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2010年版药典二部附录Ⅻ

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目录

1 拼音

2010nián bǎn yào diǎn èr bù fù lù Ⅻ

中华人民共和国药典》(2010年版)二部附录Ⅻ

2 附录Ⅻ A 升压素生物测定法

本法系比较垂体后叶标准品(S)与供试品(T)两者引起大鼠血压升高的程度,以测定供试品的效价

2.1 标准品溶液的制备

迅速、精密称取垂体后叶标准品适量,避免吸潮,先加少量0.25%醋酸溶液,仔细研磨,移置硬质大试管中,再精密加入0.25%醋酸溶液使成每1ml中含升压素1单位的溶液,管口轻放一玻璃塞,浸入沸水浴中,时时振摇,加热(煮沸)5分钟取出,迅速冷却,滤过,滤液分装于适宜的容器中,4~8℃贮藏经验保持活性符合要求的条件下,可在3个月内使用。

2.2 标准品稀释液的制备

试验当日,精密量取标准品溶液适量,加氯化钠注射液制成两种浓度的稀释液,高低剂量的比值(r)一般不得大于1:0.6,调节剂量使低剂量能引起血压升高,高剂量应不致使血压升高达到极限。

2.3 供试品溶液与稀释液的制备

按供试品的标示量或估计效价(AT),照标准品溶液与稀释液的制备法制成两种浓度的稀释液,其比值(r)应与标准品相等,标准品与供试品高低剂量所致的反应均值应相近。

2.4 测定法

取健康合格,体重300g以上的成年雄性大鼠,用适宜的麻醉剂(如腹腔注射乌拉坦1g/kg)麻醉后,固定于保温手术台上,分离气管,必要时插入气管插管,以使呼吸畅通。在一侧颈静脉或股静脉插入静脉插管,供注射药液用,按每100g体重注入肝素溶液50~100单位。然后剥离另一侧颈动脉,插入与血压计相连的动脉插管,在血压计与插管通路中充满氯化钠注射液,并于动脉插管中注入适量肝素(约200~400单位)抗凝,全部手术完毕后,将血压计调节到与动物血压相当的高度,开启动脉夹,记录血压。缓缓注入适宜的交感神经阻断药(如酚妥拉明,按大鼠每100g体重注入0.1mg,隔5~10分钟用相同剂量再注射一次),待血压稳定后,即可进行药液注射,各次药液的注射速度应基本相同,并于每次注射后立即注入氯化钠注射液0.3~0.5ml。每次注射应在前一次注射的反应基本稳定以后进行,相邻两次注射的间隔时间应相同(约10~15分钟)。标准品稀释液和供试品稀释液备取高低两个剂量(dS1、dS2、dT1、dT2)为一组,按随机区组设计的次序轮流注入,每组4个剂量,重复4~6组。测量各剂量所致血压升高的高度,照生物检定统计法(2010年版药典二部附录XIV)中的量反应平行线测定法计算效价及实验误差

本法的可信限率(FL%)不得大于20%。

3 附录Ⅻ B 细胞色素C活力测定法

3.1 试剂

(1)磷酸缓冲液(0.2mol/L)  取磷酸氢二钠71.64g,加水使溶解成1000ml,作为甲液。另取磷酸二氢钠27.60g,加水使溶解成1000ml,作为乙液。取甲液81ml与乙液19ml,混匀,调节pH值至7.3。

(2)磷酸盐缓冲液(0.1mol/L)  取磷酸盐缓冲液(0.2mol/L) 500ml,加水稀释至1000ml,调节pH值至7.3。

(3)磷酸盐缓冲液(0.02mol/L)  取磷酸盐缓冲液(0.2mol/L)100ml,加水稀释至1000ml,调节pH值至7.3。

(4)琥珀酸盐溶液  取琥珀酸与氢氧化钾各4.72g,加水使溶解成100ml,调节pH值至7.3。

(5)氰化钾溶液  取氰化钾0.65g,加水使溶解成100ml后,用稀硫酸调节pH值至7.3。

(6)去细胞色素C的心悬浮液  取新鲜猪(牛)心2只,除去脂肪结缔组织,切成条,用绞肉机绞碎,置纱布兜中,用自来水冲洗约2小时(经常搅动,挤出血色素),挤干,用水洗数次,挤干,置磷酸盐缓冲液(0.1mol/L)中浸泡约1小时,挤干,重复浸泡1次,用水洗数次,挤干,置组织捣碎机内,加磷酸盐缓冲液(0.02mol/L)适量恰使猪(牛)心浸没,捣成匀浆,离心10分钟(普通离心机),取上层混悬液,加冰块少量,迅速用稀醋酸调节pH值至约5.5,立即离心15分钟,取沉淀,加等体积的磷酸盐缓冲液(0.1mol/L),用玻璃匀浆器磨匀后,贮存于冰箱中;临用时取1.0ml,加磷酸盐缓冲液(0.1mol/L)稀释至10ml。

