光散射检测器的响应值与供试品溶液的浓度通常呈指数关系,故进行计算时,一般需经对数转换

不同的检测器,对流动相的要求不同。如采用紫外检测器,所用流动相应符合紫外-可见分光光度法2010年版药典二部附录ⅣA)项下对溶剂的要求;采用低波长检测时,还应考虑有机相中有机溶剂的截止使用波长,并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发性盐组分的流动相。

5.1.3 (3)流动相

反相色谱系统的流动相首选甲醇-水系统(采用紫外末端波长检测时,首选乙腈-水系统),如经试用不适合时,再选用其他溶剂系统。应尽可能少用含有缓冲液的流动相,必须使用时,应尽可能选用含较低浓度缓冲液的流动相。由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态,故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统,流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5%,否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化,造成色谱系统不稳定

各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得改变外,其余如色谱柱内径、长度、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等,均可适当改变,以适应供试品并达到系统适用性试验的要求。其中,调整流动相组分比例时,以组分比例较低者(小于或等于50%)相对于自身的改变量不超过±30%且相对于总量的改变量不超过±10%为限,如30%相对改变量的数值超过总量的10%时,则改变量以总量的±10%为限。

对于必须使用特定牌号的填充剂方能满足分离要求的品种,可在该品种项下注明。

5.2 2.系统适用性试验

色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个参数。其中,分离度和重复性尤为重要。

按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试验,即用规定的对照品溶液或系统适用性试验溶液在规定的色谱系统进行试验,必要时,可对色谱系统进行适当调整,以符合要求。

5.2.1 (1)色谱柱的理论板数(n)

用于评价色谱柱的分离效能。由于不同物质在同一色谱柱上的色谱行为不同,采用理论板数作为衡量柱效能的指标时,应指明测定物质,一般为待测组分或内标物质的理论板数。

在规定的色谱条件下,注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液,记录色谱图,量出供试品主成分峰或内标物质峰的保留时间tR(以分钟或长度计,下同,但应取相同单位)和峰宽(W)或半高峰宽(Wh/2),按n=16(tR/W)2或n=5.54(tR/Wh/22计算色谱柱的理论板数。

5.2.2 (2)分离度(R)

用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的分离程度,是衡量色谱系统效能的关键指标。可以通过测定待测物质与已知杂质的分离度,也可以通过测定待测组分与某一添加的指标性成分(内标物质或其他难分离物质)的分离度,或将供试品或对照品用适当的方法降解,通过测定待测组分与某一降解产物的分离度,对色谱系统进行评价与控制。

无论是定性鉴别还是定量分析,均要求待测峰与其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。除另有规定外,待测组分与相邻共存物之间的分离度应大于1.5。分离度的计算公式为:

分离度的计算公式

式中tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间;tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间;W1、W2及W1,h/2、W2,h/2分别为此相邻两峰的峰宽及半高峰宽(如图)。

捕获.JPG

当对测定结果有异议时,色谱柱的理论板数(n)和分离度(R)均以峰宽(W)的计算结果为准。

5.2.3 (3)重复性

用于评价连续进样中,色谱系统响应值的重复性能。采用外标法时,通常取各品种项下的对照品溶液,连续进样5次,除另有规定外,其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%;采用内标法时,通常配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液,加入规定量的内标溶液,配成3种不同浓度的溶液,分别至少进样2次,计算平均校正因子。其相对标准偏差应不大于2.0%。

5.2.4 (4)拖尾因子(T)

用于评价色谱峰的对称性。为保证分离效果和测量精度,应检查待测峰的拖尾因子是否符合各品种项下的规定。拖尾因子计算公式为:

拖尾因子计算公式

式中W0.05h为5%峰高处的峰宽;

d1为峰顶点至峰前沿之间的距离(如图)。

捕获.JPG

除另有规定外,峰高法定量时T应在0.95~1.05之间。峰面积法测定时,若拖尾严重,将影响峰面积的准确测量。必要时,应在各品种项下对拖尾因子作出规定。

5.3 3.测定法

5.3.1 (1)内标法

按各品种项下的规定,精密称(量)取对照品和内标物质,分别配成溶液,精密量取各适量,混合配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器,记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高,按下式计算校正因子:

捕获.JPG

式中 AS为内标物质的峰面积或峰高;

AR为对照品的峰面积或峰高;

cS为内标物质的浓度;

cR为对照品的浓度。

再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液,注入仪器,记录色谱图,测量供试品中待测成分和内标物质的峰面积或峰高,按下式计算含量:

捕获.JPG

式中AX为供试品的峰面积或峰高;

cX为供试品的浓度;

A'X为内标物质的峰面积或峰高;

c'S为内标物质的浓度;

f为校正因子。

采用内标法,可避免因样品前处理及进样体积误差对测定结果的影响。

5.3.2 (2)外标法

按各品种项下的规定,精密称(量)取对照品和供试品,配制成溶液,分别精密取一定量,注入仪器,记录色谱图,测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积(或峰高),按下式计算含量:

捕获.JPG

式中各符号意义同上。

由于微量注射器不易精确控制进样量,当采用外标法测定供试品中成分或杂质含量时,以定量环或自动进样器进样为好。

5.3.3 (3)加校正因子的主成分自身对照法

测定杂质含量时,可采用加校正因子的主成分自身对照法。在建立方法时,按各品种项下的规定,精密称(量)取杂质对照品和待测成分对照品各适量,配制测定杂质校正因子的溶液,进样,记录色谱图,按上述(1)法计算杂质的校正因子。此校正因子可直接载入各品种项下,用于校正杂质的实测峰面积。这些需作校正计算的杂质,通常以主成分为参照,采用相对保留时间定位,其数值一并载入各品种项下。

测定杂质含量时,按各品种项下规定的杂质限度,将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液作为对照溶液,进样,调节检测灵敏度(以噪声水平可接受为限)或进样量(以柱子不过载为限),使对照溶液的主成分色谱峰的峰高约达满量程的10%~25%或其峰面积能准确积分[通常含量低于0.5%的杂质,峰面积的相对标准偏差(RSD)应小于10%;含量在0.5%~2%的杂质,峰面积的RSD应小于5%;含量大于2%的杂质,峰面积的RSD应小于2%]。然后,取供试品溶液和对照品溶液适量,分别进样,供试品溶液的记录时间,除另有规定外,应为主成分色谱峰保留时间的2倍,测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积,分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较,依法计算各杂质含量。

