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2010年版药典二部附录Ⅸ

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目录

1 拼音

2010 nián bǎn yào diǎn èr bù fù lù Ⅸ

中华人民共和国药典》(2010年版)二部附录Ⅸ

2 附录Ⅸ A 溶液颜色检查法

药物溶液的颜色及其与规定颜色的差异能在一定程度上反映药物的纯度。本法系将药物溶液的颜色与规定的标准比色液相比较,或在规定的波长处测定其吸光度,以检查其颜色。

品种项下规定的“无色或几乎无色”,其“无色”系指供试品溶液的颜色与所用溶剂相同,“几乎无色”系指浅于用水稀释1倍后的相应色调1号标准比色液。

2.1 第一法

除另有规定外,取各品种项下规定量的供试品,加水溶解,置于25ml的纳氏比色管中,加水稀释至10ml。另取规定色调和色号的标准比色液10ml,置于另一25ml的纳氏比色管中,两管同置白色背景上,自上向下透视,或同置白色背景前,平视观察;供试品管呈现的颜色与对照管比较,不得更深。如供试品管呈现的颜色与对照管的颜色深浅非常接近或色调不尽一致,使目视观察无法辨别二者的深浅时,应改用第三法(色差计法)测定,并将其测定结果作为判定依据。

2.1.1 比色用重铬酸钾

精密称取在120℃干燥恒重基准重铬酸钾0.4000g,置500ml量瓶中,加适量水溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。每1ml溶液中含0.800mg的K2Cr2O7。

2.1.2 比色用硫酸铜

取硫酸铜约32.5g,加适量的盐酸溶液(1→40)使溶解成500ml,精密量取10ml,置碘量瓶中,加水50ml、醋酸4ml与碘化钾2g,用硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)滴定,至近终点时,加淀粉指示液2ml,继续滴定至蓝色消失。每1ml硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)相当于24.97mg的CuSO4·5H2O。根据上述测定结果,在剩余的原溶液中加适量的盐酸溶液(1→40),使每1ml溶液中含62.4mg的CuSO4·5H2O,即得。

2.1.3 比色用氯化钴

取氯化钴约32.5g,加适量的盐酸溶液(1→40)使溶解成500ml,精密量取2ml,置锥形瓶中,加水200ml,摇匀,加氨试液至溶液由浅红色转变至绿色后,加醋酸-醋酸钠缓冲液( pH6.0)10ml,加热至60℃,再加二甲酚橙指示液5滴,用乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05mol/L)滴定至溶液显黄色。每1ml乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05mol/L)相当于11.90mg的CoCl2·6H2O。根据上述测定结果,在剩余的原溶液中加适量的盐酸溶液(1→40),使每1ml溶液中含59.5mg的CoCl2·6H2O,即得。

2.1.4 各种色调标准贮备液的制备

按表1精密量取比色用氯化钴液、比色用重铬酸钾液、比色用硫酸铜液与水,摇匀,即得。

表1  各种色调标准贮备液的配制

色调

比色用氯

化钴液/ml

比色用重铬

酸钾液/ml

比色用硫酸

铜液/ml

水/ml

黄绿色

黄色

橙黄色

橙红色

棕红色

1.2

4.0

10.6

12.0

22.5

22.8

23.3

19.0

20.0

12.5

7.2

0

4.0

0

20.0

68.8

72.7

66.4

68.0

45.0

各种色调色号标准比色液的制备  按表2精密量取各色调标准贮备液与水,摇匀,即得。

表2 各种色调色号标准比色液的配制

色号

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

贮备液/ml

加水量/ml

0.5

9.5

1.0

9.0

1.5

8.5

2.0

8.0

2.5

7.5

3.0

7.0

4.5

5.5

6.0

4.0

7.5

2.5

10.0

0

2.2 第二法

除另有规定外,取各品种项下规定量的供试品,加水溶解使成10ml,必要时滤过,滤液照分光光度法于规定波长处测定,吸光度不得超过规定值。

2.3 第三法(色差计法)

本法是通过色差计直接测定溶液的透射三刺激值,对其颜色进行定量表述和分析方法。当目视比色法较难判定供试品与标准比色液之间的差异时,应考虑采用本法进行测定与判断

供试品与标准比色液之间的颜色差异,可以通过分别比较它们与水之间的色差值来得到,也可以通过直接比较它们之间的色差值来得到。

现代颜色视觉理论认为,在人眼视网膜上有三种感色的锥体细胞,分别对红、绿、蓝三种颜色敏感。颜色视觉过程可分为两个阶段:第一阶段,视网膜上三种独立的锥体感色物质,有选择地吸收光谱不同波长的辐射,同时每一物质又可单独产生白和黑的反应,即在强光作用下产生白的反应,无外界刺激时产生黑的反应;第二阶段,在神经兴奋由锥体感受器向视觉中枢传导过程中,这三种反应又重新组合,最后形成三对对立性的神经反应,即红或绿、黄或蓝、白或黑的反应。最终在大脑皮层的视觉中枢产生各种颜色感觉

自然界中的每种颜色都可以用选定的、能刺激人眼中三种受体细胞的红、绿、蓝三原色,按适当比例混合而成。由此引入一个新的概念——三刺激值,即在给定的三色系统中与待测色达到色匹配所需要的三个原刺激量,分别以X、Y、Z表示。通过对众多具有正常色觉的人体(称为标准观察者,即标准眼)进行广泛的颜色比较试验,测定了每一种可见波长(400~760nm)的光引起每种锥体刺激的相对数量的色匹配函数,这些色匹配函数分别用(λ)、(λ)、(λ)来表示。把这些色匹配函数组合起来,描绘成曲线,就叫做CIE色度标准观察者的光谱三刺激值曲线(图1)。

图1  CIE 1931色度标准观察者的光谱三刺激值曲线(10°视场)

色匹配函数和三刺激值间的关系以下列方程表示:

式中K为归化系数;

S(λ)为光源的相对光谱功率分布

P(λ)为物质色的光谱反射比或透射比;

(λ)、(λ)、(λ)为标准观察者的色匹配函数;d(λ)为波长间隔,一般采用10nm或5nm。

当某种颜色的三刺激值确定之后,则可用其计算出该颜色在一个理想的三维颜色空间中的坐标,由此推导出许多组的颜色方程(称为表色系统)来定义这一空间。如:CIE1931-XYZ表色系统,CIE1964补充标准色度系统,CIE1976L*a*b*色空间(CIELab均匀色空间),Hunter表色系统等。

为便于理解比对,人们通常采用CIELab均匀色空间来表示颜色及色差。该色空间由直角坐标L*a*b*构成。在三维色坐标系的任一点都代表一种颜色,其与参比点之间的几何距离代表两种颜色之间的色差(图2和图3)。相等的距离代表相同的色差值。用仪器法对供试品溶液与其规定的标准比色液的颜色进行比较时,需比较的参数就是空白对照液的颜色和供试溶液或其规定的标准比色液颜色在均匀色空间中的差值。

图2 L*a*b*色品图

图3 L*a*b*色空间和色差△E*

在CIELab均匀色空间中,三维色坐标L*、a*、b*与三刺激值X、Y、Z和色差之间的关系如下:

以上公式仅适用于X/Xn、Y/Yn、Z/Zn>0.008856时。式中  X、Y、Z为待测溶液的三刺激值;

Xn、Yn、Zn为完全漫反射体的三刺激值;△E*为供试品溶液与标准比色液的色差;△L*为供试品溶液与标准比色液的明度指数之差,其

中△L*为正,表示供试品溶液比标准比色液颜色亮(鲜艳);

△a*、△b*为供试品溶液色与标准比色液色的色品指数之差,其中△a*、△b*为正,表示供试品比标准比色液颜色更深(饱和)。

色差计的工作原理简单地说即是模拟人眼的视觉系统,利用仪器内部的模拟积分光学系统,把光谱光度数据的三刺激值进行积分而得到颜色的数学表达式,从而计算出L*、a*、b*值及对比色的色差。图4为色差计光学系统示意图。在仪器使用的标准光源与日常观察供试品所使用光源光谱功率分布一致(比如昼光),其光电响应接收条件与标准观察者的色觉特性一致(比如10°视场)的条件下,用仪器方法测定颜色,不但能够精确、定量地测定颜色和色差,而且比目测法更为科学客观,且不随时间、地点、人员变化而发生变化。

图4 色差计光学系统

2.3.1 1.对仪器的一般要求

使用的测色仪器一般为光电积分型色差计,照明观察条件为o/d条件或d/o条件,D65光源照明,10°视场,可直接测出三刺激值X、Y、Z,并能直接计算给出L*、a*、b*和△E*及供试品溶液的色调色号。

因溶液的颜色随着被测定溶液的液层厚度而变,所以除另有规定外,测量透射色时,应使用1cm厚度液槽。

为保证测量的可靠性,应定期对仪器进行全面的检定。在每次测量时,要用无彩色物质如水或空气对仪器进行校准,并规定它在所有波长下的透射率均为1.000。

室温时,在D65为光源、10°视场条件下,水或空气的三刺激值分别为:

X=94.81;Y=100.00;Z=107.32

2.3.2 2.测定法

除另有规定外,用水对仪器进行校准,取按各品种项下规定的方法分别制得的供试品溶液和标准比色液,置仪器上进行测定,供试品溶液与水的色差值△E*应不超过相应色调的标准比色液与水的色差值△E*

如品种项下规定的色调有两种,且供试品溶液的实际色调介于两种规定色调之间,且难以判断更倾向何种色调时,将测得的供试品溶液与水的色差值(△E*)与两种色调标准比色液与水的色差值的平均值[△E*≤(△Es1*△Es2*)/2)比较,不得更深。

3 附录Ⅸ B 澄清度检查法

澄清度检查法系将药品溶液与规定的浊度标准液相比较,用以检查溶液的澄清程度。[1]

品种项下规定的“澄清”,系指供试品溶液的澄清度与所用溶剂相同,或不超过0.5号浊度标准液的浊度。“几乎澄清”,系指供试品溶液的浊度介于0.5号至1号浊度标准液的浊度之间。