3.2 供试品溶液的制备

取供试品,加水制成每1ml中含细胞色素C约3mg的溶液。

3.3 测定法

取磷酸盐缓冲液(0.2mol/L)5ml、琥珀酸盐溶液1.0ml与供试品溶液0.5ml(如系还原型制剂,应加入0.01mol/L铁氰化钾溶液0.05ml),置25ml具塞比色管中,加去细胞色素C的心悬浮液0.5ml与氰化钾溶液1.0ml,加水稀释至10ml,摇匀,以同样的试剂作空白,照紫外-可见分光光度法2010年版药典二部附录Ⅳ A),在550nm的波长处附近,间隔0.5nm找出最大吸收波长,并测定吸光度,直至吸光度不再增大为止,作为酶还原吸光度;然后各加连二亚硫酸钠约5mg,摇匀,放置约10分钟,在上述同一波长处测定吸光度,直至吸光度不再增大为止,作为化学还原吸光度;按下式计算:

4 附录Ⅻ C 玻璃酸酶测定法

4.1 试剂

(1)醋酸-醋酸钾缓冲液  取醋酸钾14g,冰醋酸20.5ml,再加水稀释至1000ml。

(2)磷酸盐缓冲液  取磷酸二氢钠2.5g、无水磷酸氢二钠1.0g与氯化钠8.2g,加水溶解至1000ml。

(3)水解明胶  取明胶50g,加水1000ml,在121℃加热90分钟,然后冷冻干燥

(4)水解明胶稀释液  取磷酸盐缓冲液与水各250ml,加水解明胶330mg,摇匀,在0~4℃保存。如溶液不发生浑浊,可继续使用。

(5)血清贮备液  取新鲜牛血清或冻干牛血清(先用水溶解并稀释至标示量体积)1份,加醋酸-醋酸钾缓冲液9份稀释,再以4mol/L盐酸溶液调节pH值至3.1,放置18~24小时后再用。在0~4℃保存,可应用30日。

(6)血清溶液  血清贮备液中血清总固体(取牛血清适量,置装有洁净砂粒并在105℃干燥至恒重的坩埚中,置水浴上蒸干后,再在105℃干燥至恒重)在8%左右者,取1份,用醋酸-醋酸钾缓冲液3份稀释;血清总固体在5%左右者,取1份,用醋酸-醋酸钾缓冲液2份稀释。临用时制备。

(7)玻璃酸钾贮备液  取预先经五氧化二磷减压干燥48小时的玻璃酸钾,加水制成每1ml中含0.5mg的溶液。在0℃以下保存,可应用30日。

(8)玻璃酸钾溶液  取玻璃酸钾贮备液1份,用磷酸盐缓冲液1份稀释。临用时制备。

4.2 标准品溶液的制备

精密称取玻璃酸酶标准品适量,加冷的水解明胶稀释液制成每1ml中含1.5单位的溶液。临用时制备。

4.3 供试品溶液的制备

按供试品的标示量或估计效价精密称取供试品适量,加冷的水解明胶稀释液制成每1ml中含约1.5单位的溶液。临用时制备。

4.4 标准曲线的制备

大小相同的试管12支,按顺序加入标准品溶液0.00ml、0.10ml、0.20ml、0.30ml、0.40ml与0.50ml,各2支;再依次相应加入水解明胶稀释液0.50ml、0.40ml、0.30ml、0.20ml、0.10ml与0.00ml,每隔30秒钟顺序加入玻璃酸钾溶液0.50ml,使每一管的总体积为1.00ml,摇匀,置37℃±0.5℃水浴中;每管准确保温30分钟后,每间隔30秒钟顺序取出,立即顺序加入血清溶液4.0ml,摇匀,在室温放置30分钟,摇匀,在640nm的波长处测定吸光度;同时以磷酸盐缓冲液0.50ml代替玻璃酸钾溶液,加水解明胶稀释液0.50ml,摇匀,按上述方法自“置37℃±0.5℃的水浴中”起同法操作,作为空白。以吸光度为纵坐标,标准品溶液的效价(单位)为横坐标绘制标准曲线。

4.5 测定法

取大小相同的试管6支,依次加供试品溶液0.20ml、0.30ml与0.40ml,各2支;再依次相应加入水解明胶稀释液0.30ml、0.20ml与0.10ml,照标准曲线的制备项下,自“每隔30秒钟顺序加入玻璃酸钾溶液0.50ml”起,依法测定,自标准曲线上查得效价(单位)后,分别除以供试品的重量(mg),算出6份供试品的平均数,即为玻璃酸酶的效价(单位)。

5 附录Ⅻ D 肝素生物测定法

本法系比较肝素标准品(S)与供试品(T)延长新鲜兔血或兔、猪血浆凝结时间的作用,以测定供试品的效价。

5.1 标准品溶液的制备

精密称取肝素标准品适量,按标示效价加灭菌注射用水溶解使成每1ml中含100单位的溶液,分装于适宜的容器内,4~8℃贮存,经验证保持活性符合要求的条件下,可在3个月内使用。