5.3.4 (4)不加校正因子的主成分自身对照法

测定杂质含量时,若没有杂质对照品,也可采用不加校正因子的主成分自身对照法。同上述(3)法配制对照溶液并调节检测灵敏度后,取供试品溶液和对照溶液适量,分别进样,前者的记录时间,除另有规定外,应为主成分色谱峰保留时间的2倍,测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积并与对照溶液主成分的峰面积比较,计算杂质含量。

若供试品所含的部分杂质未与溶剂峰完全分离,则按规定先记录供试品溶液的色谱图Ⅰ,再记录等体积纯溶剂的色谱图Ⅱ。色谱图Ⅰ上杂质峰的总面积(包括溶剂峰),减去色谱图Ⅱ上的溶剂峰面积,即为总杂质峰的校正面积。然后依法计算。

5.3.5 (5)面积归一化法

按各品种项下的规定,配制供试品溶液,取一定量注入仪器,记录色谱图。测量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积,计算各峰面积占总峰面积的百分率。

用于杂质检查时,由于峰面积归一化法测定误差大,因此,通常只用于粗略考查供试品中的杂质含量。除另有规定外,一般不宜用于微量杂质的检查。

6 附录Ⅴ E 气相色谱法

气相色谱法系采用气体为流动相(载气)流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。物质或其衍生物气化后,被载气带入色谱柱进行分离,各组分先后进入检测器,用数据处理系统记录色谱信号。

6.1 1.对仪器的一般要求

所用的仪器为气相色谱仪,由载气源、进样部分、色谱柱、柱温箱、检测器和数据处理系统等组成。进样部分、色谱柱和检测器的温度均应根据分析要求适当设定

6.1.1 (1)载气源

气相色谱法的流动相为气体,称为载气,氦、氮和氢可用作载气,可由高压钢瓶或高纯度气体发生器提供,经过适当的减压装置,以一定的流速经过进样器和色谱柱;根据供试品的性质和检测器种类选择载气,除另有规定外,常用载气为氮气。

6.1.2 (2)进样部分

进样方式一般可采用溶液直接进样、自动进样或顶空迸样。

溶液直接进样采用微量注射器、微量进样阀或有分流装置的气化室进样;采用溶液直接进样或自动进样时,进样口温度应高于柱温30~50℃;进样量一般不超过数微升;柱径越细,进样量应越少,采用毛细管柱时,一般应分流以免过载。

顶空进样适用于固体和液体供试品中挥发性组分的分离和测定。将固态或液态的供试品制成供试液后,置于密闭小瓶中,在恒温控制的加热室中加热至供试品中挥发性组分在液态和气态达到平衡后,由进样器自动吸取一定体积的顶空气注入色谱柱中。

6.1.3 (3)色谱柱

色谱柱为填充柱或毛细管柱。填充柱的材质为不锈钢或玻璃,内径为2~4mm,柱长为2~4m,内装吸附剂、高分子多孔小球或涂渍固定液的载体,粒径为0.18~0.25mm、0.15~0.18mm或0.125~0.15mm。常用载体为经酸洗并硅烷化处理的硅藻土或高分子多孔小球,常用固定液有甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。毛细管柱的材质为玻璃或石英,内壁或载体经涂渍或交联固定液,内径一般为0.25mm、0.32mm或0.53mm,柱长5~60m,固定液膜厚0.1~5.0μm,常用的固定液有甲基聚硅氧烷、不同比例组成的苯基甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。

新填充柱和毛细管柱在使用前需老化处理,以除去残留溶剂及易流失的物质,色谱柱如长期未用,使用前应老化处理,使基线稳定。

6.1.4 (4)柱温箱

由于柱温箱温度的波动会影响色谱分析结果的重现性,因此柱温箱控温精度应在±1℃,且温度波动小于每小时0.1℃。温度控制系统分为恒温和程序升温两种。

6.1.5 (5)检测器

适合气相色谱法的检测器有火焰离子化检测器(FID)、热导检测器(TCD)、氮磷检测器(NPD)、火焰光度检测器(FPD)、电子捕获检测器(ECD)、质谱检测器(MS)等。火焰离子化检测器对碳氢化合物响应良好,适合检测大多数的药物;氮磷检测器对含氮、磷元素的化合物灵敏度高;火焰光度检测器对含磷、硫元素的化合物灵敏度高;电子捕获检测器适于含卤素的化合物;质谱检测器还能给出供试品某个成分相应的结构信息,可用于结构确证。除另有规定外,一般用火焰离子化检测器,用氢气作为燃气,空气作为助燃气。在使用火焰离子化检测器时,检测器温度一般应高于柱温,并不得低于150℃,以免水汽凝结,通常为250~350℃。

6.1.6 (6)数据处理系统

可分为记录仪、积分仪以及计算机工作站等。

各品种项下规定的色谱条件,除检测器种类、固定液品种及特殊指定的色谱柱材料不得改变外,其余如色谱柱内径、长度、载体牌号、粒度、固定液涂布浓度、载气流速、柱温、进样量、检测器的灵敏度等,均可适当改变,以适应具体品种并符合系统适用性试验的要求。一般色谱图约于30分钟内记录完毕。

6.2 2.系统适用性试验

除另有规定外,应照高效液相色谱法(2010年版药典二部附录Ⅴ D)项下的规定。

6.3 3.测定法

(1)内标法(2)外标法(3)面积归一化法

上述(1)~(3)法的具体内容均同高效液相色谱法(2010年版药典二部附录Ⅴ D)项下相应的规定。

(4)标准溶液加入法 精密称(量)取某个杂质或待测成分对照品适量,配制成适当浓度的对照品溶液,取一定量,精密加入到供试品溶液中,根据外标法或内标法测定杂质或主成分含量,再扣除加入的对照品溶液含量,即得供试品溶液中某个杂质和主成分含量。

也可按下述公式进行计算,加入对照品溶液前后校正因子应相同,即:

捕获.JPG

则待测组分的浓度cX可通过如下公式进行计算:

捕获.JPG

式中cX为供试品中组分X的浓度;

AX为供试品中组分X的色谱峰面积;

△cX为所加入的已知浓度的待测组分对照品的浓度;

Ais为加入对照品后组分X的色谱峰面积。

由于气相色谱法的进样量一般仅数微升,为减小进样误差,尤其当采用手工进样时,由于留针时间和室温等对进样量也有影响,故以采用内标法定量为宜;当采用自动进样器时,由于进样重复性的提高,在保证分析误差的前提下,也可采用外标法定量。当采用顶空进样时,由于供试品和对照品处于不完全相同的基质中,故可采用标准溶液加入法以消除基质效应的影响;当标准溶液加入法与其他定量方法结果不一致时,应以标准加入法结果为准。