3.1 第一法(目视法)①

注①新增仪器法作为第二法,原方法作为第一法(目视法)。

除另有规定外,按各品种项下规定的浓度要求,在室温条件下将用水稀释至一定浓度的供试品溶液与等量的浊度标准液分别置于配对的比浊用玻璃管(内径15~16mm,平底,具塞,以无色、透明、中性硬质玻璃制成)中,在浊度标准液制备5分钟后,在暗室内垂直同置于伞棚灯下,照度为1000lx,从水平方向观察、比较。除另有规定外,供试品溶解后应立即检视。第一法无法准确判定二者的澄清度差异时,改用第二法进行测定并以其测定结果进行判定。[1]

浊度标准贮备液的制备 称取于105℃干燥至恒重的硫酸肼1.00g,置100ml量瓶中,加水适量使溶解,必要时可在40℃的水浴中温热溶解,并用水稀释至刻度,摇匀,放置4~6小时;取此溶液与等容量的10%乌洛托品溶液混合,摇匀,于25℃避光静置24小时,即得。该溶液置冷处避光保存,可在2个月内使用,用前摇匀。

浊度标准原液的制备 取浊度标准贮备液15.0ml,置1000ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,取适量,置1cm吸收池中,照紫外-可见分光光度法(附录Ⅳ A),在550nm的波长处测定,其吸光度应在0.12~0.15范围内。该溶液应在48小时内使用,用前摇匀。

浊度标准液的制备 取浊度标准原液与水,按下表配制,即得。浊度标准液应临用时制备,使用前充分摇匀。

级号

0.5

1

2

3

4

浊度标准原液/ml

2.50

5.0

10.0

30.0

50.0

水/ml

97.50

95.0

90.0

70.0

50.0

{

3.2 第二法(仪器法)②

注②新增第二法(仪器法)。

供试品溶液的浊度可采用仪器法测定。溶液中不同大小、不同特性的微粒物质包括有色物质均可使入射光产生透射和散射,通过测定透射光或散射光的强度,可以检查供试品溶液的浊度。仪器测定模式通常有三种类型,透射光式、散射光式和透射光一散射光比较测量模式(比率浊度模式)。

3.2.1 1.仪器的一般要求

采用适宜的散射光式浊度仪,光源峰值波长约为860nm左右;测量范围应包含0.01~100NTU。在0~10NTU范围内分辨率应为0.01NTU;在10~100NTU范围内分辨率应为0.1NTU。

3.2.2 2.适用范围及检测原理

本法采用散射光式浊度仪,适用于低、中浊度无色供试品溶液的浊度测定(浊度值为100NTU以下的供试品)。因为高浊度的供试品会造成多次散射现象,使散射光强度迅速下降,导致散射光强度不能正确反映供试品的浊度值。0.5号至4号浊度标准液的浊度值范围约为0~40NTU。

采用散射光式浊度仪测定时,入射光和测定的散射光呈90°夹角,入射光强度和散射光强度关系式为:

I=K'TI0

式中I为散射光强度,单位为cd; I0为入射光强度,单位为cd;K'为散射系数;T为供试品溶液的浊度值,单位为NTU(NTU是基于福尔马肼浊度标准液测定的散射浊度单位,福尔马肼浊度标准液即为第一法中的浊度标准贮备液)。在入射光强度I0不变的情况下,散射光强度I与浊度值成正比,因此,可以将浊度测量转化为散射光强度的测量。

3.2.3 3.系统的适用性试验

仪器应定期(一般每月一次)对浊度标准液的线性重复性进行考察,采用0.5号至4号浊度标准液进行浊度值测定,浊度标准液的测定结果(单位NTU)与浓度间应呈线性关系,线性方程的相关系数应不低于0.999;重复测定5次0.5号至4号浊度标准液,0.5号和1号浊度标准液测量浊度值的相对标准偏差应不大于5%,2~4号浊度标准液测量浊度值的相对标准偏差不大于2%。

3.2.4 4.测定法

按照仪器说明书要求并采用规定的浊度液进行仪器校正。溶液剂直接取样测定;原料药或其他剂型按照个论项下的标准规定制备供试品溶液,应临用时制备。分别取供试品溶液和相应浊度标准液进行测定,测定前应摇匀,读取浊度值。供试品溶液浊度值不得大于相应浊度标准液的浊度值。}[1]

4 附录Ⅸ C 不溶性微粒检查法

本法系在可见异物检查符合规定后,用以检查静脉注射剂(溶液型注射液注射用无菌粉末注射用浓溶液)及供静脉注射用无菌原料药中不溶性微粒的大小及数量。

本法包括光阻法和显微计数法。当光阻法测定结果不符合规定或供试品不适于用光阻法测定时,应采用显微计数法进行测定,并以显微计数法的测定结果作为判定依据。

光阻法不适用于黏度过高和易析出结晶的制剂,也不适用于进入传感器时容易产生气泡的注射剂。对于黏度过高,采用两种方法都无法直接测定的注射液,可用适宜的溶剂经适当稀释后测定。

4.1 试验环境及检测

试验操作环境应不得引入外来微粒,测定前的操作应在层流净化台中进行。玻璃仪器和其他所需的用品均应洁净、无微粒。本法所用微粒检查用水(或其他适宜溶剂),使用前须经不大于1.0μm的微孔滤膜滤过。

取微粒检查用水(或其他适宜溶剂)50ml,按相应检查法项下规定的方法测定。光阻法要求每10ml中含10μm及10μm以上的不溶性微粒应在10粒以下,含25μm及25μm以上的不溶性微粒应在2粒以下。显微计数法要求每50ml中含10μm及10μm以上的不溶性微粒应在20粒以下,含25μm及25μm以上的不溶性微粒应在5粒以下。否则表明微粒检查用水(或其他适宜溶剂)、玻璃仪器或试验环境不适于进行微粒检查,应重新处理,检测符合规定后方可进行供试品检查。

4.2 第一法(光阻法)

当液体中的微粒通过一窄小的检测区时,与液体流向垂直的入射光,由于被微粒阻挡而减弱,因此由传感器输出的信号降低,这种信号变化与微粒的截面积大小相关,光阻法检查注射剂中不溶性微粒即依据此原理。

4.2.1 对仪器的一般要求

仪器通常包括取样器、传感器和数据处理器三部分。

测量粒径范围为2~100μm,检测微粒浓度为0~10000个/ml。

4.2.2 仪器的校正与检定

所用仪器应至少每6个月校正一次。

(1)取样体积  待仪器稳定后,取多于取样体积的微粒检查用水置于取样杯中,称定重量,通过取样器由取样杯中量取一定体积的微粒检查用水后,再次称定重量。以两次称定的重量之差计算取样体积。连续测定3次,每次测得体积与量取体积的示值之差应在±5%以内。测定体积的平均值与量取体积的示值之差应在±3%以内。也可采用其他适宜的方法校正,结果应符合上述规定。

(2)微粒计数  取相对标准偏差不大于5%,平均粒径为10μm的标准粒子,制成每1ml中含1000~1500微粒数的悬浮液,静置2分钟脱气,开启搅拌器,缓慢搅拌使其均匀(避免气泡产生),依法测定3次,记录5μm通道的累计计数,第一次数据不计,后两次测定结果的平均值与已知粒子数之差应在士20%以内。

(3)传感器分辨率  取相对标准偏差不大于5%,平均粒径为10μm的标准粒子(均值粒径的标准差应不大于1μm),制成每1ml中含1000~1500微粒数的悬浮液,静置2分钟脱气,开启搅拌器,缓慢搅拌使其均匀(避免气泡产生),依法测定8μm、10μm和12μm三个通道的粒子数,计算8μm与10μm两个通道的差值计数和10μm与12μm两个通道的差值计数,上述两个差值计数与10μm通道的累计计数之比都不得小于68%。若校正结果不符合规定,应重新调试仪器后再次进行校正,符合规定后方可使用。

如所使用仪器附有自检软件,可进行自检。

4.2.3 检查法

(1)标示装量为25ml或25ml以上的静脉用注射液或注射用浓溶液  除另有规定外,取供试品,用水将容器外壁洗净,小心翻转20次,使溶液混合均匀,立即小心开启容器,先倒出部分供试品溶液冲洗开启口及取样杯,再将供试品溶液倒入取样杯中,静置2分钟或适当时间脱气,置于取样器上(或将供试品容器直接置于取样器上)。开启搅拌,使溶液混匀(避免气泡产生),依法测定至少3次,每次取样应不少于5ml,记录数据;另取至少2个供试品,同法测定。每个供试品第一次数据不计,取后续测定结果的平均值计算。

(2)标示装量为25ml以下的静脉用注射液或注射用浓溶液除另有规定外,取供试品,用水将容器外壁洗净,小心翻转20次,使溶液混合均匀,静置2分钟或适当时间脱气,小心开启容器,直接将供试品容器置于取样器上,开启搅拌或以手缓缓转动,使溶液混匀(避免产生气泡),由仪器直接抽取适量溶液(以不吸入气泡为限),测定并记录数据;另取至少3个供试品,同法测定。第一个供试品的数据不计,取后续测定结果的平均值计算。

(1)、(2)项下的注射用浓溶液如黏度太大,不便直接测定时,可经适当稀释后,依法测定。

也可采用适宜的方法,在层流净化台上小心合并至少3个供试品的内容物(使总体积不少于25ml),置于取样杯中,静置2分钟或适当时间脱气,置于取样器上。开启搅拌,使溶液混匀(避免气泡产生),依法测定至少4次,每次取样应不少于5ml。第一次数据不计,取后续测定结果的平均值,根据取样体积与每个容器的标示装置体积,计算每个容器所含的微粒数。

(3)静脉注射用无菌粉末  除另有规定外,取供试品,用水将容器外壁洗净,小心开启瓶盖,精密加入适量微粒检查用水(或适宜的溶剂),小心盖上瓶盖,缓缓振摇使内容物溶解,静置2分钟或适当时间脱气,小心开启容器,直接将供试品容器置于取样器上,开启搅拌或以手缓缓转动,使溶液混匀(避免气泡产生),由仪器直接抽取适量溶液(以不吸入气泡为限),测定并记录数据;另取至少3个供试品,同法测定。第一个供试品的数据不计,取后续测定结果的平均值计算。