5.2 标准品稀释液的制备

试验当日,精密量取标准品溶液,按高、中、低剂量组(dS3、dS2、dS1用氯化钠注射液配成3种浓度的稀释液,相邻两浓度的比值(r)应相等;调节剂量使低剂量组各管的平均凝结时间较不加肝素对照管组明显延长,一般以大于1.5倍空白血浆的凝固时间为宜[1]。高剂量组各管的平均凝结时间,用新鲜兔血者,以不超过60分钟为宜,其稀释液一般可制成每1ml中含肝素2~5单位,r为1:0.7左右;用血浆复钙法[1]者,以不超过30分钟为宜,其稀释液一般可制成每1ml中含肝素0.5~1.5单位,r为1:0.85左右。用活化部分凝血活酶时间测定法(APTT法)者,一般以不超过90秒为宜,其稀释液浓度一般可制成每1ml含肝素0.4~1.7单位,r为1:0.85左右,可根据实验情况调整。[1]

5.3 供试品溶液与稀释液的制备

按供试品的标示量或估计效价(AT),照标准品溶液与稀释液的制备法制成高、中、低(dT3、dT2、dT1)3种浓度的稀释液。相邻两浓度之比值(r)应与标准品相等,供试品与标准品各剂量组的凝结时间应相近。

5.4 血浆的制备

迅速收集兔或猪血至预先放有109mmol/L枸橼酸钠溶液的容器中,枸橼酸钠溶液与血液容积之比为1:9[1],边收集边轻轻振摇,混匀,室温下1500×g离心不少于15分钟([1]g为重力常数)。立即吸出血浆,并分成若干份分装于适宜容器内,低温冻结贮存。临用时置37℃±0.5℃水浴中融化,用两层纱布或快速滤纸滤过,使用过程中在4~8℃放置。血浆复钙法可使用兔或猪血浆;APTT法使用兔血浆。[1]

5.5 测定法

(1)兔全血[1]  取管径均匀(0.8cm×3.8cm或1.0cm×7.5cm)、清洁干燥的小试管若干支,每管加入一种浓度的标准品或供试品稀释液0.1ml,每种浓度不得少于3管,各浓度的试管支数相等。取刚抽出的兔血适量,分别注入小试管内,每管0.9ml,立即混匀,避免产生气泡,并开始计算时间。将小试管置37℃±0.5℃恒温水浴中,从动物采血时起至小试管放入恒温水浴的时间不得超过3分钟,注意观察并记录各管的凝结时间。

(2)血浆复钙法[1]  取上述规格的小试管若干支,分别加入血浆一定量,置37℃±0.5℃恒温水浴中预热5~10分钟后,依次每管加入一种浓度的标准品或供试品稀释液及1%氯化钙溶液,每种浓度不得少于3管,各浓度的试管支数相等,血浆、肝素稀释液和氯化钙溶液的加入量分别为0.5ml、0.4ml和0.1ml,或0.8ml、0.1ml和0.1ml,加入氯化钙溶液后,立即混匀,避免产生气泡,并开始计算时间,注意观察并记录各管凝结时间。

(3)APTT法 取血液凝固分析仪样品杯若干,每管依次加入血浆50μl、一种浓度的标准品或供试品稀释液50μl、APTT试剂50μl,混匀,应避免产生气泡。37℃±0.5℃预温180秒后,每管再加入CaCl2试剂50μl,然后立即用血液凝固分析仪测定含药血浆的凝结时间,即活化部分凝血活酶时间(APTT)。标准品或供试品稀释液每个浓度的测定次数不得少于3次,各浓度的测定次数应相同。测定时,血浆、标准品或供试品稀释液、APTT试剂、CaCl2试剂的加入比例和预温时间可根据仪器或试剂的说明书适当调整。测定顺序以保证标准品和供试品测定的平行性为原则,应尽量保证相同浓度的标准品和供试品稀释液的测定时间接近。

[1]

将上述方法测得的[1]各管凝结时间换算成对数,照生物检定统计法(2010年版药典二部附录XIV)中的量反应平行线测定法计算效价及实验误差。

测定法(1)的可信限率(FL%)不得大于10%。测定法(2)的可信限率(FL%)不得大于5%。

6 附录Ⅻ E 绒促性素生物测定法

本法系比较绒促性素标准品(S)与供试品(T)对幼小鼠子宫增重的作用,以测定供试品的效价。

6.1 标准品溶液的制备

试验当日,按绒促性素标准品的标示效价加0.9%氯化钠溶液制成每1ml中含10单位的溶液,充分溶解后,再用0.5%羧甲基纤维素钠溶液按高、中、低剂量组(dS3、dS2、dS1)配成3种浓度的稀释液,相邻两浓度之比值(r)应相等,且不得大于1:0.5。一般高浓度稀释液可制成每1ml中含0.3~0.8单位。调节剂量使低剂量组子宫较正常子宫明显增重,高剂量组子宫增重不致达到极限。稀释液置4~8℃贮存,可供3日使用。

6.2 供试品溶液的制备

按供试品的标示量或估计效价(AT),照标准品溶液的制备法制成高、中、低(dT3、dT2、dT1)3种浓度的稀释液,相邻两浓度之比值(r)应与标准品相等,供试品与标准品各剂量组所致反应平均值应相近。