7 附录Ⅴ F 电泳法

电泳法是指带电荷的供试品(蛋白质核苷酸等)在惰性支持介质(如纸、醋酸纤维素琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)中,在电场的作用下,向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动,使组分分离成狭窄的区带,用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱并计算其含量(%)的方法。

各电泳法,除另有规定外,照下述方法操作。

7.1 第一法 纸电泳法

7.1.1 1.仪器装置

包括电泳室及直流电源两部分。

常用的水平式电泳室装置如图,包括两个电泳槽A和一个可以密封的玻璃(或相应材料)盖B;两侧的电泳槽均用有机玻璃(或相应材料)板C分成两部分;外格装有铂电极(直径0.5~0.8cm)D;里格为可放滤纸E的有机玻璃电泳槽架F,此架可从槽中取出;两侧电泳槽A内的铂电极D经隔离导线穿过槽壁与电泳仪外接电源相连。

水平式电泳室装置

图 水平式电泳室装置

电源为具有稳压器的直流电源,常压电泳一般在100~500V,高压电泳一般在500~10000V。

7.1.2 2.操作法

(1)电泳缓冲液 枸橼酸盐缓冲液(pH3.0):取枸橼酸(C6H8O7·H2O) 39.04g与枸橼酸钠(C6H5Na3O7·2H2O)4.12g,加水4000ml,使溶解。

(2)滤纸 取色谱滤纸置1mol/L甲酸溶液中浸泡过夜,次日取出,用水漂洗洗液的pH值不低于4,置60℃烘箱烘干,备用。可按需要裁成长27cm、宽18cm的滤纸,或根据电泳室的大小裁剪,并在距底边5~8cm处划一起始线,每隔2.5~3cm做一点样记号。

(3)点样 有湿点法和干点法。湿点法是将裁好的滤纸全部浸入枸橼酸盐缓冲液(pH3.0)中,湿润后,取出,用滤纸吸干多余的缓冲液,置电泳槽架上,使起始线靠近阴极端,将滤纸两端浸入缓冲液中,然后用微量注射器精密点加供试品溶液,每点10μl,共3点,并留2个空白位置。

干点法是将供试品溶液点于滤纸上,吹干,再点,反复数次,直至点完规定量的供试品溶液,然后用喷雾器将滤纸喷湿,点样处最后喷湿,本法适用于稀的供试品溶液。

(4)电泳 于电泳槽中加入适量电泳缓冲液,浸没铂电极,接通电泳仪稳压电源档,电压梯度调整为18~20V/cm,电泳约1小时45分钟,取出,立即吹干,置紫外光灯(254nm)下检视,用铅笔划出紫色斑点的位置。

(5)含量测定 剪下供试品斑点和与斑点位置面积相近的空白滤纸,剪成细条,分别置试管中,各精密加入0.01mol/L盐酸溶液5ml,摇匀,放置1小时,用3号垂熔玻璃漏斗滤过,也可用自然沉降或离心法倾取上清液,按各品种项下的规定测定吸光度,并计算含量。

7.2 第二法 醋酸纤维素薄膜电泳法

7.2.1 1.仪器装置

电泳室及直流电源同纸电泳。

7.2.2 2.试剂

(1)巴比妥缓冲液(pH8.6) 取巴比妥2.76g、巴比妥钠15.45g,加水溶解使成1000ml。

(2)氨基黑染色液 取0.5g的氨基黑10B,溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。

(3)漂洗液 取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml,混匀。(4)透明液 取冰醋酸25ml,加无水乙醇75ml,混匀。

7.2.3 3.操作法

(1)醋酸纤维素薄膜 取醋酸纤维素薄膜,裁成2cm×8cm的膜条,将无光泽面向下,浸入巴比妥缓冲液(pH8.6)中,待完全浸透,取出夹于滤纸中,轻轻吸去多余的缓冲液后,将膜条无光泽面向上,置电泳槽架上,经滤纸桥浸入巴比妥缓冲液(pH8.6)中。

(2)点样与电泳 于膜条上距负极端2cm处,条状滴加蛋白含量约5%的供试品溶液2~3μl,在10~12V/cm电压梯度下电泳。电泳区带距离以4~5cm为宜。

(3)染色 电泳完毕,将膜条取下浸于氨基黑染色液中,2~3分钟后,用漂洗液浸洗数次,直至脱去底色为止。

(4)透明 将洗净并完全干后的膜条浸于透明液中10~15分钟,取出平铺于洁净的玻璃板上,干后即成透明薄膜,可于分光光度计上测定和作标本长期保存

(5)含量测定 未经透明处理的醋酸纤维素薄膜电泳图可按各品种项下规定的方法测定,一般采用洗脱法或扫描法,测定各蛋白质组分的相对含量(%)。

洗脱法 将洗净的膜条用滤纸吸干,剪下供试品溶液各电泳图谱的电泳区带,分别浸于1.6%的氢氧化钠溶液中,振摇数次,至洗脱完全,于一定波长下测定吸光度。同时剪取与供试品膜条相应的无蛋白部位,同法操作作对照。先计算吸光度总和,再计算各蛋白组分所占比率(%)。

扫描法 将干燥的醋酸纤维素薄膜用色谱扫描仪通过反射(未透明薄膜)或透射(已透明薄膜)方式在记录器上自动绘出各蛋白组分曲线图,横坐标为膜条的长度,纵坐标为吸光度,计算各蛋白质组分的含量(%)。亦可用微机处理积分计算。

7.3 三法 琼脂糖凝胶电泳法

7.3.1 1.仪器装置

电泳室及直流电源同纸电泳。

7.3.2 2.试剂

(1)醋酸锂盐缓冲液(pH3.0) 取冰醋酸50ml,加水800ml混合后,用氢氧化锂调节pH值至3.0,再加水至1000ml。

(2)甲苯胺蓝溶液 取甲苯胺蓝0.1g,加水100ml使溶解。

7.3.3 3.操作法

(1)制胶 取琼脂糖约0.2g,加水10ml,置水浴中加热使溶胀完全,加温热的醋酸-锂盐缓冲液(pH3.0)10ml,混匀,趁热将胶液涂布于大小适宜(2.5cm×7.5cm或4cm×9cm)的玻璃板上,厚度约3mm,静置,待凝胶结成无气泡的均匀薄层,即得。

(2)对照品溶液及供试品溶液的制备 照各品种项下规定配制。

(3)点样与电泳 在电泳槽内加入醋酸-锂盐缓冲液(pH3.0),将凝胶板置于电泳槽架上,经滤纸桥浸入缓冲液。于凝胶板负极端分别点样1μl,立即接通电源,在电压梯度约30V/cm、电流强度1~2mA/cm的条件下,电泳约20分钟,关闭电源。