也可采用适宜的方法,取至少3个供试品,在层流净化台上用水将容器外壁洗净,小心开启瓶盖,分别精密加入适量微粒检查用水(或适宜的溶剂),缓缓振摇使内容物溶解,小心合并容器中的溶液(使总体积不少于25ml),置于取样杯中,静置2分钟或适当时间脱气,置于取样器上。开启搅拌,使溶液混匀(避免气泡产生),依法测定至少4次,每次取样应不少于5ml。第一次数据不计,取后续测定结果的平均值,计算每个容器所含的微粒数。

(4)供注射用无菌原料药  按各品种项下规定,取供试品适量(相当于单个制剂的最大规格量),置取样杯或适宜的容器中,照上述(3)法,自“精密加入适量微粒检查用水(或适宜的溶剂),缓缓振摇使内容物溶解”起,依法操作,测定并记录数据;另取至少三份供试品,同法测定。第一次数据不计,取后续测定结果的平均值,计算每份所含的微粒数。

4.2.4 结果判定

(1)标示装量为100ml或100ml以上的静脉用注射液  除另有规定外,每1ml中含10μm及10μm以上的微粒不得过25粒,含25μm及25μm以上的微粒不得过3粒。

(2)标示装量为100ml以下的静脉用注射液、静脉注射用无菌粉末、注射用浓溶液及供注射用无菌原料药  除另有规定外,每个供试品容器(份)中含10μm及10μm以上的微粒不得过6000粒,含25μm及25μm以上的微粒不得过600粒。

4.3 第二法(显微计数法)

4.3.1 对仪器的一般要求

仪器通常包括层流净化台、显微镜、微孔滤膜及其滤器、平皿等。

4.3.1.1 层流净化台

高效空气过滤器孔径0.45μm,气流方向由里向外,应定期检查风速及净化台上空气中的微粒数。

4.3.1.2 显微镜

双筒大视野显微镜,目镜内附标定的测微尺(每格5~10μm)。坐标轴前后、左右移动范围均应大于30mm.显微镜装置内附有光线投射角度、光强度均可调节的照明装置。检测时放大100倍。

4.3.1.3 微孔滤膜

白色,孔径0.45μm、直径25mm或13mm,一面印有间隔3mm的格栅;膜上如有10μm及10μm[2]以上的不溶性微粒,应在5粒以下,并不得有25μm及25μm[2]以上的微粒,必要时,可用微粒检查用水冲洗使符合要求。

4.3.2 检查前的准备

试验环境检测符合规定后,在层流净化台上将滤器用微粒检查用水(或其他适宜溶剂)冲洗至洁净,用平头无齿镊子夹取测定用滤膜,用微粒检查用水(或其他适宜溶剂)冲洗后,置滤器托架上;固定滤器,倒置,反复用微粒检查用水(或其他适宜溶剂)冲洗滤器内壁,沥干后安装在抽滤瓶上,备用。

4.3.3 检查法

(1)标示装量为25ml或25ml以上的静脉用注射液或注射用浓溶液  除另有规定外,取供试品,用水将容器外壁洗净,在层流净化台上小心翻转20次,使溶液混合均匀,立即小心开启容器,用适宜的方法抽取或量取供试品溶液25ml,沿滤器内壁缓缓注入经预处理的滤器(滤膜直径25mm)中。静置1分钟,缓缓抽滤至滤膜近干,再用微粒检查用水25ml,沿滤器内壁缓缓注入,洗涤并抽滤至滤膜近干,然后用平头镊子将滤膜移置平皿上(必要时,可涂抹极薄层的甘油使滤膜平整),微启盖子使滤膜适当干燥后,将平肛闭合,置显微镜载物台上。调好入射光,放大100倍进行显微测量,调节显微镜至滤膜格栅清晰,移动坐标轴,分别测定有效滤过面积上最长粒径大于10μm和25μm的微粒数。另取至少2个供试品,同法测定,计算测定结果的平均值。

(2)标示装量为25ml以下的静脉用注射液或注射用浓溶液除另有规定外,取供试品,用水将容器外壁洗净,在层流净化台上小心翻转20次,使混合均匀,立即小心开启容器,用适宜的方法直接抽取每个容器中的全部溶液,沿滤器内壁缓缓注入经预处理的滤器(滤膜直径13mm)中,照上述(1)同法测定。

(3)静脉注射用无菌粉末及供注射用无菌原料药  除另有规定外,照光阻法中检查法的(3)或(4)制备供试品溶液,同上述(1)操作测定。

4.3.4 结果判定

(1)标示装量为100ml或100ml以上的静脉用注射液除另有规定外,每1ml中含10μm及10μm以上的微粒不得过12粒,含25μm及25μm以上的微粒不得过2粒。

(2)标示装量为100ml以下的静脉用注射液、静脉注射用无菌粉末、注射用浓溶液及供注射用无菌原料药  除另有规定外,每个供试品容器(份)中含10μm及10μm以上的微粒不得过3000粒,含25μm及25μm以上的微粒不得过300粒。

5 附录Ⅸ D 结晶性检查法

固态物质分为结晶质和非晶质两大类。可用下列方法检查物质的结晶性。

5.1 第一法(偏光显微镜法)

多晶体具有光学各向异性,当光线通过这些透明晶体时会发生双折射现象。

取供试品颗粒少许,置载玻片上,加液状石蜡适量使晶粒浸没其中,在偏光显微镜下检视,当转动载物台时,应呈现双折射和消光位等各品种项下规定的晶体光学性质。

5.2 第二法(X射线粉末衍射法)

结晶质呈现特征的衍射图(尖锐的衍射峰),而非晶质的衍射图则呈弥散状。测定方法见2010年版药典二部附录Ⅸ F。

6 附录Ⅸ E 粒度和粒度分布测定法

本法用于测定原料药和药物制剂的粒子大小或粒度分布。其中第一法、第二法用于测定药物制剂的粒子大小或限度,第三法用于测定原料药或药物制剂的粒度分布。

6.1 第一法(显微镜法)

本法中的粒度,系以显微镜下观察到的长度表示。

6.1.1 目镜测微尺的标定

照显微鉴别法(2010年版药典一部附录Ⅱ C)标定。[3]

6.1.2 测定法

取供试品,用力摇匀,黏度较大者可按各品种项下的规定加适量甘油溶液(1→2)稀释,照该剂型或各品种项下的规定,量取供试品,置载玻片上,覆以盖玻片,轻压使颗粒分布均匀,注意防止气泡混入,半固体可直接涂在载玻片上,立即在50~100倍显微镜下检视盖玻片全部视野,应无凝聚现象,并不得检出该剂型或各品种项下规定的50μm及以上的粒子。再在200~500倍的显微镜下检视该剂型或各品种项下规定的视野内的总粒数及规定大小的粒数,并计算其所占比例(%)。

6.2 第二法(筛分法

筛分法一般分为手动筛分法、机械筛分法与空气喷射筛分法。手动筛分法和机械筛分法适用于测定大部分粒径大于75μm的样品。对于粒径小于75μm的样品,则应采用空气喷射筛分法或其他适宜的方法。

机械筛分法系采用机械方法或电磁方法,产生垂直振动、水平圆周运动、拍打、拍打与水平圆周运动相结合等振动方式。空气喷射筛分法则采用流动的空气流带动颗粒运动。筛分试验时需注意环境湿度,防止样品吸水或失水。对易产生静电的样品,可加入0.5%胶质二氧化硅和(或)氧化铝等抗静电剂,以减小静电作用产生的影响。

6.2.1 1.手动筛分法

(1)单筛分法  称取各品种项下规定的供试品,置规定号的药筛中(筛下配有密合的接收容器),筛上加盖。按水平方向旋转振摇至少3分钟,并不时在垂直方向轻叩筛。取筛下的颗粒及粉末,称定重量,计算其所占比例(%)。

(2)双筛分法  取单剂量包装的5袋(瓶)或多剂量包装的1袋(瓶),称定重量,置该剂型或品种项下规定的上层(孔径大的)药筛中(下层的筛下配有密合的接收容器),保持水平状态过筛,左右往返,边筛动边拍打3分钟。取不能通过大孔径筛和能通过小孔径筛的颗粒及粉末,称定重量,计算其所占比例(%)。

6.2.2 2.机械筛分法

除另有规定外,取直径为200mm规定号的药筛和接收容器,称定重量,根据供试品的容积密度,称取供试品25~100g,置最上层(孔径最大的)药筛中(最下层的筛下配有密合的接收容器),筛上加盏。设定振动方式和振动频率,振动5分钟。取各药筛与接收容器,称定重量,根据筛分前后的重量差异计算各药筛上和接收容器内颗粒及粉末所占比例(%)。重复上述操作直至连续两次筛分后,各药筛上遗留颗粒及粉末重量的差异不超过前次遗留颗粒及粉末重量的5%或两次重量的差值不大于0.1g;若某一药筛上遗留颗粒及粉末的重量小于供试品取样量的5%,则该药筛连续两次的重量差异应不超过20%。

6.2.3 3.空气喷射筛分法

每次筛分时仅使用一个药筛。如需测定颗粒大小分布,应从孔径最小的药筛开始顺序进行。除另有规定外,取直径为200mm规定号的药筛,称定重量,根据供试品的容积密度,称取供试品25~100g,置药筛中,筛上加盖。设定压力,喷射5分钟。取药筛,称定重量,根据筛分前后的重量差异计算药筛上颗粒及粉末所占比例(%)。重复上述操作直至连续两次筛分后,药筛上遗留颗粒及粉末重量的差异不超过前次遗留颗粒及粉末重量的5%或两次重量的差值不大于0.1g;若药筛上遗留的颗粒及粉末重量小于供试品取样量的5%,则连续两次的重量差异应不超过20%。

6.3 第三法(光散射法)

色光束照射到颗粒供试品后即发生散射现象。由于散射光的能量分布与颗粒的大小有关,通过测量散射光的能量分布(散射角),依据米氏散射理论和弗朗霍夫近似理论,即可计算出颗粒的粒度分布。本法的测量范围可达0.02~3500μm。所用仪器为激光散射粒度分布仪。