6.3 测定法

取健康合格,出生17~23日,体重9~13g,同一来源的雌性幼小鼠,一次实验所用幼小鼠的出生日数相差不得超过3日,体重相差不得超过3g;按体重随机等分成6组,每组不少于15只。每日于大致相同的时间分别给每鼠皮下注入一种浓度的标准品或供试品稀释液0.2ml,每日1次,连续注入3次,于最后1次注入24小时后,将动物处死,称体重,解剖,于阴道和子宫交接处剪断,摘出子宫,剥离附着的组织,去掉卵巢,压干子宫内液,直接称重(天平精密度为0.1mg)并换算成每10g体重的子宫重,照生物检定统计法(2010年版药典二部附录XIV)中的量反应平行线测定法计算效价及实验误差。

本法的可信限率(FL%)不得大于25%。

7 附录Ⅻ F 缩宫素生物测定法

本法系比较垂体后叶或合成缩官素标准品(S)与供试品(T)引起离体大鼠子宫收缩的作用,以测定供试品的效价。标准品溶液的制备  迅速精密称取垂体后叶标准品适量,避免吸潮,先加少量0.25%醋酸溶液,仔细研磨,移置硬质大试管中,再精密加0.25%醋酸溶液使成每1ml中含缩宫素1单位的溶液。管口轻放一玻璃塞,浸入沸腾的水中,时时振摇,加热煮沸5分钟取出,迅速冷却,滤过,滤液分装于适宜的容器内,4~8℃贮存,经验证保持活性符合要求的条件下,可在3个月内使用。

7.1 标准品稀释液的制备

试验当日,精密量取垂体后叶标准品溶液适量或取合成缩宫素标准品,按标示效价加0.9%氯化钠溶液制成每1ml中含缩宫素1单位的溶液,按高低剂量组(dS2、dS1)加0.9%氯化钠溶液制成两种浓度的稀释液,一般高浓度稀释液可制成每1ml中含0.01~0.02单位,高低剂量的比值(r)一般不得大于1:0.7。调节剂量使低剂量能引起子宫收缩,记录仪指针一般在20~50mm;高剂量应不致使子宫收缩达到极限,记录仪指针一般为50~85mm,且高低剂量所致子宫的收缩应有明显差别。

7.2 供试品溶液与稀释液的制备

按供试品的标示量或估计效价(AT),照标准品溶液与其稀释液的制备法制成供试品高低两种浓度的稀释液,其比值(r)应与标准品相等,供试品和标准品高低剂量所致的反应均值应相近。

7.3 子宫肌蓄养液的制备

试验当日,取氯化钠9g、氯化钾0.42g、氯化钙(按无水物计算)0.06g与葡萄糖0.5g,加水700ml使溶解,另取碳酸氢钠0.5g,加水约200ml溶解后,缓缓倾注于前一溶液中,随加随搅拌,最后加水适量使成1000ml。

7.4 供试用动物

取健康合格的成年雌性大鼠,断乳后即与雄鼠隔离,出生后不超过3个月,体重160~240g。试验当日,选择阴道涂片在动情前期的动物,也可用雌性激素处理使子宫涂片为动情前期或动情期的动物。

7.5 测定法

取选定的大鼠迅速处死,剖腹取出子宫,仔细分离附在子宫肌上的结缔组织,注意避免因牵拉使子宫肌受损。在子宫分叉处剪下左右2条,取一条将其下端固定于离体器官恒温水浴装置的浴杯底部,上端用线与记录装置相连,以描记子宫收缩;浴杯中加入一定量的子宫肌蓄养液(约30~50ml),连续通入适量空气。蓄养液应调节至32~35℃并保持恒温(±0.5℃),子宫放入浴杯后,静置约15分钟,按次序准确注入等体积的标准品或供试品两种浓度的稀释液(0.3~0.8ml),待子宫肌收缩至最高点开始松弛时(约60~90秒钟),放去蓄养液并用蓄养液洗涤一次,再加入等量蓄养液,静置;相邻两次给药的间隔时间应相等(约3~5分钟),每次给药应在前一次反应恢复稳定以后进行。标准品稀释液和供试品稀释液各取高低两个剂量(dS2、dS1、dT2、dT1)为一组,按随机区组设计的次序轮流注入每组4个剂量,重复4~6组。测量各剂量所致子宫收缩的高度,照生物检定统计法(2010年版药典二部附录XIV)中的量反应平行线测定法计算效价及实验误差。

本法的可信限率(FL%)不得大于10%。

8 附录Ⅻ G 胰岛素生物测定法

本法系比较胰岛素标准品(S)与供试品(T)引起小鼠血糖下降的作用,以测定供试品的效价。

8.1 标准品溶液的制备

精密称取胰岛素标准品适量,按标示效价,加入每100ml中含有苯酚0.2g并用盐酸调节pH值为2.5的0.9%氯化钠溶液,使溶解成每1ml中含20单位的溶液,4~8℃贮存,以不超过5天为宣。