(4)染色与脱色 取下凝胶板,用甲苯胺蓝溶液染色,用水洗去多余的染色液至背景无色为止。

7.4 第四法 聚丙烯酰胺凝胶电泳

7.4.1 1.仪器装置

通常由稳流电泳仪和圆盘电泳槽或平板电泳槽组成。其电泳室有上、下两槽,每个槽中都有固定的铂电极,铂电极经隔离电线接于电泳仪稳流档上。

7.4.2 2.试剂

(1)溶液A 取三羟甲基氨基甲烷36.6g、四甲基乙二胺0.23ml,加1mol/L盐酸溶液48ml,再加水溶解并稀释至100ml,置棕色瓶内,在冰箱中保存。

(2)溶液B 取丙烯酰胺30.0g、次甲基双丙烯酰胺0.74g,加水溶解并稀释至100ml,滤过,置棕色瓶内,在冰箱中保存。

(3)电极缓冲液(pH8.3) 取三羟甲基氨基甲烷6g、甘氨酸28.8g,加水溶解并稀释至1000ml,置冰箱中保存,用前稀释10倍。

(4)溴酚蓝指示液 取溴酚蓝0.1g,加0.05mol/L氢氧化钠溶液3.0ml与90%乙醇5ml,微热使溶解,加20%乙醇制成250ml。

(5)染色液 取0.25%(g/ml)考马斯亮蓝G250溶液2.5ml,加12.5% (g/ml)三氯醋酸溶液至10ml。

(6)稀染色液 取上述染色液2ml,加12.5%(g/ml)三氯醋酸溶液至10ml。

(7)脱色液 7%醋酸溶液。

7.4.3 3.操作法

(1)制胶 取溶液A 2ml,溶液B 5.4ml,加脲2.9g使溶解,再加水4ml,混匀,抽气赶去溶液中气泡,加0.56%过硫酸铵溶液2ml,混匀制成胶液,立即用装有长针头的注射器或细滴管将胶液沿管壁加至底端有橡皮塞的小玻璃管(10cm×0.5cm)中,使胶层高度达6~7cm,然后徐徐滴加水少量,使覆盖胶面,管底气泡必须赶走,静置约30分钟,待出现明显界面时即聚合完毕,吸去水层。

(2)对照品溶液及供试品溶液的制备 照各品种项下的规定。

(3)电泳 将已制好的凝胶玻璃管装入圆盘电泳槽内,每管加供试品或对照品溶液50~100μl,为防止扩散可加甘油或40%蔗糖溶液1~2滴及0.04%溴酚蓝指示液1滴,也可直接在上槽缓冲液中加0.04%溴酚蓝指示液数滴,玻璃管的上部用电极缓冲液充满,上端接负极,下端接正极。调节起始电流使每管为1mA,数分钟后,加大电流使每管为2~3mA,当溴酚蓝指示液移至距玻璃管底部1cm处,关闭电源。

(4)染色和脱色 电泳完毕,用装有长针头并吸满水的注射器,自胶管底部沿胶管壁将水压入,胶条即从管内滑出,将胶条浸入稀染色液过夜或用染色液浸泡10~30分钟,以水漂洗干净,再用脱色液脱色至无蛋白区带凝胶的底色透明为止。

(5)结果判断 将胶条置灯下观察,根据供试品与对照品的色带位置和色泽深浅程度进行判断。

①相对迁移率 供试品和对照品的电泳区带有时可用相对迁移率(R'm)进行比较。其计算式如下:

捕获.JPG

②扫描 将清晰的胶条置双波长薄层扫描仪或凝胶电泳扫描仪中扫描并积分,由各组分的峰面积计算含量(%)。

7.5 第五法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离蛋白质的原理是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物,使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的净电荷,消除了不同蛋白质分子的电荷效应,使蛋白质按分子大小分离。

7.5.1 1.仪器装置

恒压或恒流电源、垂直板或圆盘电泳槽和制胶模具。

7.5.2 2.试剂

(1)30%丙烯酰胺溶液 取丙烯酰胺60g与亚甲基双丙烯酰胺1.6g,加水至200ml,滤纸过滤,避光保存。

(2)分离胶缓冲液 取三羟甲基氨基甲烷36.3g,加水70ml,用盐酸调节pH值至8.8,加水至100ml。

(3)浓缩胶缓冲液 取三羟甲基氨基甲烷6.0g,加水70ml,用盐酸调节pH值至6.8,加水至100ml。

(4)电极缓冲液 取三羟甲基氨基甲烷6.0g、甘氨酸28.8g、十二烷基硫酸钠1.0g,加水至1000ml。

7.5.3 3.操作法

(1)制胶 用30%丙烯酰胺溶液-分离胶缓冲液-20%十二烷基硫酸钠溶液-10%过硫酸铵溶液(新鲜配制)-四甲基乙二胺-水(5.0:1.5;0.08:0.1:0.01:5.3)制成分离胶液,灌入模具内至一定高度(剩余体积留作制备浓缩胶用),用水封顶,聚合完毕,倾去水层。再用30%丙烯酰胺溶液-浓缩胶缓冲液-20%十二烷基硫酸钠溶液-10%过硫酸铵溶液(新鲜配制)-四甲基乙二胺-水(0.8:1.3:0.025:0.05:0.005:2.4)制成浓缩胶液,灌在分离胶上,插入样品梳(如为圆盘电泳,用水封顶),待浓缩胶液聚合后,小心除去样品梳或水。

(2)对照品溶液和供试品溶液的制备 照各品种项下的规定。

(3)电泳 垂直板电泳:恒压电泳,初始电压为80V,进入分离胶时调至150~200V,当溴酚蓝迁移胶底处,停止电泳。圆盘电泳:调节电流使每管8mA。

7.5.4 4.固定与染色

7.5.4.1 (1)考马斯亮蓝染色

①试剂 固定液 称取三氯醋酸5g,加水200ml溶解后,加甲醇200ml,再加水至500ml。

染色液 称取考马斯亮蓝R250 0.5g,加水200ml溶解后,加甲醇200ml与冰醋酸50ml,再加水至500ml。

脱色液 取甲醇400ml、冰醋酸100ml,加水至1000ml,充分混合。

保存液 取冰醋酸75ml,加水至1000ml,摇匀。

②固定与染色 电泳完毕,取出胶片(条),置固定液中30分钟,取出胶片(条),置染色液中1~2小时,用脱色液脱色至凝胶背景透明后保存在保存液中。

7.5.4.2 (2)银染色

①试剂 硝酸银溶液 取硝酸银0.8g,加水至4.0ml,将此溶液滴加到0.1mol/L氢氧化钠溶液20ml与25%氨溶液1.5ml的混合液中,摇匀,用水稀释至100ml。