6.3.1 1.对仪器的一般要求

散射仪  光源发出的激光强度应稳定,并且能够自动扣除电子背景和光学背景等的干扰

采用粒径分布特征值[d(0.1)、d(0.5)、d(0.9)]已知的“标准粒子”对仪器进行评价。通常用相对标准偏差(RSD)表征“标准粒子”的粒径分布范围,当RSD小于50%(最大粒径与最小粒径的比率约为10:1)时,平行测定5次,“标准粒子”的d(0.5)均值与其特征值的偏差应小于3%,平行测定的RSD不得过3%;“标准粒子”的d(0.1)和d(0.9)均值与其特征值的偏差均应小于5%,平行测定的RSD均不得过5%;对粒径小于10μm的“标准粒子”,测定的d(0.5)均值与其特征值的偏差应小于6%,平行测定的RSD不得过6%;d(0.1)和d(0.9)的均值与其特征值的偏差均应小于10%,平行测定的RSD均不得过10%。

6.3.2 2.测定法

根据供试品的性状溶解性能,选择湿法测定或干法测定;湿法测定用于测定混悬供试品或不溶于分散介质的供试品,干法测定用于测定水溶性或无合适分散介质的固态供试品。

6.3.2.1 湿法测定

湿法测定的检测下限通常为20nm。

根据供试品的特性,选择适宜的分散方法使供试品分散成稳定的混悬液;通常可采用物理分散的方法如超声、搅拌等,通过调节超声功率和搅拌速度,必要时可加入适量的化学分散剂表面活性剂,使分散体系成稳定状态,以保证供试品能够均匀稳定地通过检测窗口,得到准确的测定结果。

只有当分散体系的双电层电位(ζ电位)处于一定范围内,体系才处于稳定状态,因此,在制备供试品的分散体系时,应注意测量体系ζ电位,以保证分散体系的重现性。

湿法测量所需要的供试品量通常应达到检测器遮光度范围的8%~20%;最先进的激光粒度仪对遮光度的下限要求可低至0.2%。

6.3.2.2 干法测定

干法测定的检测下限通常为200nm。

通常采用密闭测量法,以减少供试品吸潮。选用的干法进样器及样品池需克服偏流效应,根据供试品分散的难易,调节分散器的气流压力,使不同大小的粒子以同样的速度均匀稳定地通过检测窗口,以得到准确的测定结果。

对于化学原料药,应采用喷射式分散器。在样品盘中先加入适量的金属小球,再加入供试品,调节振动进样速度、分散气压(通常为0~0.4MPa)和样品出口的狭缝宽度,以控制供试品的分散程度和通过检测器的供试品量。

干法测量所需要的供试品量通常应达到检测器遮光度范围的0.5%~5%。

6.4 【附注】

(1)仪器光学参数的设置与供试品的粒度分布有关。粒径大于10μm的微粒,对系统折光率和吸光度的影响较小;粒径小于10μm的微粒,对系统折光率和吸光度的影响较大。在对不同原料和制剂的粒度进行分析时,目前还没有成熟的理论用于指导对仪器光学参数的设置,应由实验比较决定,并采用标准粒子对仪器进行校准。

(2)对有色物质、乳化液和粒径小于10μm的物质进行粒度分布测量时,为了减少测量误差,应使用米氏理论计算结果,避免使用以弗朗霍夫近似理论为基础的计算公式。

(3)对粒径分布范围较宽的供试品进行测定时,不宜采用分段测量的方法,而应使用涵盖整个测量范围的单一量程检测器,以减少测量误差。

7 附录Ⅸ F X射线粉末衍射法

化合物的晶体,无论是单晶还是多晶,都有它自己特定的X射线衍射图。衍射极大(点或线)间的距离及其相对强度可用作结晶物质的定性定量分析。粉末衍射是用于结晶物质鉴别和纯度检查的常用技术,单晶衍射则主要用于分子量和晶体结构的测定。

固态物质分为结晶质和非晶质两大类。在晶体中,分子或原子在三维空间做周期性的有序排列,形成所谓晶格结构。非晶质有时又称为玻璃质或无定形物质,它们不具有晶格结构。

由于非晶质中分子的无序排列,散射的X射线相干性差,导致衍射图呈弥散状,这与结晶质具有特征的衍射图有明显区别。

有些化合物存在不止一种晶格结构。虽然在一定的温度和压力下,只有一种晶型在热力学上是稳定的,但由于从亚稳态转变为稳态的过程在通常情况下非常缓慢,因此,许多结晶质药物常存在多晶现象。

除同质多晶外,许多化合物还能形成溶剂化物,此时,溶剂分子参与晶体的晶格结构。与同质多晶体一样,溶剂化物也有它特征的衍射图。

一束准直的单色X射线照射旋转单晶或粉末晶体时,便发生衍射现象,发生衍射的条件应符合布拉格方程:

式中dhkl为面间距(hkl为晶面指数);

θ为掠射角。

用于X射线衍射的辐射源通常是以铜、钼、铁、铬等元素为阳极靶材料的真空管,其中以铜靶常用于有机化合物。一般多采用靶元素的Kα辐射,为保证辐射的单色性,必须采用适当的滤光片,用以去除Kβ辐射(如铜靶配镍滤光片)。辐射源的选择应根据供试品的吸收特性和不产生原子荧光为宜。当单色X射线照射单晶时,只有有限数目的晶面处于符合布拉格方程的位置。但当照射到大量的随机取向的微晶粒时,每族晶面即可产生一个衍射圆锥。衍射图可用感光胶片、辐射计、影像板或电感耦合探测器等面探测器记录。当使用胶片时,衍射角可由胶片上量取并经计算测定,衍射强度则由测微光度计读取。使用辐射计或面探测器时,衍射角、衍射强度及面间距均可由粉末衍射仪方便地读取。

存在多种影响衍射强度的因素。总的说来,被任何一族晶面衍射的X射线强度决定于结构因子和实验条件。前者包括;①晶胞中原子的位置;②原子的散射因子;③供试品对X射线的吸收和极化因子。后者包括:①入射X射线的波长及其强度;②供试品的结晶度、密度和体积;③实验温度;④记录强度数据的实验装置等。

试样的制备及有关实验技术  一般来说,晶粒的特定外形使试样在样品架上显示某种程度的优势取向。这种现象在针状晶和片状晶中显得尤为突出。试样的择优取向可影响各个晶面的相对衍射强度。用玛瑙研钵把供试品小心地研磨成细粉可有效地改善晶粒取向的随机性。

为能准确地测定衍射角,可用少量标准物质与试样混合,在衍射图上测定标准物质的各面间距离,并与文献值比较,以此对试样的衍射数据和衍射仪进行校正。

定量测定时采用标准曲线法。内标物质的选择应遵循与供试品的衍射图不发生任何重叠的原则,同时它们的密度与对X射线的吸收特性也应基本相同。由于基质对X射线有吸收,因此在制作标准曲线与测定供试品时,基质的取用量也应大致相同。通常,供试品的取用量与基质之比以不超过10%为宜。但由于本法的定量精度差,故通常仅用于少数特定的定量问题,如结晶度的测定和同质多晶混合物的相对量测定等。

结晶物质的鉴别可通过比较供试品与已知物质的衍射图完成。各衍射线的衍射角(2θ)、相对强度和面间距是进行鉴别的依据。供试品与参照品的衍射角偏差应在衍射仪的允差范围内,衍射线的相对强度偏差有时可达20%。进行鉴别时,有两种情况应特别留意,即:①研磨供试品的压力有时可造成晶型转变,从而导致衍射图变化;②有些同质多晶体的衍射图,彼此间的差别也许并不显著。遇此情况,作出结论时必须十分谨慎。

对于大多数有机结晶物质,衍射角(2θ)的记录范围通常取0°~40°;对于无机盐,如有必要可把记录范围适当放宽。

8 附录Ⅸ G 渗透压摩尔浓度测定法

生物膜,例如人体的细胞膜毛细血管壁,一般具有半透膜的性质,溶剂通过半透膜由低浓度溶液向高浓度溶液扩散的现象称为渗透,阻止渗透所需施加的压力,即为渗透压。在涉及溶质的扩散或通过生物膜的液体转运各种生物过程中,渗透压都起着极其重要的作用。因此,在制备注射剂、眼用液体制剂等药物制剂时,必须关注其渗透压。处方中添加了渗透压调节剂的制剂,均应控制其渗透压摩尔浓度。

静脉输液营养液、电解质或渗透利尿药(如甘露醇注射液)等制剂,应在药品说明书上标明其渗透压摩尔浓度,以便临床医生根据实际需要对所用制剂进行适当的处置(如稀释)。正常人体血液的渗透压摩尔浓度范围为285~310mOsmol/kg,0.9%氯化钠溶液或5%葡萄糖溶液的渗透压摩尔浓度与人体血液相当。

溶液的渗透压,依赖于溶液中溶质粒子的数量,是溶液的依数性之一,通常以渗透压摩尔浓度(Osmolality)来表示,它反映的是溶液中各种溶质对溶液渗透压贡献的总和

渗透压摩尔浓度的单位,通常以每千克溶剂中溶质的毫渗透压摩尔来表示,可按下列公式计算毫渗透压摩尔浓度(mOsmol/kg):

毫渗透压摩尔浓度(mOsmol/kg)=

式中,n为一个溶质分子溶解或解离时形成的粒子数。在理想溶液中,例如葡萄糖n=1,氯化钠或硫酸镁n=2,氯化钙n=3,枸橼酸钠n=4。

在生理范围及稀溶液中,其渗透压摩尔浓度与理想状态下的计算值偏差较小;随着溶液浓度的增加,与计算值比较,实际渗透压摩尔浓度下降。例如0.9%氯化钠注射液,按上式计算,毫渗透压摩尔浓度是2×1000×9/58.4=308mOsmol/kg,而实际上在此浓度时氯化钠溶液的,n稍小于2,其实际测得值是286mOsmol/kg;复杂混合物,如水解蛋白注射液的理论渗透压摩尔浓度不容易计算,因此通常采用实际测定值表示。

8.1 1.渗透压摩尔浓度的测定

通常采用测量溶液的冰点下降来间接测定其渗透压摩尔浓度。在理想的稀溶液中,冰点下降符合△Tf=Kf·m的关系,式中,△Tf为冰点下降,Kf为冰点下降常数(当水为溶剂时为1.86),m为重量摩尔浓度。而渗透压符合P0=K0·m的关系,式中,P0为渗透压,K0为渗透压常数,m为溶液的重量摩尔浓度。由于两式中的浓度等同,故可以用冰点下降法测定溶液的渗透压摩尔浓度。