8.2 标准品稀释液的制备

试验当日,精密量取标准品溶液适量,按高低剂量组(dS2、dS1)加0.9%氯化钠溶液(pH2.5)制成两种浓度的稀释液,高低剂量的比值(r)不得大于1:0.5。高浓度稀释液一般可制成每1ml中含0.06~0.12单位,调节剂量使低剂量能引起血糖明显下降,高剂量不致引起血糖过度降低,高低剂量间引起的血糖下降有明显差别。

8.3 供试品溶液与稀释液的制备

按供试品的标示量或估计效价(AT),照标准品溶液与其稀释液的制备法制成高、低两种浓度的稀释液,其比值(r)应与标准品相等,供试品与标准品高低剂量所致的反应平均值应相近。

8.4 测定法

取健康合格、同一来源、同一性别、出生日期相近的成年小鼠,体重相差不得超过3g,按体重随机等分成4组,每组不少于10只,逐只编号,各组小鼠分别自皮下注入一种浓度的标准品或供试品稀释液,每鼠0.2~0.3ml,但各鼠的注射体积(ml)应相等。注射后40分钟,按给药顺序分别自眼静脉丛采血,用适宜的方法,如葡萄糖氧化酶-过氧化酶法测定血糖值。第一次给药后间隔至少3小时,按双交叉设计,对每组的各鼠进行第二次给药,并测定给药后40分钟的血糖值。照生物检定统计法(2010年版药典二部附录XIV)中量反应平行线测定双交叉设计法计算效价及实验误差。

本法的可信限率(FL%)不得大于25%。

9 附录Ⅻ H 精蛋白锌胰岛素注射液延缓作用测定法

本法系比较胰岛素标准品(S)与供试品(T)降低家兔血糖的情况,以判定供试品延缓作用是否符合规定

9.1 标准品溶液的制备

精密称取胰岛素标准品适量,加入每100ml中含有苯酚0.2g并用盐酸调节pH值为2.5的0.9%氯化钠溶液,使溶解成每1ml所含效价(单位)与供试品相同的溶液。

9.2 供试品溶液

直接注射,不稀释。

9.3 检查

取体重2.0~3.0kg的健康家兔若干只,雌兔须无孕,分置笼中,每笼1只。实验前18~20小时禁食,但仍给予饮水,按体重、性别随机等分为两组,一组为胰岛素标准品组,另一组为供试品组;两组间家兔的性别和体重的分配情况应尽可能相同。在实验过程中,应停止饮水,注意避免惊扰,分别自各兔耳静脉取血样(不得多于1.5ml),供测定正常血糖值用。然后分别在各兔相同部位精确皮下注射相同体积的胰岛素标准品溶液或供试品溶液,一般剂量为每兔1.2单位。胰岛素标准品组于注射后2小时及6小时,供试品组于注射后6小时及9小时,再分别自各兔取血样,用适宜的血糖测定法精密测定各血样的血糖值,以每100ml血液中所含葡萄糖的重量(mg)表示。

各次测定所得血糖值均不低于正常血糖值90%的家兔,或实验中途死亡的家兔,其记录均作废,不参加计算;参加计算的家兔,每组不得少于6只,计算每兔在注射后的血糖值相当于该兔在注射前的正常血糖值的比率(%)(简称血糖百分数),然后计算每一组内每一时间各兔血糖百分数的平均值。

9.4 结果判断

用于胰岛素标准品组的所有家兔,发生痉挛或实验中途死亡的动物数,不得超过1/5;胰岛素标准品组于注射后2小时的血糖百分数平均值应不高于65%,注射后6小时的血糖百分数平均值应不低于95%,否则均应适当调整剂量,复试。供试品组于注射后6小时或9小时的血糖百分数平均值中较低的一值不得大于75%。

10 附录Ⅻ J 硫酸鱼精蛋白生物测定法

本法系测定硫酸鱼精蛋白供试品(T)中和肝素标准品(S)所致延长新鲜兔血或猪、兔血浆凝结时间的程度,以测定供试品效价的方法。

10.1 肝素标准品溶液的制备

精密称取肝素标准品适量,按标示效价加0.9%氯化钠溶液溶解使成几种不同浓度的溶液,相邻两种浓度每1ml中所含肝素效价(单位)相差应相等,且不超过5个单位,一般可配成每1ml中含85单位、90单位、95单位、100单位、105单位、110单位、115单位、120单位、125单位等的溶液。

10.2 供试品溶液的制备

供试品如为粉末,精密称取适量,按干燥品计算,加0.9%氯化钠溶液溶解使成每1ml中含1mg的溶液。供试品如为注射液,则按标示量加0.9%氯化钠溶液稀释至同样浓度。