固定液 取甲醇50ml、37%甲醛溶液54μl,加水至100ml。

显色液 取1%枸橼酸溶液2.5ml、37%甲醛溶液270μl,加水至500ml。

终止液 取冰醋酸100ml,加水至1000ml。

②固定与染色 胶片浸在固定液中至少2小时后弃去固定液,用水浸洗至少1小时;胶片置1%戊二醛溶液中15分钟后,用水洗2次,每次15分钟;胶片置硝酸银溶液中15分钟后,用水洗3次,每次15分钟;胶片置显色液中,待各带显出后置终止液中。

7.5.5 5.结果判断

用卡尺或用扫描定位法测量溴酚蓝指示剂和蛋白迁移距离(如为圆盘电泳还应测量染色前后胶条长度,垂直板电泳胶片厚度低于1mm,染色前后胶片长度基本不变)。按下式计算相对迁移率:

捕获.JPG

(1)供试品主成分迁移率应与对照品迁移率一致。

(2)分子量 以R'm为横坐标,标准蛋白质的分子量对数值为纵坐标,进行线性回归,由标准曲线求得供试品的分子量。

(3)纯度 取胶片(条),置薄层扫描仪,以峰面积按归一化法计算。

7.6 第六法 等电聚焦水平板电泳法

两性电解质在电泳场中形成一个pH梯度,由于蛋白质为两性化合物,其所带的电荷与介质的pH值有关,带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移,当到达其等电点(此处的pH值使相应的蛋白质不再带电荷)时,电流达到最小,不再移动。本法用于检测蛋白类和肽类供试品的等电点。

除另有规定外,按以下方法测定。

7.6.1 1.仪器装置

恒压或恒流电源、带有冷却装置的水平电泳槽和制胶模具。

7.6.2 2.试剂

(1)水(电导率应不大于0.056μS/cm)。

(2)A液 称取丙烯酰胺5.0g,亚甲基双丙烯酰胺0.15g,加适量水溶解,并稀释至50ml,双层滤纸滤过,避光保存。

(3)B液 10%过硫酸铵溶液,临用新配。

(4)甲基红试液 称取甲基红5mg,加0.05mol/L氢氧化钠10ml溶解,混匀。

(5)50%甘油。

(6)正极液 0.5mol/L磷酸溶液。

(7)负极液 1mol/L氢氧化钠溶液。

7.6.3 3.操作法

[1]

(1)制胶 取A液2.5ml,pH 3~10的两性电解质(或其他pH范围的两性电解质)0.35ml,水1.25ml,50%甘油0.5ml,混匀,抽气5~10分钟,加B液25μl,N,N,N',N'-四甲基乙二胺6μl,混匀后缓慢地注入水平模具内,室温下聚合。

(2)对照品溶液和供试品溶液的制备 按各品种项下的方法制备。如供试品所含盐浓度较高,则将供试品对水透析(或用其他方法)脱盐,并将蛋白或多肽含量调节至0.5~5mg/ml(如供试品蛋白或多肽浓度太低,则需采用适当方法浓缩)。对照品溶液同法制备。

(3)预电泳 将已聚合的聚丙烯酰胺凝胶放到冷却板上,其间涂以液体石蜡煤油并避免气泡的产生。用正极液与负极液分别润湿正极与负极电极条,然后分别放于阳极与阴极上,将电极对准电极条中心,加盖,在恒压法下进行测定,在起始电压200V下预电泳30分钟。

(4)电泳 将加样滤纸条以一定间隔置于凝胶上,加入供试品、对照品及等电点标准溶液5~20μl。选择恒压方式进行电泳,起始电压为200V。电泳0.5~1小时待甲基红迁出加样条后,去除加样条。调高电压至400V,电泳至电流不再变化,再调高电压至600V,待电流不再变化时停止电泳。预制胶的预电泳及电泳,按照各等电聚焦电泳仪标准操作规程进行。

7.6.4 4.固定和染色

(1)试剂

①固定液 20%三氯醋酸。

②染色液 染色贮备液 称取考马斯亮蓝G250 1.0g,加水20ml溶解,作为溶液1;称取硫酸铵125g,加水400ml溶解,作为溶液2;称取磷酸20g,作为溶液3;将溶液3加入到溶液1中,待考马斯亮蓝G250完全溶解后,与溶液2混合,并加水至1L,混匀,即得,用前应充分摇匀。

工作染色液 取60ml染色贮备液,与30ml甲醇混匀,临用新配。

③脱色液 蒸馏水

(2)固定与染色 电泳完毕后,取出胶片,置于固定液中固定20分钟以上,取出胶片,置染色液中3小时,用脱色液脱色至背景透明后取出晾干,亦可做成干胶永久保存。

7.6.5 5.结果判断

将胶片置凝胶电泳扫描仪中扫描,通过适宜的方法测量蛋白质或多肽与等电点标准的迁移距离。[1]

(1)鉴别 供试品主成分迁移位置应与对照品迁移位置一致。

(2)等电点 以等电点标准试剂中各种蛋白的等电点(pI)对其相应的迁移距离线性回归作图;将供试品的迁移距离代入线性回归方程,求出供试品的等电点。

8 附录Ⅴ G 毛细管电泳

毛细管电泳法是指以弹性石英毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力,依据供试品中各组分的淌度(单位电场强度下的迁移速度)和(或)分配行为的差异而实现各组分分离的一种分析方法。

熔融石英毛细管内充满操作缓冲液时,管内壁上硅羟基解离释放氢离子至溶液中使管壁带负电荷并与溶液形成双电层(ζ电位),即使在较低pH值的缓冲液中情况也如此。当毛细管两端加上直流电压时将使带正电的溶液整体地移向负极端。此种在电场作用下溶液的整体移动称为电渗流(EOF)。内壁硅羟基的解离度与操作缓冲液pH值和添加的改性剂有关。降低溶液pH值会降低解离度,减小电渗流;增高溶液pH值提高解离度,增加电渗流。有机添加剂的加入有时会抑制内壁硅羟基的解离,减小电渗流。在操作缓冲液中带电粒子在电场作用下以不同速度向极性相反的方向移动,形成电泳。在操作缓冲液中带电粒子运动速度等于其电泳速度和电渗速度的矢量和。电渗速度通常大于电泳速度,因此电泳时各组分即使是阴离子也会从毛细管阳极端流向阴极端。为了减小或消除电渗流,除了降低操作缓冲液pH值之外,还可以采用内壁聚合物涂层的毛细管。这种涂层毛细管可减少大分子在管壁上的吸附。