8.1.1 仪器

采用冰点下降的原理设计的渗透压摩尔浓度测定仪通常由制冷系统、用来测定电流或电位差的热敏探头和振荡器(或金属探针)组成。测定时将测定探头浸入供试溶液的中心,并降至仪器的冷却槽中。启动制冷系统,当供试溶液的温度降至凝固点以下时,仪器采用振荡器(或金属探针)诱导溶液结冰,自动记录冰点下降的温度。仪器显示的测定值可以是冰点下降的温度,也可以是渗透压摩尔浓度。

8.1.2 标准溶液的制备

取基准氯化钠试剂,于500~650℃干燥40~50分钟,置干燥器(硅胶)中放冷至室温。根据需要,按表中所列数据精密称取适量,溶于1kg水中,摇匀,即得。

表 渗透压摩尔浓度测定仪校正用标准溶液

每1kg水中氯化

钠的重量/g

毫渗透压摩尔浓度/mOsmol·kg-1

冰点下降

温度△T/℃

3.087

6.260

9.463

12.684

15.916

19.147

22.380

100

200

300

400

500

600

700

0.186

0.372

0.558

0.744

0.930

1.116

1.302

8.1.3 供试品溶液

供试品如为液体,通常可直接测定;如其渗透压摩尔浓度大于700mOsmol/kg或为浓溶液,可用适宜的溶剂(通常为注射用水)稀释至表中测定范围内;如为固体(如注射用无菌粉末),可采用药品标签或说明书中的规定溶剂溶解并稀释至表中测定范围内。需特别注意的是,溶液经稀释后,粒子间的相互作用与原溶液有所不同,一般不能简单地将稀释后的测定值乘以稀释倍数来计算原溶液的渗透压摩尔浓度。例如,甘露醇注射液、氨基酸注射液等高渗溶液和注射用无菌粉末可用适宜的溶剂(如注射用水)溶解、稀释后测定,并在各品种项下规定具体的溶解或稀释方法。

8.1.4 测定法

按仪器说明书操作,首先取适量新沸放冷的水调节仪器零点,然后由表中选择两种标准溶液(供试品溶液的渗透压摩尔浓度应介于两者之间)校正仪器,再测定供试品溶液的渗透压摩尔浓度或冰点下降值。

8.2 2.渗透压摩尔浓度比的测定

供试品溶液与0.9%(g/ml)氯化钠标准溶液的渗透压摩尔浓度比率称为渗透压摩尔浓度比。用渗透压摩尔浓度测定仪分别测定供试品溶液与0.9% (g/ml)氯化钠标准溶液的渗透压摩尔浓度OT与OS,方法同渗透压摩尔浓度测定法,并用下列公式计算渗透压摩尔浓度比:

渗透压摩尔浓度比=OT/OS

渗透压摩尔浓度比测定用标准溶液的制备  精密称取经500~650℃干燥40~50分钟并置干燥器(硅胶)中放冷的基准氯化钠0.900g,加水使溶解并稀释至100ml,摇匀,即得。

9 附录Ⅸ H 可见异物检查法

可见异物系指存在于注射剂、眼用液体制剂中,在规定条件下目视可以观测到的不溶性物质,其粒径或长度通常大于50μm。

注射剂、眼用液体制剂应在符合药品生产质量管理规范GMP)的条件下生产,产品在出厂前应采用适宜的方法逐一检查并同时剔除不合格产品。临用前,也在自然光下目视检查(避免阳光直射),如有可见异物,不得使用。

可见异物检查法有灯检法和光散射法。一般常用灯检法,也可采用光散射法。灯检法不适用的品种,如用深色透明容器包装或液体色泽较深(一般深于各标准比色液7号)的品种可选用光散射法。

实验室检测时应避免引入可见异物。当制备注射用无菌粉末和无菌原料药供试品溶液时,或供试品溶液的容器不适于检测(如不透明、不规则形状容器等),需转移至适宜容器中时,均应在100级的洁净环境(如层流净化台)中进行。

用于本试验的供试品,必须按规定随机抽样

9.1 第一法(灯检法)

灯检法应在暗室中进行。检查装置  如下图所示。

图 灯检法示意

A.带有遮光板的日光灯光源(光照度可在1000~4000lx范围内调节);

B.不反光的黑色背景;

C.不反光的白色背景和底部(供检查有色异物);

D.反光的白色背景(指遮光板内侧)。

9.1.1 检查人员条件

远距离和近距离视力测验,均应为4.9或4.9以上(矫正后视力应为5.0或5.0以上);应无色盲

9.1.2 检查法

溶液型、乳状液及混悬型制剂  除另有规定外,取供试品20支(瓶),除去容器标签,擦净容器外壁,必要时将药液转移至洁净透明的适宜容器内;置供试品于遮光板边缘处,在明视距离(指供试品至人眼的清晰观测距离,通常为25cm),分别在黑色和白色背景下,手持供试品颈部轻轻旋转和翻转容器使药液中可能存在的可见异物悬浮(但应避免产生气泡),轻轻翻摇后即用目检视,重复3次,总时限为20秒。供试品装量每支(瓶)在10ml及10ml以下的,每次检查可手持2支(瓶)。

注射用无菌粉末  除另有规定外,取供试品5支(瓶),用适宜的溶剂及适当的方法使药粉全部溶解后,按上述方法检查。配带有专用溶剂的注射用无菌粉末,应先将专用溶剂按溶液型制剂检查合格后,再用以溶解注射用无菌粉末。

无菌原料药  除另有规定外,按抽样要求称取各品种制剂项下的最大规格量5份,分别置洁净透明的适宜容器内,用适宜的溶剂及适当的方法使药物全部溶解后,按上述方法检查。

注射用无菌粉末及无菌原料药所选用的适宜溶剂应无可见异物。如为水溶性药物,一般使用不溶性微粒检查用水(参见附录Ⅸ C不溶性微粒检查法)进行溶解制备;如为其他溶剂,则应在各品种项下中作出规定。溶剂量应确保药物溶解完全并便于观察。

注射用无菌粉末及无菌原料药溶解所用的适当方法应与其制剂使用说明中注明的临床使用前处理的方式相同。如除振摇外还需其他辅助条件,则应在各品种项下中作出规定。用无色透明容器包装的无色供试品溶液,检查时被观察样品所在处的光照度应为1000~1500lx,用透明塑料容器包装或用棕色透明容器包装的供试品溶液或有色供试品溶液,检查时被观察样品所在处的光照度应为2000~3000lx;混悬型供试品或乳状液,检查时被观察样品所在处的光照度应增加至约4000lx。

9.1.3 结果判定

各类注射剂、眼用液体制剂  在静置一定时间后轻轻旋转时均不得检出烟雾状微粒柱,且不得检出金属屑、玻璃屑、长度或最大粒径超过2mm的纤维和块状物等明显可见异物。微细可见异物(如点状物、2mm以下的短纤维和块状物等)如有检出,除另有规定外,应分别符合下列规定:

溶液型静脉用注射液、注射用浓溶液  20支(瓶)检查的供试品中,均不得检出明显可见异物。如检出微细可见异物的供试品仅有1支(瓶),应另取20支(瓶)同法复试,均不得检出。

溶液型非静脉用注射液  被检查的20支(瓶)供试品中,均不得检出明显可见异物。如检出微细可见异物,应另取20支(瓶)同法复试,初、复试的供试品中,检出微细可见异物的供试品不得超过2支(瓶)。

溶液型滴眼剂  被检查的20支(瓶)供试品中,均不得检出明显可见异物。如检出微细可见异物,应另取20支(瓶)同法复试,初、复试的供试品中,检出微细可见异物的供试品不得超过3支(瓶)。

混悬型、乳状液型注射液及滴眼剂  被检查的20支(瓶)供试品中,均不得检出金属屑、玻璃屑、色块、纤维等明显可见异物。

临用前配制的溶液型和混悬型滴眼剂,除另有规定外,应符合相应的可见异物规定。

注射用无菌粉末  被检查的5支(瓶)供试品中,均不得检出明显可见异物。如检出微细可见异物,每支(瓶)供试品中检出微细可见异物的数量应符合下表的规定;如有1支(瓶)不符合规定,另取10支(瓶)同法复试,均应符合规定。

类别

可见异物限度

化学药

≤4个

生化药、抗生素

≥2g

≤10个

中药

<2g

≤8个

配带有专用溶剂的注射用无菌粉末,专用溶剂应符合相应的溶液型注射液的规定。

无菌原料药  5份检查的供试品中,均不得检出明显可见异物。如检出微细可见异物,每份供试品中检出微细可见异物的数量应符合下表的规定;如有1份不符合规定,另取10份同法复试,均应符合规定。

类别

可见异物限度

化学药

≤2个

生化药、抗生素药和中药

≤5个

既可静脉用也可非静脉用的注射剂应执行静脉用注射剂的标准。

9.2 第二法(光散射法)

当一束单色激光照射溶液时,溶液中存在的不溶性物质使入射光发生散射,散射的能量与不溶性物质的大小有关。本方法通过对溶液中不溶性物质引起的光散射能量的测量,并与规定的阈值比较,以检查可见异物。

不溶性物质的光散射能量可通过被采集的图像进行分析。设不溶性物质的光散射能量为E,经过光电信号转换,即可用摄像机采集到一个锥体高度为H,直径为D的相应立体图像。散射能量E为D和H的一个单调函数,即E=f(D,H)。同时,假设不溶性物质的光散射强度为q,摄像曝光时间为T,则又有E=g(q,T)。由此可以得出图像中的D与q、T之间的关系为D=w(q,T),也为一个单调函数关系。在测定图像中的D值后,即可根据函数曲线计算出不溶性物质的光散射能量。

9.2.1 仪器装置和检测原理

仪器由旋瓶装置、激光光源、图像采集器、数据处理系统和终端显示系统组成,并配有自动上瓶和下瓶装置。

供试品通过上瓶装置被送至旋瓶装置,旋瓶装置应能使供试品沿垂直中轴线高速旋转一定时间后迅速停止,同时激光光源发出的均匀激光束照射在供试品上;当药液涡流基本消失,瓶内药液因惯性继续旋转,图像采集器在特定角度对旋转药液中悬浮的不溶性物质引起的散射光能量进行连续摄像,采集图像不少于75幅;数据处理系统对采集的序列图像进行处理,然后根据预先设定的阈值自动判定超过一定大小的不溶性物质的有无,或在终端显示器上显示图像供人工判定,同时记录检测结果,指令下瓶装置自动分检合格与不合格供试品。仪器校准  仪器应具备自动校准功能,在检测供试品前须采用标准粒子进行校准。

