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ΦX174

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1 概述

大肠杆菌噬菌体肠杆菌噬菌体ΦX174由环状单链+DNA和一个蛋白质衣壳构成的小20面体病毒,属于微小噬菌体科微小噬菌体属。肠杆菌噬菌体ΦX174基因组小,成熟噬菌体结构简单,是研究DNA复制基因表达、DNA-蛋白质和蛋白质-蛋白质相互作用以及形态建成的很好系统

2 中文名称

ΦX174

3 英文名称

Enterobacteria phage 肠杆菌噬菌体ΦX174;肠杆菌噬菌体ΦX174

4 分类类型

5 分类

微小噬菌体科>微小噬菌体属>ΦX174

6 GeneBank编号

[J02482]

7 大ΦX174的结构和生活循环

大ΦX174编码11个基因产物,其中四个参与成熟病毒的衣壳结构,这四种蛋白分别为F、G、J和H蛋白。衣壳由F、G和J蛋白各60个拷贝与H蛋白的12个拷贝组成。噬菌体结构的基本模型是一个由60个gpF以20面体对称(12个F五邻体)排列衣壳,内含单链DNA和gpJ。由gpG五邻体和gpH组成12个突出的刺突,排列在20面体的顶点。

大ΦX174基因组编码9个主要基因,分别是A、B、C、D、E、F、G、H和J基因,成熟噬菌体蛋白质外壳由gpF(主要衣壳蛋白)、gpG(主要刺突蛋白)、gpH(次要刺突蛋白)和gpJ(内部蛋白组成。蛋白衣壳前体(前头)由gpF、gpG、gpH和非结构蛋白gpB及gpD组成,gpA是一个位点特异的、链特异的内切酶,gpE对噬菌体在细胞发育需要,但控制细胞裂解需要这个蛋白。除了上面9个基本基因之外,还存在A*基因和K基因,A*基因在A基因中发现,负责关闭DNA的复制。噬菌体合成不需要gpK,它可能刺激噬菌体的产生。

早期研究显示,基因A区编码A和A*两个基因,A区的翻译在同一阅读框的两个不同位点起始,翻译产物大的是A蛋白,小的是A*蛋白。后来的研究结果揭示,基因B完全在基因A内编码,只是阅读方式不同,可能有两种翻译方式。基因A区域通过一种翻译方式合成A蛋白和A*蛋白,以另一种翻译方式合成B蛋白。基因E也位于基因D的编码序列内。大ΦX174有11个蛋白质基因,但只转录成3个mRNA功能相关的基因组织在一起,并转录在同一个mRNA中;基因组的DNA分子绝大多数用来编码蛋白,不翻译的部分仅占4%;基因排列上最显著的特点是重叠基因和基因内基因,这是首次发现的基因重叠现象。

大ΦX174感染大肠杆菌通过三个起始阶段,依次为附着、隐蔽和DNA进入,它吸附到细胞表面的脂多糖受体,由于DNA的释放而造成衣壳隐蔽,然后DNA导入宿主细胞内。导航蛋白gpH与病毒DAN一起转移到细胞内,直接结合到一个特异的膜位点,在宿主细胞的整个生命周期内,病毒DNA要经过三个DNA复制期。复制的第一阶段,单链DNA在这个特异的膜位点转换成复制型(RF)DNA,,这一过程至少需要13种宿主蛋白质,而不需要噬菌体编码的蛋白。第二阶段RF DNA半保留复制,由参与第一阶段的蛋白质,加上大肠杆菌的rep蛋白和噬菌体的gpA蛋白共同完成。gpA蛋白在病毒链(正链)的ori位点切割,结合在5‘端,这样RF DNA才能继续其后的复制。第三阶段是从RF-gpA复合体合成病毒环状DNA,这一过程与成熟噬菌体的形成紧密结合,需要病毒编码的gpA、gpB、gpC、gpD、gpF、gpG、gpH、gpJ及宿主的DNA聚合酶III全酶和rep蛋白。前头是衣壳的前体,由gpF、gpG、gpH和gpJ蛋白装配而成。RF-gpA复合体与前头结合形成一个复制装置(50S复合体),gpC控制第二阶段复制转换成DNA包装到前头。病毒DNA通过滚环模式在50S复合体中复制,置换的病毒链包装到前头,gpJ与置换病毒链一起掺入到前头,通过特定的机制,gpB从复制复合物中除去。gpA在ori切割病毒链,连接两个末端形成一个包装的环状基因组。这个阶段的产物是RF-gpA复合体,是132S的具感染性颗粒,当gpD从132S颗粒除去时,形成稳定的肠杆菌噬菌体ΦX174噬菌体。

8 肠杆菌噬菌体ΦX174噬菌体基因组的转录

在肠杆菌噬菌体ΦX174噬菌体系统,转录随之翻译贯穿整个噬菌体感染期。它不像在复杂噬菌体看到的那样,没有从一类基因转换到另一类基因的开关,也没有证据表明,肠杆菌噬菌体ΦX174感染后宿主转录和翻译装置发生改变和修饰。尽管在噬菌体的发育中,宿主系统趋于被抑制,但没有关闭宿主的转录,宿主的转录在感染后继续进行。

体内肠杆菌噬菌体ΦX174噬菌体的mRNA完全从互补链(复制形式的负链)转录,因而mRNA的序列与病毒DNA(正链)序列一致,没有发现反信息。这些结果可在体外用RF DNA和RNA聚合酶构建的转录系统中重复。