8.1 1.分离模式

毛细管电泳的分离模式有以下几种。

(1)毛细管区带电泳(CZE) 将待分析溶液引入毛细管进样一端,施加直流电压后,各组分按各自的电泳流和电渗流的矢量和流向毛细管出口端,按阳离子、中性粒子和阴离子及其电荷大小的顺序通过检测器。中性组分彼此不能分离。出峰时间称为迁移时间(tm),相当于高效液相色谱和气相色谱中的保留时间。

(2)毛细管凝胶电泳(CGE) 在毛细管中装入单体和引发剂引发聚合反应生成凝胶,这种方法主要用于分析蛋白质、DNA生物大分子。另外还可以利用聚合物溶液,如葡聚糖等的筛分作用进行分析,称为毛细管无胶筛分。有时将它们统称为毛细管筛分电泳,下分为凝胶电泳和无胶筛分两类。

(3)毛细管等速电泳(CITP) 采用前导电解质和尾随电解质,在毛细管中充入前导电解质后,进样,电极槽中换用尾随电解质进行电泳分析,带不同电荷的组分迁移至各个狭窄的区带,然后依次通过检测器。

(4)毛细管等电聚焦电泳(CIEF) 将毛细管内壁涂覆聚合物减小电渗流,再将供试品和两性电解质混合进样,两个电极槽中分别加入酸液和碱液,施加电压后毛细管中的操作电解质溶液逐渐形成pH梯度,各溶质在毛细管中迁移至各自的等电点(pI)时变为中性形成聚焦的区带,而后用压力或改变检测器末端电极槽储液的pH值的方法使溶质通过检测器。

(5)胶束电动毛细管色谱(MEKC或MECC) 当操作缓冲液中加入大于其临界胶束浓度的离子型表面活性剂时,表面活性剂就聚集形成胶束,其亲水端朝外、疏水非极性核朝内,溶质则在水和胶束两相间分配,各溶质因分配系数存在差别而被分离。对于常用的阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠,进样后极强亲水性组分不能进入胶束,随操作缓冲液流过检测器(容量因子k'=O);极强疏水性组分则进入胶束的核中不再回到水相,最后到达检测器(k'=∞)。常用的其他胶束试剂还有阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵胆酸等。

(6)毛细管电色谱(CEC) 将细粒径固定相填充到毛细管中或在毛细管内壁涂覆固定相以电渗流驱动操作缓冲液(有时再加辅助压力)进行分离。

以上分离模式(1)和(5)使用较多。(5)和(6)两种模式的分离机理以色谱为主,但对荷电溶质则兼有电泳作用。

操作缓冲液中加入各种添加剂可获得多种分离效果。如加入环糊精、衍生化环糊精、冠醚、血清蛋白、多糖、胆酸盐或某些抗生素等,可拆分手性化合物;加入有机溶剂可改善某些组分的分离效果,以至可在非水溶液中进行分析。

8.2 2.对仪器的一般要求

毛细管电泳仪的主要部件及其性能要求如下。

(1)毛细管 用弹性石英毛细管,内径50μm和75μm两种使用较多(毛细管电色谱有时用内径更大些的毛细管)。细内径分离效果好,且焦耳热小,允许施加较高电压;但若采用柱上检测,则因光程较短,其检测限比较粗内径管要差。毛细管长度称为总长度,根据分离度的要求,可选用20~100cm长度;进样端至检测器间的长度称为有效长度。毛细管常盘放在管架上控制在一定温度下操作,以控制焦耳热,操作缓冲液的黏度和电导率,对测定的重复性很重要。

(2)直流高压电源 采用0~30kV(或相近)可调节直流电源,可供应约300μA电流,具有稳压和稳流两种方式可供选择。

(3)电极和电极槽 两个电极槽里放入操作缓冲液,分别插入毛细管的进口端与出口端以及铂电极;铂电极连接至直流高压电源,正负极可切换。多种型号的仪器将试样瓶同时用作电极槽。

(4)冲洗进样系统 每次进样之前毛细管要用不同溶液冲洗,选用自动冲洗进样仪器较为方便。进样方法有压力(加压)进样、负压(减压)进样、虹吸进样和电动(电迁移)进样等。进样时通过控制压力或电压及时间来控制进样量。

(5)检测系统 紫外-可见分光检测器、激光诱导荧光检测器、电化学检测器和质谱检测器均可用作毛细管电泳的检测器。其中以紫外-可见分光光度检测器应用最广,包括单波长、程序波长和二极管阵列检测器。将毛细管接近出口端的外层聚合物剥去约2mm一段,使石英管壁裸露,毛细管两侧各放置一个石英聚光球,使光源聚焦在毛细管上,透过毛细管到达光电池。对无光吸收(或荧光)的溶质的检测,还可采用间接测定法,即在操作缓冲液中加入对光有吸收(或荧光)的添加剂,在溶质到达检测窗口时出现反方向的峰。

(6)数据处理系统 与一般色谱数据处理系统基本相同。

8.3 3.系统适用性试验

为考查所配置的毛细管分析系统和设定的参数是否适用,系统适用性的测试项目和方法与高效液相色谱法或气相色谱法相同,相关的计算式和要求也相同;如重复性(相对标准偏差,RSD)、容量因子(k')、毛细管理论板数(n)、分离度(R)、拖尾因子(T)、线性范围、最低检测限(LOD)和最低定量限(LOQ)等,可参照测定。具体指标应符合各品种项下的规定,特别是进样精度和不同荷电溶质迁移速度的差异对分析精密度的影响。

8.4 4.基本操作

(1)按照仪器操作手册开机,预热,输入各项参数,如毛细管温度、操作电压、检测波长和冲洗程序等。操作缓冲液需过滤和脱气。冲洗液、缓冲液等放置于样品瓶中,依次放入进样器。

(2)毛细管处理的好坏,对测定结果影响很大。未涂层新毛细管要用较浓碱液在较高温度(例如用1mol/L氢氧化钠溶液在60℃)冲洗,使毛细管内壁生成硅羟基,再依次用0.1mol/L氢氧化钠溶液、水和操作缓冲液各冲洗数分钟。两次进样中间可仅用缓冲液冲洗,但若发现分离性能改变,则开始须用0.1mol/L氢氧化钠溶液冲洗,甚至要用浓氢氧化钠溶液升温冲洗。凝胶毛细管、涂层毛细管、填充毛细管的冲洗则应按照所附说明书操作。冲洗时将盛溶液的试样瓶依次置于进样器,设定顺序和时间进行。