除另有规定外,分别用粒径为40μm和60μm的标准粒子对仪器进行标定。根据标定结果得到曲线方程并计算出与粒径50μm相对应的检测像素值。

当把检测像素参数设定为与粒径50μm相对应的数值时,对60μm的标准粒子溶液测定3次,应均能检出。

9.2.2 检查法

溶液型注射液  除另有规定外,取供试品20支(瓶),除去不透明标签,擦净容器外壁,置仪器上瓶装置上,根据仪器的使用说明书选择适宜的测定参数,启动仪器,将供试品检测3次并记录检测结果。凡仪器判定有1次不合格者,须用灯检法作进一步确认。用深色透明容器包装或液体色泽较深等灯检法检查困难的品种不用灯检法确认。

注射用无菌粉末  除另有规定外,取供试品5支(瓶),用适宜的溶剂及适当的方法使药物全部溶解后,按上述方法检查。

无菌原料药  除另有规定外,称取各品种制剂项下的最大规格量5份,分别置洁净透明的专用玻璃容器内,用适宜的溶剂及适当的方法使药物全部溶解后,按上述方法检查。设置检测参数时,一般情况下取样视窗的左右边线和底线应与瓶体重合,上边线与液面的弯月面成切线;旋转时间的设置应能使液面漩涡到底,以能带动固体物质悬浮并消除气泡;静置时间的设置应尽可能短,但不能短于液面漩涡消失的时间,以避免气泡干扰并保证摄像启动时固体物质仍在转动;嵌瓶松紧度参数与瓶底直径(mm)基本相同,可根据安瓿质量调整,如瓶体不平正,转动时瓶体摇动幅度较大,气泡易产生,则应将嵌瓶松紧度调大以减小摇动,但同时应延长旋转时间,使漩涡仍能到底。

9.2.3 结果判定

同灯检法。

10 附录Ⅸ J 质谱法

质谱法是使待测化合物产生气态离子,再按质荷比(m/z)将离子分离、检测的分析方法,检测限可达10-15~10-12 mol数量级。质谱法可提供分子质量和结构的信息,定量测定可采用内标法或外标法。

质谱仪的主要组成如图所示。在由泵维持的10-3~10-6 Pa真空状态下,离子源产生的各种正离子(或负离子),经加速,进入质量分析器分离,再由检测器检测。计算机系统用于控制仪器,记录、处理并储存数据,当配有标准谱库软件时,计算机系统可以将测得的质谱与标准谱库中图谱比较,获得可能化合物的组成和结构信息。

图  质谱仪的主要组成

10.1 一、进样系统

样品导入应不影响质谱仪的真空度。进样方式的选择取决于样品的性质、纯度及所采用的离子化方式。

10.1.1 1.直接进样

室温常压下,气态或液态化合物的中性分子通过可控漏孔系统,进入离子源。吸附在固体上或溶解在液体中的挥发性待测化合物可采用顶空分析法提取和富集,程序升温解吸附,再经毛细管导入质谱仪。

挥发性固体样品可置于进样杆顶端小坩埚内,在接近离子源的高真空状态下加热、气化。采用解吸离子化技术,可以使热不稳定的、难挥发的样品在气化的同时离子化。

多种分离技术已实现了与质谱的联用。经分离后的各种待测成分,可以通过适当的接口导入质谱仪分析。

10.1.2 2.气相色谱-质谱联用(GC-MS

气相色谱分离后的流出物呈气态,待测化合物的分子大小也适宜于质谱分析。在使用毛细管气相色谱柱及高容量质谱真空泵的情况下,色谱流出物可直接引入质谱仪。

10.1.3 3.液相色谱-质谱联用(LC-MS)

使待测化合物从色谱流出物中分离、形成适合于质谱分析的气态分子或离子需要特殊的接口。粒子束(PBI)、移动带(MBD、大气压离子化(API)是可用的液相色谱-质谱联用接口。为减少污染,避免化学噪声电离抑制,流动相中所含的缓冲盐或添加剂通常应具有挥发性,且用量也有一定的限制。

(1)粒子束接口  液相色谱的流出物在去溶剂室雾化、脱溶剂后,仅待测化合物的中性分子被引入质谱离子源。粒子束接口适用于分子量小于1000的弱极性化合物的分析,测得的质谱可以由电子轰击离子化或化学离子化产生。电子轰击离子化质谱含有丰富的结构信息。

(2)移动带接口  流速为0.5~1.5ml/min的液相色谱流出物,均匀地滴加在移动带上,蒸发、除去溶剂后,待测化合物被引入质谱离子源。移动带接口不适宜于极性大或热不稳定化合物的分析,测得的质谱可以由电子轰击离子化或化学离子化或快原子轰击离子化产生。

(3)大气压离子化接口  电喷雾离子化、大气压化学离子化是目前液相色谱-质谱联用广泛采用的大气压离子化接口技术。由于兼具离子化功能,这些接口又称为大气压离子源,将在离子化方式中介绍。

10.1.4 4.超临界流体色谱-质谱联用(SFC-MS)

目前,超临界流体色谱-质谱联用主要采用大气压化学离子化或电喷雾离子化接口,色谱流出物通过一个位于柱子和离子源之间的加热限流器转变为气态,进入质谱仪分析。5.毛细管电泳-质谱联用(CE-MS)

几乎所有的毛细管电泳操作模式均可与质谱联用。选择接口时,应注意毛细管电泳的低流速特点并使用挥发性缓冲液。电喷雾离子化是毛细管电泳与质谱联用最常用的接口技术。

10.2 二、离子化方式

根据待测化合物的性质及拟获取的信息类型,可以选择不同的离子化方式,使待测化合物生成气态正离子或负离子,进一步质谱分析。某些情况下,进样和离子化在同一过程中完成,很难明确区分。

10.2.1 1.电子轰击离子化(EI)

处于离子源的气态待测化合物分子,受到一束能量(通常是70eV)大于其电离能的电子轰击而离子化。质谱中往往含有待测化合物的分子离子及具有待测化合物结构特征的碎片离子。电子轰击离子化适用于热稳定的、易挥发化合物的离子化,是气相色谱-质谱联用最常用的离子化方式。当采用粒子束或移动带等接口时,电子轰击离子化也可用于液相色谱-质谱联用。

10.2.2 2.化学离子化(Cl

离子源中的试剂气分子(如甲烷异丁烷和氨气)受高能电子轰击而离子化,进一步发生离子-分子反应,产生稳定的试剂气离子,再使待测化合物离子化。化学离子化可产生待测化合物(M)的(M+H)+或(M-H)-特征离子或待测化合物与试剂气分子产生的加合离子。与电子轰击离子化质谱相比,化学离子化质谱中碎片离子较少,适宜于采用电子轰击离子化无法得到分子质量信息的化合物分析。

10.2.3 3.快原子轰击(FAB)或快离子轰击离子化(LSIMS)

高能中性原子(如氩气)或高能铯离子,使置于金属表面、分散于惰性黏稠基质(如甘油)中的待测化合物离子化,产生(M+H)+或(M-H)-特征离子或待测化合物与基质分子的加合离子。快原子轰击或快离子轰击离子化非常适合于各种极性的、热不稳定化合物的分子质量测定及结构表征,广泛应用于分子量高达10000的肽、抗生素、核苷酸、脂质、有机金属化合物及表面活性剂的分析。

快原子轰击(FAB)或快离子轰击离子化用于液相色谱-质谱联用时,需在色谱流动相中添加1%~10%的甘油,且必须保持很低流速(1~10μl/min)。

10.2.4 4.基质辅助激光解吸离子化( MALDI)

将溶于适当基质中的供试品涂布于金属靶上,用高强度的紫外或红外脉冲激光照射,使待测化合物离子化。基质辅助激光解吸离子化主要用于分子量在100000以上的生物大分子分析,适宜与飞行时间分析器结合使用。

10.2.5 5.电喷雾离子化(ESI)

离子化在大气压下进行。待测溶液(如液相色谱流出物)通过一终端加有几千伏高压的毛细管进入离子源,气体辅助雾化,产生的微小液滴去溶剂,形成单电荷或多电荷的气态离子。这些离子再经逐步减压区域,从大气压状态传送到质谱仪的高真空中。电喷雾离子化可在1μl/min~1ml/min流速下进行,适合极性化合物和分子量高达100000的生物大分子研究,是液相色谱-质谱联用、毛细管电泳-质谱联用最成功的接口技术。

反相高效液相色谱常用的溶剂,如水、甲醇乙腈等都十分有利于电喷雾离子化,但纯水或纯有机溶剂作为流动相不利于去溶剂或形成离子;在高流速情况下,流动相含有少量水或至少20%~30%的有机溶剂有助于获得较高的分析灵敏度

10.2.6 6.大气压化学离子化(APCI)

原理与化学离子化相同,但离子化在大气压下进行。流动相在热及氮气流的作用下雾化成气态,经由带有几千伏高压的放电电极时离子化,产生的试剂气离子与待测化合物分子发生离子-分子反应,形成单电荷离子。正离子通常是

(M+H)+,负离子则是(M-H)-。大气压化学离子化能够在流速高达2ml/min下进行,是液相色谱-质谱联用的重要接口之一。

电喷雾离子源与大气压化学离子源常共用一个真空接口,很容易相互更换。选择电喷雾离子化还是大气压化学离子化,分析者不仅要考虑溶液(如液相色谱流动相)的性质、组成和流速,待测化合物的化学性质也至关重要。电喷雾离子化更适合于在溶液中容易电离的极性化合物,容易形成多电荷离子的化合物和生物大分子(如蛋白质多肽等)可以采用电喷雾离子源。大气压化学离子化常用于分析分子量小于1500的小分子或弱极性化合物(如甾醇类和类胡萝卜素等),主要产生的是(M+H)+或(M-H)-离子,很少有碎片离子。