在体外转录系统中发现,一些启动子紧邻着基因A(PA)、基因B(PB)和基因D(PD)的起始处。肠杆菌噬菌体ΦX174噬菌体DNA有4个可能的终止位点,其中两个位点(T1和T3)只有在终止因子rho存在时起作用,另两个位点在体外终止时与rho因子无关。显然,肠杆菌噬菌体ΦX174噬菌体缺少复杂的调节机制,没有正调节和负调节机制,而是启动子和终止子位点沿基因组排列,有效的终止可作为简单的控制机制。

肠杆菌噬菌体ΦX174噬菌体DNA的复制 肠杆菌噬菌体ΦX174噬菌体DNA的复制可分为三个阶段,第一阶段是将病毒环状单链DNA转变成共价闭合超螺旋DNA(RF1),尽管这种转换发生在细胞膜部分,但需要gpH蛋白。在体外重构的可溶系统不需要细胞膜部分和gpH蛋白。体外系统完全依赖宿主酶系统,全过程可分为预引发(组装印发体)、引发(形成RNA引物)、延伸(合成病毒DNA链)、填补间隙(出去RNA引物,形成RF2 DNA)、连接(形成共价闭合RF4 DNA)和超螺旋(形成RF1 DNA)等六个步骤。在预引发步骤中,一组预引发蛋白和引发酶在病毒DNA特异位点组装形成引发体,引发体是沿病毒DNA合成RNA时可移动的机器,合成的RNA引物为DNA聚合酶III提供了起始位点。通过RNA引物延伸3’端,在病毒DNA模板上合成合成互补链,经过这种反应所得到的产物是一种具有5’端RNA引物的开环双螺旋DNA。5’→3’核酸外切酶除去5’末端的RNA引物,DNA聚合酶I填补留下来的缺口和空隙,DNA连接酶连接形成共价闭合双螺旋DNA(RFIV),再由DNA促旋酶引入负扭转,产生RFI DNA。这套程序已用纯化组分在实验室完成。

肠杆菌噬菌体ΦX174噬菌DNA体复制复制的第二节段是RFIDNA的半保留复制。体外实验结果表明,RF复制可分为病毒链合成和互补链合成,病毒链合成通过滚环机制进行,而互补链的合成基本上与第一节段的DNA合成相同。

病毒DNA在噬菌体复制的第三阶段中不对称合成,这与肠杆菌噬菌体ΦX174噬菌体形态发生途径紧密相连。DNA合成需噬菌体结构基因F、G、H和J,还需要基因B、D、C和A的功能,肠杆菌噬菌体ΦX174噬菌体环状DNA包装到衣壳需要伴随合成病毒DNA。以前的体内研究表明,DNA合成和噬菌体形态简称偶联发生在一种特异的中间体结构内,其中滚环中间体DNA与噬菌体衣壳前体(前头)相联。

9 肠杆菌噬菌体ΦX174噬菌体的装配

肠杆菌噬菌体ΦX174噬菌体的装配包括衣壳装配和DNA链包装。噬菌体起始形态发生需经过两个独立的途径,分别为前头装配和合成DNA前起始复合体形成,前起始体由RFIIDNA、病毒gpA、gpC和宿主细胞rep蛋白或DNA解旋酶组成。两个途径汇合形成50S复合体,在此合成单链DNA,伴随包装到前头。现已至少鉴定出5个装配中间体,首先发现的形态发生中间体是9S和6S颗粒,它们分别是外壳和刺突蛋白的五邻体。9S和6S颗粒结合在一起形成12S颗粒,这一反应依赖内部支架蛋白gpB的存在。12S颗粒可以是循环反应之外的产物,但它具有真正形态发生中间体结合的特性。在外支架蛋白gpD的帮助下,12个12S颗粒与240个外支架蛋白结合形成前衣壳或180S颗粒。在前衣壳中,240个外支架蛋白D形成外壳,而60个拷贝的B蛋白占据内部位置。前衣壳装配之后,合成的单链DNA病毒基因组与DNA结合蛋白、gpJ一起包装。DNA包装起始之后,gpB蛋白从前衣壳分离出来,产生前病毒颗粒或132S颗粒。132S颗粒仍含有外支架蛋白gpD,其后除去外支架蛋白D,产生成熟的具感染性病毒颗粒。

形态发生的最后阶段同时涉及合成和包装单链病毒基因组。肠杆菌噬菌体ΦX174噬菌体DNA合成的第二阶段和第三阶段需要宿主细胞的rep蛋白,但分离的大肠杆菌rep突变体(gro87和gro89)特异性的抑制第三阶段DNA合成。突变体rep蛋白可能影响50S的形成和稳定性。

病毒DNA链包装到前头需病毒编码的gpJ蛋白,gpJ首先结合RF DNA模板,然后在包装期间与病毒DNA链一起直接进入前头。gpJ结合阻止依赖SSB的第二阶段DNA合成,一旦这种复合体中加入前头,DNA合成又开始,这说明gpJ和前头直接相互作用。在噬菌体形成期间,gpH和gpJ可能发生相互作用,gpH在肠杆菌噬菌体ΦX174噬菌体复制叉中起重要作用,因为gpH和gpJ都位于复制叉,在复制第三阶段包装单链DNA。

J蛋白由37个氨基酸残基组成,其中12个为碱性残基,没有酸性残基,碱性残基在蛋白质的N端集中成两簇,两簇间为富含脯氨酸区。蛋白C端的疏水区在所有微小噬菌体中都保守,它可能参与DNA的包装。对J蛋白的功能研究结果显示,J蛋白与DNA的结合机制主要是电荷-电荷相互作用介导。脯氨酸是在这个片段发挥其有效功能的关键。

相关文献

开放分类:生物学病毒
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  • 评论总管
    2018/12/12 18:20:08 | #0
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本页最后修订于 2014年3月10日 星期一 11:03:34 (GMT+08:00)
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