10.3 血浆的制备

同肝素生物测定法中血浆制备法制备(2010年版药典二部附录Ⅻ D)。

10.4 测定法

取管径均匀(0.8cm×3.8cm)、清洁干燥的小试管8支,第1管和第8管为空白对照管,加入0.9%氯化钠溶液0.2ml,第2~7管为供试品管,每管均加入供试品溶液0.1ml,再每管分别加入上述一种浓度的肝素标准品稀释液0.1ml,立即混匀。取刚抽出的兔血适量,分别加入上述8支试管内,每管0.8ml,立即混匀,避免产生气泡,并开始计算时间,将小试管置37℃±0.5℃恒温水浴中,从采动物血时起至小试管放入恒温水浴的时间不得超过2分钟;如用血浆,则分别于上述各管中加入0.7ml的血浆,置37℃±0.5℃恒温水浴中预热5~10分钟,每管分别加入1%氯化钙溶液0.1ml,立即混匀,避免产生气泡,并开始计算时间。观察并记录各管凝结时间。

10.5 结果判断

两支对照管的凝结时间相差不得超过1.35倍。在供试品管的凝结时间不超过两支对照管平均凝结时间150%的各管中,以肝素浓度最高的一管作为终点管。

同样重复5次,5次试验测得终点管的肝素浓度,相差不得大于10个单位。5次结果的平均值,即为硫酸鱼精蛋白供试品(干燥品)1mg中和肝素的效价(单位)。

11 附录Ⅻ K 洋地黄生物测定法

本法系比较洋地黄标准品(S)与供试品(T)对鸽的最小致死量(u/kg),以测定供试品的效价。

11.1 标准品溶液的制备

迅速精密称取洋地黄标准品适量,避免吸潮,置玻璃容器内,按标示效价计算,每1单位精密加入76%乙醇1ml,密塞,连续振摇1小时,静置片刻,用干燥滤器迅速滤过,防止乙醇挥发,滤液即为每1ml中含1单位的溶液,4~8℃贮存,经验证保持活性符合要求的条件下,可在1个月内使用。

11.2 标准品稀释液的制备

试验当日,精密量取标准品溶液适量,用0.9%氯化钠溶液稀释,稀释液浓度(u/ml)应调节适当(一般可用1→30),使鸽的平均最小致死量为25~34ml。供试品溶液和稀释液的制备  供试品如为粉末,精密称取适量,按标示量或估计效价(AT),照标准品溶液及其稀释液的制备法制备;供试品如为片剂,取20片以上,精密称重,求出平均片重,迅速研细,再精密称取不少于20片的粉末,按称重及标示量(AT)计算,照标准品溶液及其稀释液制备法制备。供试品稀释液和标准品稀释液的鸽平均最小致死量(ml)应相近。

11.3 测定法

取健康合格的鸽,试验前16~24小时禁食,但仍给予饮水,临试验前准确称重,选取体重在250~400g的鸽(每次试验所用鸽的体重相差不得超过100g),按体重随机等分成两组,每组至少6只,一组为标准品组,一组为供试品组,两组间鸽的情况应尽可能相近。

将鸽仰缚于适宜的固定板上,在一侧翼静脉处拔除羽毛少许,露出翼静脉,插入与滴定管(精密度0.02ml)相连的注射针头,缓缓注入标准品稀释液或供试品稀释液,开始时,一次注入0.5ml,然后以每分钟0.2ml等速连续注入,至鸽中毒死亡立即停止注入。一般死亡前有强烈颤抖、恶心呕吐排便等现象发生,至瞳孔迅速放大、呼吸停止为终点。记录注入稀释液的总量(ml),换算成每1kg体重致死量(ml)中所含效价(u/kg),取其10倍量的对数值作为反应值,照生物检定统计法(2010年版药典二部附录XIV)中的直接测定法计算效价及实验误差。

本法的可信限率(FL%)不得大于15%。

12 附录Ⅻ L 葡萄糖酸锑钠毒力检查法

本法系比较葡萄糖酸锑钠标准品(S)与供试品(T)引致小鼠死亡的数量,以判定供试品毒力是否符合规定。

12.1 标准品溶液的制备

精密称取葡萄糖酸锑钠标准品适量,按含锑量计算,加适量温水,搅拌使溶解,加热(约70℃,15分钟),补足水至一定量,于50℃恒温条件下30分钟(避免水分蒸发),放冷至室温。用下述规格的小鼠按每1g体重自尾静脉注入0.02ml标准品溶液,调节浓度,应能使约半数的小鼠死亡,死亡率在20%至80%之间即为适宜浓度。

12.2 供试品溶液的制备

如为粉末,按标准品溶液的制备方法制备。如为注射液,用水稀释,于50℃恒温条件下温浴30分钟(避免水分蒸发),放冷至室温,供试品溶液的浓度,应为标准品溶液浓度的83%。

12.3 检查法

取健康合格、体重17~25g的小鼠40只或20只,每次试验各鼠间体重相差不得超过3g,按体重随机等分为两组,每组20只或10只,一组为标准品组,一组为供试品组,分别按小鼠体重每1g自尾静脉注入0.02ml标准品溶液或供试品溶液,每只应在4~5秒钟内匀速注射完毕。立即观察15分钟,记录小鼠死亡数。