(3)操作缓冲液的种类、pH值和浓度,以及添加剂[用以增加溶质的溶解度和(或)控制溶质的解离度、手性拆分等]的选定对测定结果的影响也很大,应照各品种项下的规定配制,根据初试的结果调整、优化。

(4)将供试品溶液瓶置于进样器中,设定操作参数,如进样压力(电动进样电压)、进样时间、正极端或负极端进样、操作电压或电流、检测器参数等,开始测试。根据初试的电泳谱图调整仪器参数和操作缓冲液以获得优化结果。而后用优化条件正式测试。

(5)测试完毕后用水冲洗毛细管,注意将毛细管两端浸入水中保存,如果长久不用应将毛细管用氮吹干,最后关机。(6)由于进样方法的限制,目前毛细管电泳的精密度比用定量阀进样的高效液相色谱法要差,故定量测定以采用内标法为宜。用加压或减压法进样时,供试品溶液黏度会影响进样体积,应注意保持试样溶液和对照品溶液黏度一致;用电动法进样时,被测组分因电歧视现象和溶液离子强度会影响待测组分的迁移量,也要注意其影响。

9 附录Ⅴ H 分子排阻色谱法

分子排阻色谱法是根据待测组分的分子大小进行分离的一种液相色谱技术。分子排阻色谱法的分离原理为凝胶色谱柱的分子筛机制。色谱柱多以亲水硅胶、凝胶或经修饰凝胶如葡聚糖凝胶(Sephadex)和聚丙烯酰胺凝胶(Sepharose)等为填充剂,这些填充剂表面分布着不同尺寸的孔径,药物分子进入色谱柱后,它们中的不同组分按其分子大小进入相应的孔径内,大于所有孔径的分子不能进入填充剂颗粒内部,在色谱过程中不被保留,最早被流动相洗脱至柱外,表现为保留时间较短;小于所有孔径的分子能自由进入填充剂表面的所有孔径,在色谱柱中滞留时间较长,表现为保留时间较长;其余分子则按分子大小依次被洗脱。

9.1 1.对仪器的一般要求

分子排阻色谱法所需的进样器和检测器同高效液相色谱法,液相色谱泵一般分常压、中压和高压。在药物分析中,尤其是分子量或分子量分布测定中,通常采用高效分子排阻色谱法(HPSEC)。应选用与供试品分子大小相适应的色谱柱填充剂。使用的流动相通常为水溶液或缓冲液,溶液的pH值不宜超出填充剂的耐受力,一般pH值在2~8范围。流动相中可加入适量的有机溶剂,但不宜过浓,一般不应超过30%,流速不宜过快,一般为0.5~1.0ml/min。

9.2 2.系统适用性试验

高效分子排阻色谱法的系统适用性试验中色谱柱的理论板数(n)、分离度、重复性、拖尾因子的测定方法,在一般情况下,同高效液相色谱法项下方法,但在高分子杂质检查时,某些药物分子的单体与其二聚体不能达到基线分离时,其分离度的计算公式为:

捕获.JPG

除另有规定外,分离度应大于2.0。

9.3 3.测定法

(1)分子量测定法 一般适用于蛋白质和多肽的分子量测定。按各品种项下规定的方法,选用与供试品分子大小相适宜的色谱柱和适宜分子量范围的对照品,除另有规定外,对照品与供试品均需使用二硫苏糖醇(DTT)和十二烷基硫酸钠(SDS)处理,以打开分子内和分子间的二硫键,并使分子的构型与构象趋于一致,经处理的蛋白质和多肽分子通常以线性形式分离,以对照品分子量(Mw)的对数值对相应的保留时间(tR)制得标准曲线的线性回归方程lgMw=a+btR,供试品以保留时间由标准曲线回归方程计算其分子量或亚基的分子量。

(2)生物大分子聚合物分子量与分子量分布的测定法 生物大分子聚合物如多糖、多聚核苷酸和胶原蛋白等具有分子大小不均一的特点,故生物大分子聚合物分子量与分子量分布是控制该类产品的关键指标。在测定生物大分子聚合物分子量与分子量分布时,选用与供试品分子结构与性质相同或相似的对照品十分重要。

按各品种项下规定的方法,除另有规定外,同样采用分子量对照品和适宜的GPC软件,以对照品重均分子量(Mw)的对数值对相应的保留时间(tR)制得标准曲线的线性回归方程lgMw=a+btR,供试品采用适宜的GPC软件处理结果,并按下列公式计算出供试品的分子量与分子量分布。

Mn=∑RIi/∑(RIi/Mi

Mw=∑(RIiMi)/∑RIi

D=Mw/Mn

式中Mn为数均分子量;

Mw为重均分子量;

D为分布系数;

RIi为供试品在保留时间i时的峰高;Mi为供试品在保留时间i时的分子量。

(3)高分子杂质测定法 高分子杂质系指供试品中含有分子量大于药物分子的杂质,通常是药物在生产或贮存过程中产生的高分子聚合物或在生产过程中未除尽的可能产生过敏反应的高分子物质。

按各品种项下规定的色谱条件进行分离。

定量方法

①主成分自身对照法 同高效液相色谱法项下规定。一般用于高分子杂质含量较低的品种。

②面积归一化法 同高效液相色谱法项下规定。

③限量法 除另有规定外,规定不得检出保留时间小于对照品保留时间的组分,一般用于混合物中高分子物质的控制。

④自身对照外标法 一般用于Sephadex G-l0凝胶色谱系统中β-内酰胺抗生素中高分子杂质的检查。在该分离系统中,除部分寡聚物外,β-内酰胺抗生素中高分子杂质在色谱过程中均不保留,即所有的高分子杂质表现为单一的色谱峰,以供试品自身为对照品,按外标法计算供试品中高分子杂质的相对百分含量。

9.4 【附注】Sephadex G-l0的处理方法

色谱柱的填装 装柱前先将约15g葡聚糖凝胶SephadexG-10用水浸泡48小时,使之充分溶胀,搅拌除去空气泡,徐徐倾入玻璃柱,一次性装填完毕,以免分层,然后用水将附着玻璃管壁的Sephadex G-10洗下,使色谱柱面平整,新填装的色谱柱要先用水连续冲洗4~6小时,以排出柱中的气泡。供试品的加入 进样可以采用自动进样阀,也可以直接将供试品加在床的表面(此时,先将床表面的流动相吸干或渗干,立即将供试品溶液沿着色谱管壁转圈缓缓加入,注意勿使填充剂翻起,待之随着重力的作用渗入固定相后,再沿着色谱管壁转圈缓缓加入3~5ml流动相,以洗下残留在色谱管壁的供试品溶液)。