相对而言,电喷雾离子化更适合于热不稳定的样品,而大气压化学离子源易与正相液相色谱联用。许多中性化合物同时适合于电喷雾离子化及大气压化学离子化,且均具有相当高的灵敏度。无论是电喷雾离子化还是大气压化学离子化,选择正离子(Positive ion)或负离子(Negative ion)电离模式,主要取决于待测化合物自身性质。

10.3 三、质量分析器

在高真空状态下,质量分析器将离子按质荷比分离。质量范围、分辨率是质量分析器的两个主要性能指标。质量范围指质谱仪所能测定的质荷比的范围,分辨率表示质谱仪分辨相邻的、质量差异很小的峰的能力。常用的质量分析器有扇形磁场分析器、四极杆分析器、离子阱分析器、飞行时间分析器和傅里叶变换分析器。

10.3.1 1.扇形磁场分析器

离子源中产生的离子经加速电压(V)加速,聚焦进入扇形磁场(磁场强度B)。在磁场的作用下,不同质荷比的离子发生偏转,按各自的曲率半径(r)运动:

m/z=B2r2/2V

改变磁场强度,可以使不同质荷比的离子具有相同的运动曲率半径(r),进而通过狭缝出口,达到检测器。

扇形磁场分析器可以检测分子量高达15000的单电荷离子。当与静电场分析器结合、构成双聚焦扇形磁场分析器时,分辨率可达到105

10.3.2 2.四极杆分析器

分析器由四根平行排列的金属杆状电极组成。直流电压(DC)和射频电压(RF)作用于电极上,形成了高频振荡电场(四极场)。在特定的直流电压和射频电压条件下,仅一定质荷比的离子可以稳定地穿过四极场,到达检测器。改变直流电压和射频电压大小,但维持它们的比值恒定,可以实现质谱扫描。

四极杆分析器可检测的分子量上限通常达4000,分辨率约为103

10.3.3 3.离子阱分析器

四极离子阱(QIT)由两个端盖电极和位于它们之间的环电极组成。端盖电极处在地电位,而环电极上施加射频电压(RF),以形成三维四极场。选择适当的射频电压,四极场可以储存质荷比大于某特定值的所有离子。采用“质量选择不稳定性”模式,提高射频电压值,可以将离子按质量从高到低依次射出离子阱。挥发性待测化合物的离子化和质量分析可以在同一四极场内完成。通过设定时间序列,单个四极离子阱可以实现多级质谱(MSn)的功能。

线性离子阱(LIT)是二维四极离子阱,结构上等同于四极质量分析器,但操作模式与三维离子阱相似。四极线性离子阱具有更好的离子储存效率和储存容量,可改善的离子喷射效率及更快的扫描速度和较高的检测灵敏度。

由电喷雾离子化或基质辅助激光解吸离子化产生的生物大分子离子,可以借助离子引导等方式,进入离子阱分析器分析。离子阱分析器与四极杆分析器具有相近的质量上限,分辨率为103~104

10.3.4 4.飞行时间分析器( TOF)

具有相同动能、不同质量的离子,因飞行速度不同而实现分离。当飞行距离一定时,离子飞行需要的时间与质荷比的平方根成正比,质量小的离子在较短时间到达检测器。为了测定飞行时间,将离子以不连续的组引入质量分析器,以明确起始飞行时间。离子组可以由脉冲式离子化(如基质辅助激光解吸离子化)产生,也可通过门控系统将连续产生的离子流在给定时间引入飞行管。

现代飞行时间分析器具有质量分析范围宽(分子量上限约15000)、离子传输效率高(尤其是谱图获取速度快)、检测能力多重、仪器设计和操作简便、质量分辨率高(约为104)的特点,已成为生物大分子分析的主流技术。

10.3.5 5.傅里叶变换分析器( FTMS)

离子在一定强度的磁场中作回旋运动,运行轨道随着共振交变电场而改变。当交变电场的频率和离子回旋频率相同时,离子被稳定加速,轨道半径越来越大,动能不断增加。关闭交变电场,轨道上的离子在电极上产生交变的像电流。利用计算机进行傅里叶变换,将像电流信号转换为频谱信号,获得质谱。

待测化合物的离子化和质量分析可以在同一分析器内完成。傅里叶变换分析器适用于分子量高于10000的化合物,分辨率可高达106,质荷比测定精确到千分之一。

10.4 四、串联质谱法

串联质谱法(MS-MS)是时间上或空间上两级以上质量分析的结合。空间串联由两个以上的质量分析器构成,如三级四极杆串联质谱,其中第一级质量分析器(MS1)选取的前体离子,进入碰撞室活化、裂解,产生的碎片离子被第二级质量分析器(MS2)分析、获得MS-MS谱。在时间串联质谱中,前体离子的选取、裂解及碎片离子的分析在同一质量分析器(如四极离子阱分析器)中完成。前体离子的裂解可以通过亚稳裂解、碰撞诱导解离、表面诱导解离、激光诱导解离等方式实现。

串联质谱法并不局限于两级质谱分析,多级质谱实验常表示为MSn。实际应用中,串联质谱法可以通过产物离子扫描(Product-ion scan)、前体离子扫描(Precursor-ion scan)、中性丢失扫描(Neutral-loss scan)及选择反应检测(Selected-reaction monitoring,SRM)等方式获取数据,但值得注意的是时间串联质谱仪不能进行前体离子扫描和中性丢失扫描。

串联质谱技术在未知化合物的结构解析、复杂混合物中待测化合物的鉴定、碎片裂解途径的阐明以及低浓度生物样品的定量分析方面具有很大优势。在药物领域的应用也很多,如通过产物离子扫描,可以获得药物、杂质或污染物的前体离子的结构信息,有助于未知化合物的鉴定;产物离子扫描还可用于肽和蛋白质碎片的氨基酸序列检测。当质谱与气相色谱或液相色谱联用时,若色谱仪未能将化合物完全分离,串联质谱法可以通过选择性的测定某组分的特征性前体离子,获取该组分的结构和量的信息,而不会受到共存组分的干扰。

在药物代谢研究中,串联质谱技术可用于寻找具有相同结构特征的代谢物分子。由于代谢物可能包含作为中性碎片丢失的相同基团(如羧酸类均易丢失中性二氧化碳分子),采用中性丢失扫描可以发现所有可能的代谢物。若丢失的相同碎片是离子,则前体离子扫描方式可帮助找到所有丢失该碎片离子的前体离子。

选择反应离子检测(SRM)可消除生物基质对低浓度待测化合物定量分析的干扰。如药物代谢动力学研究中,待测药物的某离子信号可能被基质中其他化合物的离子信号掩盖,通过MS1和MS2选择性的检测特征的前体离子和产物离子,可实现待测物的专属、灵敏分析。

10.5 五、信号检测和数据获取

来自质量分析器的离子束经检测器转化为电信号、放大,再由数据处理系统储存并显示为质谱图。通过测定待测化合物离子的质荷比和相对丰度,质谱法可以实现对供试品的定性和定量分析。

中性分子丢失或捕获一个电子,即形成了一个与母体分子质量相同的分子离子。通过高分辨质谱仪(分辨率>104)或使用参照化合物峰匹配测定,可以获得待测化合物的分子组成和分子质量信息。分子离子断裂不同的键产生各种碎片离子,裂解模式(或碎片模式)与分子结构有关。通过测定碎片离子的质量及其相对丰度,获取裂解特征,可以推测或确证待测化合物的分子结构。

通过测定某一特定离子或多个离子的丰度,并与已知标准物质的响应比较,质谱法可以实现高专属性的定量分析。外标法和内标法是质谱常用的定量方法,内标法具有更高的准确度。质谱法所用的内标化合物可以是待测化合物的结构类似物或稳定同位素标记物。前者的优点是费用较低,但使用稳定同位素(如2H、13C、15N)标记物可以获得更高的分析精密度和准确度,尤其当采用FAB或LC-MS离子化技术(如电喷雾离子化)时。稳定同位素标记物是指标记物在样品制备、分离、离子化的过程中,始终保留同位素标记。

相对于全扫描技术,选择性离子检测(SIM)用于定量分析更具优势。SIM技术使质谱仪将更多的时间用于检测选定质荷比离子的离子流,因而提高了分析灵敏度。选择反应检测(SRM)是复杂混合物中微量待测化合物准确定量的重要技术手段。当同时检测两对及以上的前体离子一产物离子时,选择反应检测(SRM)又称为多反应监测(MRM),可以同时、专属、灵敏地定量测定供试品中多个组分。

11 附录Ⅸ K 核磁共振波谱法

核磁共振(NMR)波谱是一种基于特定原子核在外磁场中吸收了与其裂分能级间能量差相对应的射频场能量而产生共振现象的分析方法。核磁共振波谱通过化学位移值、谱峰多重性、偶合常数值、谱峰相对强度和在各种二维谱及多维谱中呈现的相关峰,提供分子中原子的连接方式、空间的相对取向等定性的结构信息。核磁共振定量分析以结构分析为基础,在进行定量分析之前,首先对化合物的分子结构进行鉴定,再利用分子特定基团的质子数与相应谱峰的峰面积之间的关系进行定量测定。

带正电荷的原子核在作自旋运动时,可产生磁场和角动量,其磁性用核磁矩μ表示,角动量P的大小与自旋量子数I有关(核的质量数为奇数,I为半整数;核的质量数为偶数,I为整数或0),其空间取向是量子化的;μ也是一个矢量,方向与P的方向重合,空间取向也是量子化的,取决于磁量子数m的取值(m=I,I-1,……-I,共有2I+1个数值)。对于1H、13C等I=1/2的核,只有两种取向,对应于两个不同的能量状态,粒子通过吸收或发射相应的能量在两个能级间跃迁。

当自旋量子数I≠0的磁核处于一个均匀的外磁场H0中时,磁核因受到磁场的作用力而围绕着外磁场方向作旋转运动,同时仍然保持本身的自旋。这种运动方式称为拉摩进动。原子核的进动频率由下式决定:

ω0=γH0

其中γ为旋磁比,是原子核的基本属性之一。不同原子核的γ值不同,其值越大,核的磁性越强,在核磁共振中越容易被检测。如果提供一个射频场,其频率(ν)满足:

△E=hν=μH0/I

其中h为普朗克常数,则:

v=ω0/2π=γH0/2π

即射频场的频率正好等于在磁场H0中的核进动频率,那么核就能吸收这一射频场的能量,导致在两个能级间跃迁,产生核磁共振现象。

核磁共振波谱是一专属性较好但灵敏度较低的分析技术。低灵敏度的主要原因是基态和激发态的能量差非常小,通常每十万个粒子中两个能级间只差几个粒子(当外磁场强度约为2T时)。

11.1 核磁共振波谱仪

常见的有两类核磁共振波谱仪:经典的连续波(CW)波谱仪和现代的脉冲傅里叶变换(PFT)波谱仪,目前使用的绝大多数为后者。其组成主要包含超导磁体、射频脉冲发射系统、核磁信号接收系统和用于数据采集、储存、处理以及谱仪控制的计算机系统(如图)。

图PFT核磁共振波谱仪的主要组成

在脉冲核磁共振波谱仪上,一个覆盖所有共振核的射频能量的脉冲将同时激发所有的核,当被激发的核回到低能态时产生一个自由感应衰减(FID)信号,它包含所有的时间域信息,经模数转换后通过计算机进行傅里叶变换得到频(率)谱。

实验中按照仪器操作规程设置谱仪参数,如脉冲倾倒角和与之对应的脉冲强度、脉冲间隔时间、数据采样点(分辨率)、采样时间等。采集足够的FIDs,由计算机进行数据转换,调整相位使尽可能得到纯的吸收峰,用参照物校正化学位移值,用输出设备输出谱图。

11.2 核磁共振谱

核磁共振信号(峰)可提供四个重要参数:化学位移值、谱峰多重性、偶合常数值和谱峰相对强度。处于不同分子环境中的同类原子核具有不同的共振频率,这是由于作用于特定核的有效磁场由两部分构成:由仪器提供的特定外磁场以及由核外电子云流产生的磁场(后者一般与外磁场的方向相反,这种现象称为“屏蔽”)。处于不同化学环境中的原子核,由于屏蔽作用不同而产生的共振条件差异很小,难以精确测定其绝对值,实际操作时采用一参照物作为基准,精确测定样品和参照物的共振频率差。在核磁共振波谱中,一个信号的位置可描述为它与另一参照物信号的偏离程度,称为化学位移。

共振频率与外磁场强度H0成正比,磁场强度不同,同一化学环境中的核共振频率不同。为了解决这个问题,采用位移常数δ来表示化学位移:

式中νs为样品中磁核的共振频率;

νr为参照物中磁核的共振频率;

νo为仪器的输出频率,MHz;

δr为参照物的化学位移值。

因此也可用氘代溶剂中残留的质子信号作为化学位移参考值

常用的化学位移参照物是四甲基硅烷(TMS),其优点是化学惰性;单峰;信号处在高场,与绝大部分样品信号之间不会互相重叠干扰;沸点很低(27℃),容易去除,有利于样品回收。而对于水溶性样品,常用3-三甲基硅基丙酸钠-d4(TSP)或2,2-二甲基-2-硅戊基-5-磺酸钠(DSS),其化学位移值也非常接近于零。DSS的缺点是其三个亚甲基质子有时会干扰被测样品信号,适于用作外参考。

化学位移仅表示了磁核的电子环境,即核外电子云对核产生的屏蔽作用,但未涉及同一分子中磁核间的相互作用。这种磁核间的相互作用很小,对化学位移没有影响,但对谱峰的形状有着重要影响。这种磁核之间的相互干扰称为自旋-自旋偶合,由自旋偶合产生的多重谱峰现象称为自旋裂分,裂分间距(赫兹)称为偶合常数J,偶合常数与外磁场强度无关。偶合也可发生在氢核与其他核(I≠0)之间,如19F、13C和31P等。

核磁共振信号的另一个特征是它的强度。在合适的实验条件下(见“测定方法”),谱峰面积或强度正比于引起此信号的质子数,因此可用于测定同一样品中不同质子或其他核的相对比例,以及在加入内标后进行核磁共振定量分析。

11.3 测定方法

在熟悉核磁共振理论的基础上,应多了解样品的性质,并严格遵守操作规程,正确操作仪器。不正确的样品制备、谱仪调整及参数设置会导致谱图数据的分辨率和灵敏度降低,甚至给出假峰和错误数据。

通常应用最多的是1H(质子)核磁共振波谱,其他还包括19F、31P、13C核磁共振波谱以及各种二维谱等。测定前,一般须先将供试品制成合适的溶液。

11.3.1 溶剂选择

合适的溶剂除了对样品有较好的溶解度外,其残留的信号峰应不干扰所分析样品的信号峰。氘代溶剂同时提供异核锁信号。应尽可能使用高氘代度、高纯度的溶剂,并注意氘原子会对其他原子信号产生裂分。常用的核磁共振波谱测定用氘代溶剂及其残留质子信号的化学位移见下表。

表  氢谱测定中氘代溶剂及其残留质子信号的化学位移

溶剂名称

分子式

残留质子信号δ(ppm)

可能残留的水峰δ(ppm)*

氘代三氯甲烷

代甲

氘代丙酮

氘代二甲基亚砜

氘代乙腈

氘代苯

重水

氘代二氧六环

氘代乙酸

氘代三氟乙酸

氘代吡啶

氘代N,N-二甲基甲酰胺

CDCl3

CD3OD

(CD32CO

DMSO-d6

CD3CN

C6D6

D2O

二氧六环-d8

CD3CO2D

CF3CO2D

C5D5N

DMF-d7

7.26

3.31

2.05

2.50

1.94

7.16

/

3.55

2.05, 8.5*

12.5*

7.18, 7.55, 8.70

2.77, 2.93, 8.05

1.56

4.87

2.84

3.33

2.13

/

4.79

/

/

/

4.80

/

*活泼质子的化学位移值是可变的,取决于温度和溶质的变化。适用于氢谱(1H NMR)的溶剂同样也适用于氟谱(19FNMR),常见的有CDCl3、CD3OD、D2O、DMSO-d6、DMF-d7、酸和碱等,通常不含氟的溶剂均可使用。同时应注意含氟样品中氟原子对其他核的J-偶合。

11.3.2 样品制备

按各品种项下的要求。样品的浓度取决于实验的要求及仪器的类型,测定非主要成分时需要更高的浓度。供试液的体积取决于样品管的大小及仪器的要求,通常样品溶液的高度应达到线圈高度的2倍以上。选用符合定量要求的核磁管,常用外径为5mm或10mm,长度为15cm或20cm的核磁管。当样品量较少时可选用微量核磁管。

11.3.3 测定

将样品管放入谱仪中,先进行样品和谱仪的调谐,再仔细对谱仪匀场,使谱仪达到最佳工作状态。设置合适的实验参数,采样,完成后再进行图谱处理,并分段积分。

同一个实验通常可同时得到定性和定量数据。对于核磁共振定量分析,实验参数的正确设置非常重要,以保证每个峰的积分面积与质子数成正比。必须保证有足够长的弛豫时间,以使所有激发核都能完全弛豫,因而定量分析通常需要更长的实验时间。

11.3.4 定性和定量分析

核磁共振波谱分析可广泛应用于结构确证,热力学、动力学和反应机理的研究,以及用于定量分析。

11.3.4.1 1.定性分析

核磁共振波谱是一个非常有用的结构解析工具,化学位移提供原子核环境信息,谱峰多重性提供相邻基团情况以及立体化学信息,偶合常数值大小可用于确定基团的取代情况,谱峰强度(或积分面积)可确定基团中质子的个数等。一些特定技术,如双共振实验、化学交换、使用位移试剂、各种二维谱等,可用于简化复杂图谱、确定特征基团以及确定偶合关系等。

对于结构简单的样品可直接通过氢谱的化学位移值、偶合情况(偶合裂分的峰数及偶合常数)及每组信号的质子数来确定,或通过与文献值(图谱)比较确定样品的结构,以及是否存在杂质等。与文献值(图谱)比较时,需要注意一些重要的实验条件,如溶剂种类、样品浓度、化学位移参照物、测定温度等的影响。对于结构复杂或结构未知的样品,通常需要结合其他分析手段,如质谱等方能确定其结构。

11.3.4.2 2.定量分析

与其他核相比,1H核磁共振波谱更适用于定量分析。在合适的实验条件下,两个信号的积分面积(或强度)正比于产生这些信号的质子数:

式中A1、A2为相应信号的积分面积(或强度);N1、N2为相应信号的总质子数。

如果两个信号来源于同一分子中不同的官能团,式(1)可简化为:

式中,n1、n2分别为相应官能团中的质子数。如果两个信号来源于不同的化合物,则

式中m1、m2分别为化合物1和化合物2的分子个数;W1、W2分别为其质量;

M1、M2分别为其分子量。

由式(2)和(3)可知,核磁共振波谱定量分析可采用绝对定量和相对定量两种模式。

在绝对定量模式下,将已精密称定重量的样品和内标混合配制溶液,测定,通过比较样品特征峰的峰面积与内标峰的峰面积计算样品的含量(纯度)。合适的内标应满足如下要求:有合适的特征参考峰,最好是适宜宽度的单峰;内标物的特征参考峰与样品峰分离;能溶于分析溶剂中;其质子是等权重的;内标物的分子量与特征参考峰质子数之比合理;不与待测样品相互作用等。常用的内标物有:1,2,4,5-四氯苯1,4-二硝基苯、对苯二酚、对苯二酸、苯甲酸苄酯、顺丁烯二酸等。内标物的选择依据样品性质而定。

相对定量模式主要用于测定样品中杂质的相对含量(或混合物中各成分相对含量),由式(3)来计算。

式中Wr为内标物的重量;

As和Ar分别为供试品特征峰和内标峰的平均峰面积;

Es和Er分别为供试品和内标物的质子当量重量(质量)(以分子量除以特征峰的质子数计算得到)。

11.3.4.2.1 (2)相对定量模式

由下式计算供试品中各组分的摩尔百分比:式中A1和A2分别为各品种项下所规定的各特征基团共振峰的平均峰面积;n1、n2分别为各特征基团的质子数。

12 参考资料

  1. ^ [1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版:第三增补本[M].北京:中国医药科技出版社,2010.
  2. ^ [2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版:第一增补本[M].北京:中国医药科技出版社,2010.
  3. ^ [3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版:第二增补本[M].北京:中国医药科技出版社,2010.

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