12.4 结果判断

用40只小鼠检查时,若供试品组小鼠死亡数较标准品组小鼠死亡数少或两组小鼠死亡数相同,则判定供试品的毒力符合规定;若供试品组的小鼠死亡数较标准品组小鼠死亡数多,则判定供试品的毒力不符合规定。

用20只小鼠检查对,若供试品组小鼠死亡数较标准品组小鼠死亡数少2只或2只以上,则判定供试品的毒力符合规定;若供试品组小鼠死亡数较标准品组小鼠死亡数多2只或2只以上,则判定供试品的毒力不符合规定;若两组小鼠死亡数相同或仅相差1只,须另取小鼠20只重新试验,将前后两次试验结果合并计算,按上述使用40只小鼠的结果判断方法判断结果。

13 附录Ⅻ M 卵泡刺激素生物测定法

本法系比较尿促性素标准品(S)与供试品(T)对幼大鼠卵巢增重的作用,以测定供试品中卵泡刺激素的效价。

13.1 溶剂的制备

试验当日,称取牛血清白蛋白适量,加0.9%氯化钠溶液溶解,制成每1ml中含1mg的溶液,充分溶解后,用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.2±0.2。

精密称取已知效价的绒促性素(原料或粉针剂均可),加入上述溶液中溶解,制成每1ml中含20单位的溶液,混匀备用。

13.2 标准品溶液的制备

试验当日,按尿促性素标准品中卵泡刺激素的标示效价,用上述溶剂,按高、中、低剂量组(dS3、dS2、dS1)配成3种浓度的标准品溶液,相邻两浓度之比值(r)应相等,且不得大于1:0.5。一般高浓度的标准品溶液可制成每1ml中含2~5单位。调节剂量使低剂量组卵巢明显增重,高剂量组卵巢增重不致达到极限。标准品溶液置4~8℃贮存,可供3日使用。

13.3 供试品溶液的制备

按供试品中卵泡刺激素的标示量或估计效价(AT),照标准品溶液的制备法制成高、中、低(dT3、dT2、dT1)3种浓度的供试品溶液,相邻两浓度之比值(r)应与标准品相等,供试品与标准品各剂量组所致反应平均值应相近。

13.4 测定法

取健康合格,出生19~23日,体重36~50g,同一来源的雌性幼大鼠,一次试验所用幼大鼠的出生日期相差不得超过3日,体重相差不得超过10g;按体重随机等分成6组,每组不少于8只,每日子大致相同的时间分别给每鼠皮下注入一种浓度的标准品溶液或供试品溶液0.5ml,每日一次,连续注入3次,于最后一次注入24小时后,将动物处死,解剖,摘出卵巢,剥离附着的组织,去除输卵管,用滤纸吸去周围的液体,直接称重(天平精密度0.1mg),照生物检定统计法(2010年版药典二部附录XIV)中的量反应测定法计算效价及实验误差。

本法的可信限率(FL%)不得大于45%。

14 附录Ⅻ N 黄体生成素生物测定法

本法系比较尿促性素标准品(S)与供试品(T)对幼大鼠精囊增重的作用,以测定供试品中黄体生成素的效价。

14.1 溶剂的制备

试验当日,称取牛血清白蛋白适量,加0.9%氯化钠溶液溶解,制成每1ml中含1mg的溶液,充分溶解后,用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.2±0.2。

14.2 标准品溶液的制备

试验当日,按尿促性素标准品中黄体生成素的标示效价,用上述溶剂,按高、中、低剂量组(dS3、dS2、dS1)制成3种浓度的标准品溶液,相邻两浓度之比值(r)应相等,且不得大于1:0.5。一般高浓度标准品溶液可制成每1ml中含8~10单位。调节剂量使低剂量组精囊明显增重,高剂量组精囊增重不致达到极限。标准品溶液置4~8℃贮存,可供4日使用。

14.3 供试品溶液的制备

按供试品中黄体生成素的标示量或估计效价(AT),照标准品溶液的制备法制成高、中、低(dT3、dT2、dT1)3种浓度的供试品溶液,相邻两浓度之比值(r)应与标准品相等,供试品与标准品各剂量组所致反应平均值应相近。

14.4 测定法

取健康合格,出生19~23日,体重36~50g,同一来源的雄性幼大鼠,一次实验所用幼大鼠的出生日期相差不得超过3日,体重相差不得超过10g;按体重随机等分成6组,每组不少于6只。每日于大致相同的时间分别给每鼠皮下注入一种浓度的标准品溶液或供试品溶液0.5ml,每日1次,连续注入4次,于最后1次注入24小时后,将动物处死,解剖,摘出整个前列腺,由前叶和精囊交界处剥离出精囊,去除附着的组织,用滤纸吸去周围的液体,直接称重(天平精密度0.1mg),照生物检定统计法(2010年版药典二部附录XIV)中的量反应测定法计算效价及实验误差。