10 附录Ⅴ J 离子色谱法

离子色谱法系采用高压输液泵系统将规定的洗脱液泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱分析方法。注入的供试品由洗脱液带入色谱柱内进行分离后,经过抑制器或衍生系统进入检测器,由积分仪或数据处理系统记录色谱信号。离子色谱法常用于无机阴离子、无机阳离子、有机酸、糖醇类、氨基糖类、氨基酸、蛋白质、糖蛋白等物质的定性和定量分析。它的分离机理主要为离子交换,即基于离子交换树脂上可解离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子之间进行的可逆交换;离子色谱法的其他分离机理还有形成离子对、离子排阻等。

10.1 1.对仪器的一般要求

离子色谱仪器中所有与洗脱液或供试品接触的管道、器件均应使用惰性材料,如聚醚醚酮(PEEK)等。仪器应定期检定并符合有关规定。

(1)色谱柱 离子交换色谱的色谱柱填充剂有两种,分别是有机聚合物载体填充剂和无机载体填充剂。

有机聚合物载体填充剂最为常用,填充剂的载体一般为苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、乙基乙烯基苯-二乙烯基苯共聚物、聚甲基丙烯酸酯或聚乙烯聚合物等有机聚合物。这类载体的表面通过离子键附聚了大量具有阴离子交换功能基(如烷基季铵基、烷醇季铵基等)或阳离子交换功能基(如磺酸、羧酸、羧酸-膦酸和羧酸-膦酸冠醚等)的乳胶微粒,可分别用于阴离子或阳离子的交换分离。有机聚合物载体填充剂在较宽的酸碱范围(pH0~14)内具有较高的稳定性,且有一定的耐有机溶剂腐蚀性。

无机载体填充剂一般以硅胶为载体。在硅胶表面的硅醇基通过化学键合季铵基等阴离子交换功能基或磺酸基、羧酸基等阳离子交换功能基,可分别用于阴离子或阳离子的交换分离。硅胶载体填充剂机械稳定性好、在有机溶剂中不会溶胀或收缩。硅胶载体填充剂在pH2~8的洗脱液中稳定,一般适用于阳离子样品的分离。

(2)洗脱液 离子色谱对复杂样品的分离主要依赖于色谱柱的填充剂,而洗脱液相对较为简单。分离阴离子常采用稀碱溶液、碳酸盐缓冲液等作为洗脱液;分离阳离子常采用稀甲烷磺酸溶液等作为洗脱液。通过增加或减少洗脱液中酸碱溶液的浓度可提高或降低洗脱液的洗脱能力;在洗脱液内加入适当比例的有机改性剂,如甲醇、乙腈等可改善色谱峰峰形。制备洗脱液的去离子水应经过纯化处理,电导率一般小于0.056μS/cm。使用的洗脱液需经脱气处理,常采用氦气在线脱气的方法,也可采用超声、减压过滤或冷冻的方式进行离线脱气。

(3)检测器 电导检测器是离子色谱常用的检测器,其他检测器有紫外检测器、安培检测器、蒸发光散射检测器等。电导检测器主要用于测定无机阴离子、无机阳离子和部分极性有机物,如羧酸等。离子色谱法中常采用抑制型电导检测器,即使用抑制器将具有较高电导率的洗脱液在进入检测器之前中和成具有极低电导率的水或其他较低电导率的溶液,从而显著提高电导检测的灵敏度。

安培检测器用于分析解离度低,但具有氧化或还原性质的化合物。直流安培检测器可以测定碘离子(I-)、硫氰酸根离子(SCN-)和各种酚类化合物等。积分安培检测器和脉冲安培检测器则常用于测定糖类和氨基酸类化合物。

紫外检测器适用于在高浓度氯离子等存在下痕量的溴离子(Br-)、亚硝酸根离子(NO2-)、硝酸根离子(NO3-)以及其他具有强紫外吸收成分的测定。柱后衍生-紫外检测法常用于分离分析过渡金属离子和镧系金属等。

蒸发光散射、原子吸收、原子发射光谱、电感耦合等离子体原子发射光谱、质谱(包括电感耦合等离子体质谱)也可作为离子色谱的检测器。离子色谱在与蒸发光散射检测器或(和)质谱检测器等联用时,一般采用带有抑制器的离子色谱系统。

10.2 2.样品处理

离子色谱法的色谱柱填充剂大多数不兼容有机溶剂,一旦污染后不能用有机溶剂清洗,所以离子色谱法对样品处理的要求较高。对于基质简单的澄清水溶液一般通过稀释和0.45μm滤膜过滤后直接进样分析。对于基质复杂的样品,可通过微波消解、紫外光降解、固相萃取等方法去除干扰物后进样分析。

10.3 3.系统适用性试验

照高效液相色谱法(2010年版药典二部附录Ⅴ D)项下相应的规定。

10.4 4.测定法

(1)内标法

(2)外标法

(3)面积归一化法

上述(1)~(3)法的具体内容均同高效液相色谱法(2010年版药典二部附录ⅤD)项下相应的规定。

(4)标准曲线法 按各品种项下的规定,精密称(量)取对照品适量配制成贮备溶液。分别量取贮备溶液配制成一系列梯度浓度的对照溶液。量取上述梯度浓度的对照品溶液各适量注入仪器,记录色谱图,测量对照品溶液中待测组分的峰面积或峰高。以标准溶液的峰面积或峰高为纵坐标,以标准溶液的浓度为横坐标,回归计算标准曲线,其公式为:

AR=a·CR+b

式中AR为对照溶液的峰面积或峰高;

CR为对照溶液的浓度;

a为标准曲线的斜率;

b为标准曲线的截距。

再取各品种项下供试品溶液,注入色谱仪,记录色谱图,测量供试品溶液中待测成分(或其杂质)的峰面积或峰高。按下式计算其浓度:

捕获.JPG

式中AS为供试品溶液的峰面积或峰高;

cS为供试品溶液的浓度;

a、b符号的意义同上。

上述测定法中,以外标法和标准曲线法最为常用。

11 参考资料

  1. ^ [1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版:第一增补本[M].北京:中国医药科技出版社,2010.

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  • liu ruby
    2016/6/9 0:04:19 | #1
    紫杉醇的鉴别应该如何做?有人知道吗?指点下,谢谢。
抱歉,功能升级中,暂停讨论
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本页最后修订于 2015年1月20日 星期二 13:55:09 (GMT+08:00)
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