本法的可信限率(FL%)不得大于35%。

15 附录Ⅻ O 降钙素生物测定法

本法系通过比较降钙素标准品(S)与供试品(T)对大鼠血钙降低的程度,以测定供试品的效价。

15.1 溶剂的制备

称取牛血清白蛋白0.2g,加水20ml,混匀,置56℃水浴中保温1小时,取出放至室温,于-10~-20℃下冻存。实验前取出,于36℃±0.5℃水浴中将其融化。加至含有2g醋酸钠的水溶液中,加入浓盐酸约3.5ml,再加水至总量近200ml,用盐酸或氢氧化钠溶液调节pH值至3.5~4.5,最后加水至200ml。

15.2 标准品溶液的制备

试验当日,按降钙素标准品的标示效价,用上述溶剂,按高、低剂量组(dS2、dS1)配成,2种浓度的标准品溶液。一般高浓度标准品溶液的浓度控制在50~100mIU/ml。高、低浓度的比值(r)不得大于3:1。

15.3 供试品溶液的制备

按供试品中降钙素的标示量或估计效价(AT),照标准品溶液的制备法制成高、低(dT2、dT1)2种浓度的供试品溶液,其浓度之比值(r)应与标准品相等,供试品与标准品各剂量组所致反应平均值应相近。

15.4 测定法

取健康合格,体重200~250g,同一性别,同一来源的大鼠。一次实验所用大鼠体重相差不超过20g,实验前禁食16小时,自由饮用蒸馏水,按体重随机等分成4组,分别为标准品高、低剂量组和供试品高、低剂量组,每组不少于5只。将各组动物称重并编号,分别按体重给各组动物于腹部皮下注射(或尾静脉注射)相应浓度的标准品或供试品溶液,给药体积为0.4ml/100g体重。注射后每只准确计时1小时,然后按给药前后顺序分别自眼静脉丛取血。用适宜的方法,如邻甲酚络合剂测定血钙值。照生物检定统计法(2010年版药典二部附录XIV)中量反应平行线测定法计算效价及实验误差。

本法的可信限率(FL%)不得大于45%。

16 附录Ⅻ P 生长激素生物测定法

16.1 1.去垂体大鼠体重法

本法系通过比较生长激素标准品(S)与供试品(T)对幼龄去垂体大鼠体重增加的程度,以测定供试品效价的一种方法。

16.1.1 标准品溶液的制备

试验当日,取标准品,按标示效价用含0.1%牛血清白蛋白的0.9%氯化钠溶液,制成高、低两种浓度的标准品溶液。一般高浓度标准品溶液配成每1ml含0.1~0.2IU,低浓度标准品溶液配成每1ml含0.025~0.05IU,高低两浓度比值(r)一般为1:0.25,标准品溶液分装成每天剂量并密封于-15℃以下保存,临用时融化。

16.1.2 供试品溶液的制备

按供试品的标示效价或估计效价(AT),照标准品溶液的制备及保存方法制备和保存。

16.1.3 测定法

取同一来源、品系,出生26~28天,体重60~80g,同一性别,健康的大鼠,试验前2~3周手术摘除垂体,手术后于清洁级以上动物室饲养使其恢复。

取去垂体手术后2~3周、体重变化小于手术前±10%的大鼠,按体重随机等分成4组,每组至少8只,每只编号并记录体重。分别自颈部皮下注射一种浓度的标准品溶液或供试品溶液0.5ml,每日1次,连续6日。于最后1次给药后24小时,处死大鼠,称体重,必要时实验结束后可进行尸检,切开蝶鞍区,肉眼检查有无垂体残留,剔除有垂体残存的大鼠。每只动物给药后体重增加的克数作为反应值。供试品与标准品各剂量组所致反应的平均值应相当,低剂量组应较正常动物体重有明显的增加,高剂量组体重增加不致达极限。照生物检定统计法(2010年版药典二部附录XIv)中的量反应平行线测定法计算效价及实验误差。

本法可信限率(FL%)不得大于50%。

16.2 2.去垂体大鼠胫骨

本法系通过比较生长激素标准品(S)与供试品(T)对去垂体大鼠胫骨骨骺板宽度增加的程度,以测定供试品效价的一种方法。

16.2.1 标准品溶液和供试品溶液的制备

同体重法。

16.2.2 测定法

本法可与去垂体大鼠体重法同步进行。待体重法实验结束后,取下两腿胫骨,置10%甲醛溶液保存,从胫骨近心端顶部中间沿矢状面切开,置10%甲醛溶液中保存,水洗10分钟后,置丙酮溶液中10分钟,水洗3分钟,置2%硝酸银溶液中染色2分钟,水洗后置水中强光照射至变棕黑色,于10%硫代硫酸钠溶液固定30秒钟,置80%乙醇溶液中供测量用。测量时沿刨面切1mm左右薄片,置显微镜下测量胫骨骨骺板宽度,作为反应值。照生物检定统计法(2010年版药典二部附录XIV)中的量反应平行线测定法计算效价及实验误差。

本法可信限率(FL%)不得大于50%。

17 参考资料

  1. ^ [1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版:第三增补本[M].北京:中国医药科技出版社,2010.

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  • 评论总管
    2019/10/23 13:54:08 | #0
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本页最后修订于 2015年1月20日 星期二 20:06:59 (GMT+08:00)
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2019/10/23 13:54:08